Evaluación de métodos fenotípicos para la detección de metalobetalactamasas en aislados clínicos de Pseudomonas aeruginosa

Assessment of Phenotypic Methods for Metalobetalactamase Detection in Clinical Isolates of Pseudomonas aeruginosa

Armindo José Perozo Mena¹, Maribel Josefina Castellano González², Tutaya Chávez Kathyuska³, Eliana Ling Toledo⁴, Nailet Arraiz⁵

¹ Escuela de Bioanálisis. Facultad de Medicina. Universidad del Zulia. Centro de Referencia Bacteriológica. Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo. Dirección Postal: Edificio Ciencia y Salud, Planta Baja Laboratorio de Bacteriología. Maracaibo-Venezuela aperozomena@cantv.net; aperozomena@interlink.net.ve.

² Escuela de Bioanálisis. Facultad de Medicina. Universidad del Zulia. Maracaibo-Venezuela maribelcast@interlink.net.ve; maribeljo@cantv.net.

^{3, 4} Centro de Referencia Bacteriológica. Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo. Maracaibo-Venezuela

⁵ Escuela de Bioanálisis. Facultad de Medicina. Universidad del Zulia. Laboratorio de Biología Molecular. Centro de Investigaciones Endocrino Metabólicas Dr. Feliz Gómez. Maracaibo-Venezuela

Resumen

Pseudomonas aeruginosa es considerado uno de los patógenos nosocomiales más importantes, siendo común su aislamiento en pacientes de unidades de cuidados intensivos, en quienes además suele presentar multirresistencia, esto limita enormemente las opciones terapéuticas para el tratamiento del paciente, lo que constituye un problema ya que no se disponen de drogas efectivas para el tratamiento. El presente trabajo tiene como objetivo evaluar cuatro métodos fenotípicos para la detección de metalo-beta-lactamasas (método de sinergia del doble disco con EDTA, método del disco combinado de imipenem y meropenem con EDTA, método de E-Test-MBL y el método de Hodge modificado), con un método de referencia (PCR), para determinar el método fenotípico o combinación de estos que sea más valido y seguro para su implementación en los laboratorios de bacteriología de rutina. La sensibilidad y especificidad de los métodos fenotípicos empleados fue buena (más de 90%), de los métodos empleados, el test de Hodge modificado fue el que proporcionó mejores resultados en la detección de aislados de P. aeruginosa productores de MBL (menor tasa de falsos positivos y negativos), al analizar los diferentes métodos combinados para determinar cuál es la asociación con mayor sensibilidad y especificidad, el método del doble disco asociado con el test de Hodge modificado reunieron estas características, estos resultados sugieren que estos dos métodos se deben emplear de rutina en un laboratorio de Bacteriología, por ser fáciles de realizar, económicos, sensibles y específicos.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa is considered one of the most important nosocomial pathogens. Its isolation is commonin intensive care unit patients who also usually have multi-resistance. This greatly limits therapeutic options, since no effective drugs are available for treatment. The study aims to evaluate four phenotypic methods for detecting metallo-beta-lactamases. The double disc synergy with EDTA method, combined imipenem and meropenem disk with EDTA method, the E-Test-MBL method and the modified Hodge method, along with a reference method (PCR), are used to determine the phenotypic method or a combination of these is used that is more valid and safe for implementation in routine bacteriology laboratories. The sensitivity and specificity of the phenotypic methods used was good (over 90%); the modified Hodge test obtained the best results in detecting MBL-producing P. aeruginosa isolates (lower rate of false positive and negative). On analyzing the different combined methods for determining the association with greater sensitivity and specificity, the double disc method associated with the modified Hodge test met these characteristics. Results suggest that these two methods should be routinely used in a bacteriology laboratory, since they are easy to perform, sensitive, specific and economical.

Key words: P. aeruginosa, metalo-beta-lactamase, detection, MBL, bla_IMP, bla_VIM.

Recibido: 07-10-13 / Aceptado: 21-11-13

Introducción

Pseudomonas aeruginosa es un microorganismo que ha sido aislado de múltiples ambientes y superficies, así como de individuos sanos como parte de la microflora normal (1, 2). Es considerado un patógeno primariamente nosocomial, siendo común su aislamiento en pacientes de Unidades de Cuidados Intensivos, en quienes además presenta una marcada multiresistencia, que incrementa la mortalidad asociada (2-4).

Su papel ecológico como eficaz patógeno oportunista radica en la supervivencia durante largos períodos de tiempo en fómites con escasas fuentes alimenticias como aires acondicionados, ventiladores, soluciones de limpieza, jabones líquidos, agua, antisépticos y equipos médicos como fibrobroncoscopios (5, 6). Estos mínimos requerimientos nutricionales, se complementan con una alta resistencia intrínseca a los agentes antimicrobianos, esta se debe a la baja permeabilidad de su membrana externa, acoplada con mecanismos de resistencia secundarios como bombas de eflujo activo de antibióticos y cefalosporinasas inducibles, los cuales toman ventaja de esta baja permeabilidad, por lo que, pequeños cambios en la susceptibilidad a un antibiótico pueden resultar en un incremento de la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) de la droga a un nivel superior al alcanzado de manera terapéutica, lo que resulta en la resistencia del microorganismo a ese antibiótico (7).

El tratamiento de las infecciones causadas por este agente suele ser difícil, ya que además de su amplia resistencia natural, P. aeruginosa puede adquirir mecanismos de resistencia para prácticamente la totalidad de los antimicrobianos disponibles para su tratamiento (8, 9). En respuesta a esto, es cada vez más frecuente y necesario en las instituciones hospitalarias el empleo de los carbapenemas, lo que ha complicado aún más el panorama, ya que, el uso de estos antimicrobianos trae consigo la selección de resistencia, debido a la producción de enzimas carbapenemasas (10, 11), por lo que en la actualidad ha aumentado el número de cepas de P. aeruginosa productoras de estas enzimas, lo que deja prácticamente al paciente sin opciones terapéuticas, ya que la presencia de este mecanismo de resistencia inhabilita el uso de todos los antibióticos del grupo de los betalactámicos.

Las MBL de P. aeruginosa representan varios grupos: IMP, VIM, SPM, GIM y SIM; de ellos los de mayor importancia son IMP y VIM (12, 13). Estas MBL son transferibles puesto que su gran mayoría se encuentran en genes cassettes localizados principalmente en integrones tipo 1 y, en algunas ocasiones, se han encontrado en plásmidos o transposones. De esta manera se asocian a otros genes de resistencia ubicados en los mismos genes casetes lo cual les confiere a las cepas portadoras, resistencia a múltiples antibióticos.

Para la detección de metalo-betalactamasas (MBL) en cepas de P. aeruginosa el método de referencia lo constituye la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), esta prueba es capaz de detectar los genes responsables de este mecanismo de resistencia, sin embargo, la mayoría de los laboratorios de bacteriología clínica de rutina no poseen la capacidad para realizar estas pruebas moleculares. Existen pocos métodos fenotípicos para la detección de MBL en cepas de P. aeruginosa (15), adicionalmente se conoce poco acerca de la sensibilidad y especificidad de estos, por lo que este estudio pretende probar los diferentes métodos fenotípicos disponibles y compararlos con la prueba de referencia (PCR), para determinar cuál de los métodos, o combinación de métodos, pueden utilizarse de manera segura y efectiva en un laboratorio de bacteriología de rutina, permitiendo entonces la detección de este importante mecanismo de resistencia, lo que repercutirá directamente en el beneficio del paciente y la comunidad.

Materiales y Métodos

En este estudio se analizaron 294 cepas de P. aeruginosa aisladas de los cultivos de rutina practicados con fines diagnósticos a los pacientes que asisten al Centro de Referencia Bacteriológica del Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo (CRB-SAHUM).

Aislamiento e Identificación de cepas de P. aeruginosa

El aislamiento e identificación de las cepas de P. aeruginosa a partir de las diferentes muestras clínicas fue realizado por el personal del CRB-SAHUM, para ello se utilizaron las técnicas de aislamiento convencionales descritas en el Manual de Microbiología Clínica (16), para la identificación se utilizó el equipo automatizado VITEK 2C (Biomerieux®) y las tarjetas de identificación para Gram negativos GN; estas tarjetas permiten la identificación de la mayor parte de los bacilos Gram negativos de interés clínico en un tiempo máximo de 7 horas.

Detección Fenotípica de la Producción de MBL

En la actualidad, no existe estandarización ni consenso sobre el tipo de técnicas más eficaces para la detección fenotípica de las cepas productoras de MBL, por lo que una vez identificadas las cepas de P. aeruginosa, fueron sometidas a cuatro pruebas fenotípicas individuales para determinar la producción de MBL; método del doble disco con EDTA (DD), método del disco combinado con EDTA (DC), método de E-Test MBL (ET) y el test de Hodge modificado (HM).

Detección de MBL por el Método del Doble Disco con EDTA (DD)

Este método fue descrito por Arawaka y cols. (15), y se basa en que las MBL necesitan como cofactor en la reacción iones metálicos como el Zn⁺², el EDTA es un agente quelante que posee la capacidad de atrapar estos iones metálicos y por consiguiente de inhibir la acción de la enzima, por lo que en esta prueba se utiliza el EDTA como inhibidor de MBL. La prueba se realizó utilizando una placa de agar Müeller-Hinton (MH), esta placa es sembrada con un inóculo estandarizado (0,5 McFarland) y se colocaron los discos de antibióticos, en este caso se colocó un disco de papel Whatman Nº 6 con un diámetro de 6mm en la placa y se impregnó con 10µl de EDTA (0,5M pH 8,0), para obtener una concentración final en el disco de 750µg/ml de EDTA, luego se colocó a cada lado del disco de EDTA un disco de imipenem y meropenem respectivamente, a una distancia de 15 mm centro-centro, se incubó a 35ºC de 18 a 24 horas en aerobiosis, luego de la incubación, se realizó la lectura de la prueba, esta se consideró positiva cuando se observó una ampliación o distorsión (efecto sinérgico) entre los discos de imipenem y meropenem y el disco de EDTA (Figura 1).

Detección de MBL por el Método del Disco Combinado con EDTA (DC)

Este método fue descrito inicialmente por Yong y cols. (17), se basa también en la capacidad del EDTA de inhibir a las MBL, pero a diferencia del método del doble disco, en este se utiliza un disco de antibiótico que adicionalmente posee EDTA (750µg). Para esta prueba se inoculó una placa de agar MH con una suspensión estandarizada del microorganismo (como se realizó en el método anterior), luego se colocaron dos discos de imipenem (10µg), a uno de los discos se le colocaron 10µl de EDTA, posteriormente se incubó a 35ºC de 18 a 24h, para la lectura, se compararon los tamaños de los halos de inhibición entre los discos de imipenem e imipenem/EDTA, si la diferencia de tamaño entre el disco de imipenem y el disco de imipenem/EDTA resultó 7mm, se consideró la prueba positiva, es decir, la cepa es productora de MBL (Figura 2).

Detección de MBL por el Método E-test-MBL®

El método E-Test-MBL fue descrito y evaluado por Walsh y cols. (18), también se basa en la capacidad del EDTA como agente inhibidor de MBL. Este método utiliza tiras de material plástico no poroso, impregnadas con dos gradientes predefinidos, de un lado contiene imipenem en concentraciones que van de 4-256µg/ml, mientras que del otro posee una combinación de imipenem en concentraciones que van desde 1-64µg/ml, además de niveles constantes de EDTA. Al igual que en los métodos anteriores se preparó una suspensión bacteriana y se inoculó la superficie de una placa de agar de MH, seguidamente, se colocó la tira de E-test_MBL con ayuda de una pinza estéril, se incubó a 35°C, en aerobiosis, por 18-24h, para la lectura de la prueba, se tomó en cuenta el punto donde la zona de inhibición corta la escala numérica de la tira de E-test, lo que corresponde a la CIM. Para la interpretación de los resultados, se calculó la razón de dividir la CIM de IPM entre la CIM obtenida por IPM/EDTA, si esta razón es ³8, o si la diferencia de las CIM es ³3 diluciones, la prueba se consideró positiva (Figura 3).

Test de Hodge Modificado para la Detección de MBL

Este método fue descrito inicialmente por Hodge y cols. (19), para detectar la presencia de penicilinasas en cepas de Neisseria gonorrhoeae, este método detecta la presencia de una enzima inactivadora de antibióticos en la cepa estudiada, la especificidad del método para distinguir distintos tipos de betalactamasas está dada por el antibiótico que se utilice. Lee y cols. (20), modificaron el método original cambiando el microorganismo indicador y el antibiótico probado, haciendo que la prueba sea bastante sensible para la detección de MBL.

La prueba se realizó inoculando la superficie de una placa de agar MH, con una suspensión de colonias de un cultivo dé joven Escherichia coli ATCC 25922, ajustada al estándar 0,5 de la escala de McFarland, luego se colocó un disco de imipenem (10ug) en el centro de la placa, posteriormente, se realizó una estría desde el borde del disco hacia la periferia de la placa para cada cepa de P. aeruginosa sospechosa de la producción de carbapenemasas, se colocó un máximo de cuatros aislados en placas de petri de 90mm. Las placas se incubaron en atmósfera aerobia por 18-24h a 35°C. La presencia de una zona de distorsión del halo de inhibición alrededor de la estría del microorganismo probado fue interpretada como positiva para la producción de MBL por el método de Hodge modificado (Figura 4). Para el control de calidad de los cuatro métodos fenotípicos, se utilizó una cepa de P. aeruginosa productora de MBL como control positivo (P. aeruginosa CRB 3256-08) y una no productora de MBL como control negativo (P. aeruginosa ATCC 27853).

Detección Genotípica de la Producción de MBL

La técnica que se utilizó como estándar de referencia para comparar la sensibilidad y especificidad de los métodos fenotípicos fue la PCR. Esta prueba es altamente sensible y específica, detecta de manera directa la presencia de los genes productores de MBL y no su expresión como lo hacen los métodos fenotípicos. De los diferentes genes que codifican la producción de MBL, solo se investigaron bla_IMP y bla_VIM, ya que estos son los que codifican la mayor parte de las MBL reportadas en la literatura (3,10, 21-30).

La extracción del ADN del microorganismo se realizó utilizando un método de lisis alcalina de extracción rápida (31), para la amplificación de los genes bla_VIM Y bla_IMP, se utilizaron los primers oligonucleótidos descritos por Woodford y cols. (32). Se prepararon 50µl de mezcla de reacción, conteniendo 1µM de cada primer, 200 µm de cada deoxinucleotido trifosfato, Buffer de reacción 1X, 1,5mM de Mg₂Cl, 2,5U de Go-Taq polimerasa (Promega), y 25 ng del ADN molde. La amplificación se realizó en un termociclador MJ-Research PTC-100, se realizó una desnaturalización inicial a 94°C por 2 minutos, luego 30 ciclos de amplificación de la siguiente manera: desnaturalización a 94°C por 1 minuto, anillamiento a 55°C por 1 minuto y extensión del ADN a 72°C por 1,5 minutos, después del último ciclo los productos fueron conservados a 4°C. La detección de amplificados se realizó mediante una electroforesis con gel de agarosa al 1% en TBE 0,5x. Se corrió la electroforesis con 80 voltios por 1 hora o hasta que el frente de avance de las muestras llegó al final del gel, luego se tiñó el gel con bromuro de etidio (1µg/mL) durante 30 minutos. Una vez teñido, para la detección de amplificados se visualizó sobre un transiluminador ultravioleta. La reacción de amplificación para bla_IMP se consideró positiva al observar una banda única de 587pb. La reacción de amplificación para bla_VIM se considera positiva al observar una banda única de 261pb. La sensibilidad y especificidad de los primers fue evaluada con cepas controles que poseen el mecanismo de resistencia plenamente identificado, P. aeruginosa ATCC 27853 como control negativo no productor de MBL, P. aeruginosa CRB-55642-09 cepa productora de bla_VIM y P. aeruginosa CRB-25698-09 cepa productora de bla_IMP.

Análisis Estadístico

Para la validación de los métodos fenotípicos en comparación al PCR se calculó la Sensibilidad y Especificidad de cada método y de los métodos combinados (33,34). Se utilizó un intervalo de confianza del 95% para el cálculo.

Resultados

Se analizó un total de 294 aislados clínicos de Pseudomonas aeruginosa. Del total de cepas analizadas 104 fueron positivas mediante PCR para el gen bla_IMP, ninguno de los aislados amplificó con el gen bla_VIM.

La Tabla 1 muestra los resultados de los métodos fenotípicos empleados con respecto a la prueba de PCR. La Tabla 2 muestra la sensibilidad y especificidad de cada método fenotípico al comparase con el PCR; mientras que la Tabla 3 muestra la sensibilidad y especificidad de los diferentes métodos fenotípicos combinados, al compararse con la técnica de referencia.

Tabla 1.

Tabla 2.

Sensibilidad y Especificidad de cada método fenotípico comparado con el PCR.

Tabla 3.

Sensibilidad y Especificidad de los diferentes métodos fenotípicos combinados al compararse con el PCR.

Discusión

Al comparar los resultados de los métodos utilizados se puede concluir que hubo una alta concordancia entre los métodos fenotípicos empleados, ya que todos caracterizaron de manera similar a los aislados de P. aeruginosa como productores o no de MBL, cuando se compara con el método de Referencia (PCR).

El 96,15% de los aislados de P. aeruginosa confirmados como productores de MBL por PCR fue detectado por el método del DD, DC y ET, mientras que el 3,85% de las cepas productoras de MBL fueron negativas por estos métodos, por lo que se consideraron resultados falso negativos. El HM detectó el 98,08% de las cepas productoras de MBL y solo aportó 1,92% de resultados falsos negativos (aislados PCR positivo HM negativo), por lo que fue la prueba que obtuvo los mejores resultados en la detección del mecanismo de resistencia.

Por otra parte, 5,26% de los aislados negativos por PCR dieron positivos para los métodos del DD y DC, mientras que solo 3,15% resultaron positivos por los métodos de ET y HM, por lo que estos resultados se consideran falsos positivos. El desempeño del ET y el HM fue superior y generó una menor proporción de resultados falsos positivos.

Galani y col. (35) reportan un 99% de sensibilidad y un 91,9% para la detección de MBL utilizando el método del DC, por lo que lo recomiendan como método de rutina para la detección de cepas productoras de MBL. Por otra parte Guevara y col. (36), en Venezuela también reportan una buena sensibilidad y especificidad (superior al 95%), utilizando discos de IPM con Ácido Etilendiamíntetracetico y Tioglicolato de Sodio (EDTA/SMA). Mientras que Lee y col. (37), reportan una sensibilidad y especificidad del 100% para el método del doble disco con IPM/EDTA.

Una mayor proporción de cepas de P. aeruginosa dieron positivo el HM, es decir, este método detectó mayor cantidad de cepas que el resto de los métodos empleados, esto puede deberse principalmente a que el HM detecta la presencia de cualquier mecanismo enzimático de resistencia, mientras que el resto de los métodos empleados solo detectan la presencia de MBL. En el HM, la especificidad del método está dada por el antibiótico utilizado como sustrato en la prueba, en este caso IPM, por lo que el método detecta la presencia de enzimas que hidrolizan a los carbapenemas, es decir, carbapenemasas; en nuestro medio, la resistencia a carbapenemas en Pseudomonas spp. se debe principalmente a la producción de MBL (38), sin embargo existen otras carbapenemasas no MBL que pueden conferir resistencia a los carbapenemas como por ejemplo KPC, SME y NDM-1 entre otras, estos mecanismos enzimáticos de resistencia pueden ser detectados por el HM pero no por el resto de los métodos, lo que explicaría la posible diferencia existente entre los métodos utilizados. Sin embargo, es importante destacar que la frecuencia de carbapenemasas diferentes a MBL en aislados de Pseudomonas es baja, por lo que no se ve comprometida la especificidad del método.

Al analizar los resultados de la combinación de métodos fenotípicos buscando elevar la sensibilidad y especificidad, se observa que la combinación de los métodos DD+DC; DD+ET; DC+ET obtuvo una sensibilidad del 96,15% y una especificidad del 94,74%, mientras que las combinaciones DD-HM; DC+HM; ET+HM; DD+DC+ET; DD+DC+ HM; DC+ET+HM; DD+DC+ ET+HM tienen una sensibilidad del 98,08% y una especificidad del 94,74% (Tabla 3).

Diferentes autores recomiendan el DD y el HM para la detección de MBL en aislados de Pseudomonas spp. (20, 36, 37, 39), este estudio demuestra que estos métodos son una buena recomendación para laboratorios de rutina donde los métodos moleculares no están disponibles (39, 40). La utilización de ambos métodos permite detectar de manera adecuada la producción de MBL en aislados de Pseudomonas spp., incluso permite la detección de carbapenemasas no MBL en estas cepas, lo que resulta útil en el laboratorio para dirigir de manera óptima la terapéutica aplicada a los pacientes, así como, la activación rápida de los programas de control de infecciones nosocomiales, para de esta manera evitar la diseminación de la resistencia.

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