EFECTO DE LA CONCANAVALINA A EN EL CULTIVO DEL FITOPATÓGENO Ustilago maydis
Elsa Saavedra Hernández, Alma Pérez Santiago, Eduardo Pérez Campos y Félix Córdoba Alva
Elsa Saavedra Hernández. Maestra en Ciencias en Ingeniería Bioquímica y Candidata al Doctorado, Instituto Tecnológico de Oaxaca (ITO), México.
Alma Pérez Santiago. Maestra en Ciencias en Ingeniería Bioquímica y Candidata al Doctorado, ITO, México. Profesora Investigadora, Unidad de Bioquímica e Inmunología, ITO, México. e-mail: almado@2prodigy.net.mx
Eduardo Pérez Campos. Médico Cirujano y Doctor en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Investigador, Unidad de Bioquímica e Inmunología, ITO, México. e-mail: perez-campos@infosel.net.mx
Félix Córdoba Alva. Médico, UNAM. Doctor en Bioquímica, Instituto Politécnico Nacional, México. Investigador, Unidad de Bioquímica e Inmunología, ITO, UNAM, México. Dirección: Av. Ing. Víctor Bravo Ahuja Nº125 Esq. Calzada Tecnológico Oaxaca, Oax. 68030, México. e-mail: coralva@prodigy.net.mx
Resumen
El efecto de la adición de la lectina Concanavalina A al cultivo del hongo Ustilago maydis es examinado para contribuir al entendimiento de los mecanismos de reconocimiento e infección entre hongos y plantas. La cinética de crecimiento del hongo en cultivo mostró que la adición de Con A tiene un discreto efecto activador sobre las basidiosporas a partir de las 9h de incubación. Por otra parte, la unión de Con A a las basidiosporas causó diversos cambios morfológicos, agregación, múltiples ramificaciones y una incrementada capacidad de gemación. La unión de Con A a las basidiosporas fue evidenciada utilizando un conjugado fluorescente de la lectina (Alexa-flúor), observándose mayor intensidad de fluorescencia en las puntas y zonas de gemación de las basidiosporas, lo que sugiere la distribución heterógena de estructuras sacarídicas (receptores) sobre la superficie de la pared celular del hongo durante el crecimiento. Los efectos de la adición de Con A en el cultivo del hongo se inhiben al incubar previamente la lectina con a-manopiranosa.
Summary
]]> The effect of Concanavalin A on Ustilago maydis cultures was tested in order to gain understanding about plant-fungi infection mechanisms. Growth kinetics of U. maydis in culture indicates that Con A promoted discrete culture growth after 9h of incubation, as compared with fungi cultures devoid of the lectin. Binding of Con A to basidial cells induced morphological changes such as agglutination, branching, ramification and increased budding. The use of a fluorescent conjugate of the lectin (Alexa-fluor) revealed points of increased fluorescence on the basidial cell tips and budding zones, suggesting a heterogeneous distribution of receptors on the cell wall surface during growth. The addition of a-D-methyl mannopyranoside to these preparations occluded the specific fluorescence.Resumo
O efeito da adição da lectina Concanavalina A ao cultivo do fungo Ustilago maydis é examinado para contribuir ao entendimento dos mecanismos de reconhecimento e infecção entre fungos e plantas. A cinética de crescimento do fungo em cultivo mostrou que a adição de Con A tem um discreto efeito ativador sobre os basidiósporos a partir das 9h de incubação. Por outra parte, a união de Con A aos basidiósporos causou diversas mudanças morfológicas, agregação, múltiplas ramificações e uma incrementada capacidade de gemação. A união de Con A aos basidiósporos foi evidenciada utilizando um conjugado fluorescente da lectina (Alexa-flúor), observando-se maior intensidade de fluorescência nas pontas e zonas de gemação dos basidiósporos, o que sugere a distribuição heterogênea de estruturas sacarídeas (receptores) sobre a superfície da parede celular do fungo durante o crescimento. Os efeitos da adição de Con A no cultivo do fungo se inibem ao incubar previamente a lectina com a-manopiranosa.
PALABRAS CLAVE / Concanavalina A / Lectina / Ustilago maydis /
Recibido: 18/09/2002. Modificado: 24/01/2003. Aceptado: 14/03/2003
Introducción
Las lectinas son proteínas de amplia distribución en animales y vegetales, distintas a las inmunoglobulinas, y capaces de reconocimiento y unión específica reversible a residuos de carbohidratos pertenecientes a azúcares complejos sin alterar la estructura de los ligandos glicosídicos mismos (Eichmann et al., 1976; Etzler, 1985). Han sido encontradas en un gran número de especies de plantas abarcando la mayoría de los grupos taxonómicos. Esta amplia distribución sugiere que las lectinas juegan algún papel biológico fundamental en la planta, aunque la discusión sobre este punto continúa (Greenwood et al., 1986; Peumans y Van Damme, 1995, 1996).
Numerosos estudios han demostrado la interacción de lectinas de plantas con diversos microorganismos, la localización de la lectina en los posibles sitios de infección de la planta, y los efectos de las lectinas sobre los microorganismos fitopatógenos (Holliday, 1974; García, 1982; Van Parijs et al., 1992). Algunos trabajos han presentado evidencias de la interacción de las lectinas con hongos en plantas; por ejemplo se ha reportado como un potente inhibidor del crecimiento fúngico in vitro a la lectina de Urtica dioica, la cual reduce notoriamente el crecimiento micelial de Botrytis cinerea, Collectotrichum lindemuthianum, Phoma betae, Phycomyces blakesleeanus, Septoria nodorum, Trichoderma hamatum y T. viride (Broekaert et al. 1989; Van Parijs et al. 1992). Además, según Christiansen (1963) las lectinas de soya y cacahuate disminuyen la germinación de esporas e inhiben el crecimiento de Aspergillus ochraceus. Se ha demostrado, usando conjugados de aglutinina de germen de trigo con isotiocianato de fluoresceína, que la lectina se une a ápices hifales y septos de T. viride (Van Parijs et al. 1992).
Pérez et al. (2000) reportaron que algunas lectinas vegetales de distinta especificidad inducen modificaciones sobre el crecimiento in vitro de Ustilago maydis (DC.) Cda. Entre estas lectinas se encuentran las de germen de trigo, Phaseolus lunatus, Dolichos biflorus y coleoptilo de maíz, las que muestran efectos de inhibición sobre la germinación de teliosporas y el crecimiento micelial de U. maydis. Contrariamente, la lectina Concanavalina A parece activar la germinación de las teliosporas y el crecimiento de U. maydis.
U. maydis es un hongo comestible que afecta exclusivamente al maíz y teocinte (Christensen, 1963; Holliday, 1974). La enfermedad que causa es conocida como el carbón común del maíz y se caracteriza por producir agallas o tumores característicos en todas las partes verdes de la planta (Agrios, 1998). Este hongo pertenece a la familia de los basidiomicetes y presenta un ciclo de vida que se divide en dos fases, una parasítica (fase dicariótica) y otra saprofítica (fase haploide). Requiere infectar la planta de maíz para completar su ciclo de vida y adopta dos diferentes estadios durante dicho ciclo. Durante el estado inicial de la infección, los tejidos de la planta presentan clorosis y desarrollan pigmentación por antocianinas. El estado posterior se caracteriza por la aparición de tumores en cuyo interior se encuentran las teliosporas formando una masa negra de aspecto polvoriento.
]]> El presente trabajo se realizó con la finalidad de intentar aclarar el mecanismo de reconocimiento hongo-planta, donde pueden participar lectinas o moléculas semejantes a la Con A.Materiales y Métodos
La lectina Concanavalina A (Con A) de Canavalia ensiformis, que muestra especificidad hacia a-manopiranosa y a-glucopiranosa, fue purificada por cromatografía de afinidad según Agrawal y Goldstein (1967) a partir de semillas de C. ensiformis cultivadas en el Instituto Tecnológico de Oaxaca.
U. maydis, hongo que se comercializa como alimento muy apreciado en México, se aisló colectando teliosporas de tumores en elotes infectados adquiridos en la localidad. Las teliosporas fueron lavadas exhaustivamente con agua estéril, inoculadas en matraces que contenían medio de cultivo papa-elote-sacarosa (10:10:1; CPES; Ulloa y Hanlin, 1985) e incubadas por 24h para que ocurriera la germinación. Transcurrido el tiempo de incubación se tomaron alícuotas de 5ml para resembrar en el mismo medio y obtener cultivos puros.
Cinética de crecimiento para U. maydis en presencia y ausencia de Con A
La Con A purificada se disolvió en un buffer fosfato (PBS) pH 7,2 conteniendo NaCl 8g/l; KCl 0,20g/l; Na2HPO4 1,15g/l; KH2PO4 0,20g/l), y la solución resultante fue esterilizada por filtración a través de un filtro de 0,45 µm, siendo luego añadida a cultivos de U. maydis. Se inocularon tres matraces con 1ml del cultivo de basidiosporas (1,8x107 células/ml) más 50ml de CPES. El primero solo contenía basidiosporas más CPES, al segundo se le añadieron 10mg de Con A en 1ml de PBS para una concentración final de 200µg/ml, y al tercero 10mg de albúmina sérica bovina (BSA) previamente filtrada para una concentración final de 200µg/ml. Se incubó en total obscuridad a 22 ±0,2ºC con agitación continua a 100rpm en una incubadora modelo 4626 (LAB-LINE Instruments, Inc.). Se tomaron alícuotas de 3ml en condiciones estériles a diferentes intervalos desde las 0h hasta las 48h, y se examinaron bajo contraste de fases en un microscopio Zeiss Axiolab equipado con condensador que permite iluminación de campo claro, contraste de fases, campo oscuro; fluorescencia con lámpara de mercurio HBO 50, y cámara automática para microfotografía MC 80 DX (Zeiss).
El crecimiento del hongo se determinó haciendo mediciones de turbidez del cultivo, para lo cual se tomaron alícuotas de 3ml del cultivo en condiciones estériles a las 0, 3, 6, 9, 18, 21, 24, 45 y 48 horas de incubación. La turbidez se midió como densidad DO405nm en un espectrofotómetro UV-Visible Cintra 5 (GBC Scientific Equipment), usando celdas con un paso de luz de 10mm (SIGMA). El espectrofotómetro fue calibrado utilizando medio de cultivo CPES.
Análisis estadístico
Se determinó la significancia estadística entre los valores de turbidez del cultivo en presencia y ausencia de Con A, aplicando la prueba pareada de Wilcoxon (Motolsky, 1995).
Cultivos para estudio microscópico
]]> Cultivos de 18h de crecimiento fueron lavados con solución NaCl al 0,9% y centrifugados en un gradiente de sacarosa 0,3M por 20min a 1000 rpm y 10ºC. El paquete obtenido se lavó dos veces con PBS pH 7,2 adicionado con 1mM de CaCl2, MnCl2 y MgCl2 y previamente filtrado a 0,45µm. Finalmente el paquete fue resuspendido en 2ml de PBS y utilizado inmediatamente.Conjugado de Concanavalina A-Alexa Fluor®
Se utilizó un conjugado fluorescente de Con A con Alexa Fluor® 488 (Molecular Probes Inc.), el cual fue disuelto en un buffer de NaHCO3 0,1M, pH 8,3 con 1mM de MnCl2 y CaCl2. La solución fue dividida en alícuotas y se mantuvo en refrigeración a 4ºC adicionado con azida de sodio en una concentración final de 2mM. El conjugado, antes de ser utilizado, se centrifugó en una microcentrífuga Eppendorf a 10000rpm por 10min a temperatura ambiente; usando el sobrenadante en los experimentos.
Marcaje de basidiosporas
Para el ensayo de la unión lectina-patógeno se incubó en total oscuridad por 30min a temperatura ambiente 400µl de una suspensión de basidiosporas previamente tratadas como se indicó, más 50µg/100µl del fluoróforo Con A-Alexa Fluor 488. Transcurrido el tiempo se lavó tres veces con PBS pH 7,2 a 1000rpm durante 1 minuto, a temperatura ambiente. El paquete obtenido se resuspendió en 100µl de PBS y se observó con microscopía de fluorescencia.
Inhibición con a-manopiranosa del marcaje de basidiosporas
Se incubó previamente 50µg/100µl del fluoróforo Con A-Alexa Fluor 488 con 100µl de solución 0,5M de su azúcar específico a-manopiranosa (Sigma) durante 30min a temperatura ambiente. Posteriormente se agregó 400µl de la suspensión de basidiosporas y se incubó en total oscuridad por 30min a temperatura ambiente. Transcurrido el tiempo se lavó tres veces con PBS pH 7,2 a 1000rpm por 1min a temperatura ambiente. El paquete obtenido se resuspendió en 100µl de PBS y se observó bajo microscopía de fluorescencia.
Resultados
Cinética de crecimiento
A partir de cultivos puros de basidiosporas se estudió la cinética de crecimiento de U. Maydis. En la Figura 1 se observa un discreto efecto activador sobre el crecimiento del cultivo de basidiosporas en presencia de Con A comparado con el cultivo sin lectina. En un conteo realizado a las 24h de incubación, se encontró un incremento celular de un 5 a 7% en el cultivo con lectina. La presencia de BSA sobre el cultivo no modificó la curva de crecimiento normal (datos no presentados). La prueba pareada de Wilkcoxon indicó una diferencia estadística significativa de P<0,03 en los cultivos que contenían Con A (Figura 1).
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Análisis microscópico de las basidiosporas en presencia de Con A
La Con A induce un efecto discreto sobre el crecimiento de cultivos de basidiosporas de U. Maydis. La interacción es más evidente al observar los cambios morfológicos que produce sobre las células. Para estos ensayos se hicieron observaciones de cultivos incubados en ausencia y presencia constante de Con A, a las 24h de incubación.
En el cultivo sin lectina las basidiosporas se apreciaron fusiformes y elipsoidales, con promedios de 2 ±0,3µ de grosor y 10 ±3µ de largo. La unión de Con A sobre la superficie celular de las basidiosporas de U. maydis, causa cambios morfológicos que se manifiestan como engrosamientos, alteración morfológica y agregación de las basidiosporas después de las 9h de incubación. En presencia de Con A, se observaron basidiosporas con promedios de 3,3 ±0,5µ de grosor y 15 ±1,5µ de largo. Las basidiosporas, que normalmente son delgadas y alargadas, se transformaron en estructuras más largas y con engrosamiento en algunas zonas que ocasionan deformaciones. Igualmente presentaron múltiples ramificaciones y mayor gemación, apreciándose también agregación celular (Figura 2).
Figura 2: Basidiosporas de U. maydis en CPES observadas a las 24h de incubación en microscopio de contraste de fases (1000X). a: Cultivo sin Con A, señalan con flechas células de tamaño normal, fusiformes y elipsolidales. b: Cultivo en presencia de Con a, Con a, se señalan con flechas células de mayor tamaño comparadas con las de cultivo sin lectina.
Observaciones microscópicas de basidiosporas con
Con A-Alexa Fluor® 488.
La unión de la lectina Con A con las basidiosporas de U. maydis, se visualizó por marcaje con el conjugado Con A-Alexa Fluor 488. Al microscopio se observaron basidiosporas teñidas de verde fluorescente débil y uniforme, siendo mayor la coloración en los extremos de gemación, donde se apreciaron puntos intensamente fluorescentes. En algunos casos la fluorescencia se encontró distribuida irregularmente, sugiriendo que el marcador puede penetrar a través de la pared celular e ingresar al interior de las basidiosporas (Figuras 3a y 3b).
Inhibición con a-manopiranosa del marcaje de basidiosporas con Con A-Alexa Fluor®
En las Figuras 4a y 4b se observa que la unión entre el fluoróforo Alexa Fluor 488 y las basidiosporas de U. maydis es totalmente inhibida al incubar previamente con su azúcar específico, la a-manopiranosa
Figura 4: Basidiosporas de U. maydis co a-Alexa Fluor 488, previamente incubada con a-metil-manosa 0,5M. a: Contraste de fases. b: Microscopia de fluorescencia (1000X). Se observa en la misma preparación la inhibición de la fluorescencia por efecto del azúcar específico.
Discusión
En investigaciones previas con U. maydis se observó que varias lectinas vegetales, como las de Triticum vulgaris, P. lunatus y D. biflorus, unas comerciales y otras preparadas en el laboratorio, tienen efecto inhibidor en el crecimiento in vitro del hongo (Pérez et al., 2000). Sin embargo, la Con A no produce inhibición como las otras lectinas y parece tener un efecto activador in vitro sobre la germinación de teliosporas y basidiosporas de U. maydis. Este efecto de la lectina es inhibido por su azúcar específico a-D-metil-manosa en una concentración de 0,2M (Pérez et al., 2000). Por tal motivo se propone que este efecto es debido a la unión de la lectina con supuestos receptores sacarídicos presentes en la superficie de la pared celular de las basidiosporas, originando cambios morfológicos y, probablemente, una activación preparatoria de las propiedades parasitarias del hongo.
La cinética de crecimiento en presencia de Con A muestra un discreto efecto activador de la lectina desde el inicio de la incubación al compararla con cultivos control sin lectina. Aparecen cambios morfológicos celulares con alargamientos y engrosamientos en las zonas de gemación y la presencia de aglutinaciones y ramificaciones en la célula. Estas observaciones son confirmadas en los experimentos de microscopía de fluorescencia, ya que tras 30min de incubación con Alexa Fluor 488 se aprecian claramente las modificaciones celulares debidas a la lectina, junto con gránulos de mayor fluorescencia en las puntas germinales de la célula. También se aprecian claramente los grupos celulares aglutinados.
Otros autores han estudiado la composición química de la pared celular de U. maydis encontrando manosa, galactosa y xilosa formando complejos estructurales (Ruiz-Herrera et al., 1996). Por tanto, estos carbohidratos pueden formar parte de los receptores superficiales presentes en el hongo que son específicos para lectinas como la Con A. Estas ideas parecen confirmarse con las fotomicrográfías tomadas con contraste de fase e iluminación fluorescente. Adicionalmente, los experimentos (Pérez et al., 2002) en que se cuantifican receptores de Con A en la superficie de las basidiosporas, apoyan las observaciones sobre la existencia de entidades moleculares distribuidas selectivamente en la superficie de las paredes celulares del hongo que reaccionan como receptores moleculares específicos captando la Con A y, probablemente, otras lectinas y ligandos de la misma especificidad manosa-glucosa (Pérez et al., 2002).
La Con A no parece ser un inductor tóxico para U. maydis, como sucede con otras varias lectinas ensayadas en situaciones semejantes, con hongos filamentosos patógenos de plantas (Barkai-Golan et al., 1978; Gibson et al., 1982; Van Parijs et al., 1992). Tampoco tiene un efecto inhibidor de los cultivos de basidiosporas de U. maydis como las lectinas probadas anteriormente en nuestro laboratorio (Pérez et al., 2002). Sin embargo, en varios experimentos no se detecta un efecto activador notable sobre el crecimiento de la población de basidiosporas en los cultivos, aunque las pruebas estadísticas indican que hay una diferencia discreta significativa entre cultivos con lectina y cultivos controles. Solamente se detecta un modesto, aunque constante, aumento de la población entre 5 a 7% (Figura 1), compatible con una falta de toxicidad de la Con A para U. maydis en las condiciones in vitro empleadas en esta investigación.
]]> Sin embargo, la ausencia de toxicidad de la Con A no se puede interpretar como que la misma es inerte en los cultivos. La unión a receptores específicos en la superficie del hongo, las aglutinaciones subsecuentes, la localización de los receptores en las puntas germinales de las basidiosporas y las evidentes modificaciones morfológicas que la Con A induce en las basidiosporas de U. maydis, parecen evidencias suficientes para sostener la idea de que la lectina modifica sustancialmente el curso normal de desarrollo del hongo in vitro, por lo menos en la etapa de basidiospora.Los resultados permiten postular la existencia de un mecanismo semejante activado en, o por, el primer contacto del hongo (esporas y/o basidiosporas) con la superficie de los tejidos (tallos, hojas o semillas) de las especies del género Zea (maíces y teocintes). Es decir, que la planta desarrolla superficialmente estructuras moleculares fijas de naturaleza y especificidad semejantes a la Con A, capaces de unirse a los receptores naturales de la especificidad manosa–glucosa que abundan en las paredes del hongo y en las puntas germinativas del mismo. Estas interacciones moleculares constituirían la señal primaria de la infección fúngica de la planta.
Para demostrar la validez de esta idea se requiere la búsqueda de tales moléculas y estructuras en la superficie de la planta de maíz, desde su germinación hasta la madurez en el elote.
Tarou et al. (2000) describen que la Con A induce vacuolización y expulsión de material celular de preparaciones de microalgas tratadas con la lectina. Esto es, que la Con A, al igual que otras lectinas agregadas a cultivos de hongos (de microalgas, en este caso), causan inhibición y daño celular. La interpretación de los datos del presente trabajo, con U. maydis, no comparten esta hipótesis catastrofista ampliada y pueden verse en un contexto más en concordancia con la evolución paralela de los organismos vivos y los mecanismos de supervivencia de las especies.
Se puede afirmar que este camino, de estudio con lectinas, parece fructífero para buscar los mecanismos moleculares esenciales en el complejo problema del parasitismo vegetal por hongos, problema de naturaleza básica y de interés agrícola directo.
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