POBLACIONES MICROBIANAS Y FERMENTACIÓN EN EL CIEGO DE CONEJOS EN CRECIMIENTO ALIMENTADOS CON INÓCULOS DE BACTERIAS CECALES
David Hernández Sánchez, Mario A. Cobos Peralta, Sergio S. González Muñoz, Ricardo Bárcena Gama, José Luis Arcos García y Felipe Gallardo López
David Hernández Sánchez. Doctor en Ciencias en Ganadería, Colegio de Postgraduados, México. Profesor Investigador, Colegio de Postgraduados, Campus Tabasco, México. Dirección: Periférico Carlos A. Molina S/N, 86500, H. Cárdenas, Tabasco, México. e-mail: sanchezd@colpos.mx
Mario A. Cobos Peralta. Ph.D. en Microbiología Ruminal, Michigan State University, EEUU. Profesor Investigador, Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, México. e-mail: cobos@colpos.mx
Sergio S. González Muñoz. Ph.D. en Nutrición de Rumiantes, University of Nebraska, EEUU. Profesor Investigador, Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, México. e-mail: sergiogabriel@colpos.mx
Ricardo Bárcena Gama. Ph.D. en Nutrición, University of Arizona, EEUU. Profesor Investigador, Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, México. e-mail: rbarcena@colpos.mx
José Luis Arcos García. Doctor en Ciencias en Ganadería y Fauna Silvestre, Colegio de Postgraduados, México. Profesor Investigador, Universidad del Mar, Oaxaca, México. e-mail: jarcos@zicatela.umar.mx
Felipe Gallardo López. Doctor en Ciencias en Ganadería, Colegio de Postgraduados, México. Profesor Investigador, Colegio de Postgraduados, Campus Tabasco, México. e-mail: felipegl@colpos.mx
Resumen
]]> Para evaluar el efecto de dos inóculos bacterianos aislados del ciego sobre la fermentación cecal de conejos en crecimiento y la digestibilidad total del alimento, se desarrolló un ensayo de crecimiento con 60 conejos de la raza Nueva Zelanda Blanco de 38 días de edad, asignados a tres tratamientos: T1= dieta comercial (testigo); T2= T1 más inóculo a base de Clostridium sordellii; T3= T1 más inóculo a base de Peptostreptococcus tetradius. Se utilizó una concentración de 75×107 bacterias×g-1MS. En la 3ª y 5ª semanas experimentales se evaluó la digestibilidad in vivo. A los 77 días de edad los animales fueron sacrificados y se colectaron muestras del apéndice cecal (AC), 13ª asa cecal (TAC) y colon distal (CD) para determinar la concentración de bacterias totales (BT) y celulolíticas (BC), pH, NH4 y ácidos grasos volátiles (AGV). No se observaron cambios (P<0,05) en el primer ensayo de digestibilidad; sin embargo, en el segundo ensayo P. tetradius incrementó (P<0,05) la digestibilidad de la materia seca (MS), fibra detergente neutro y ácido. La concentración de BC aumentó (P<0,05) en ciego y CD. El pH no fue afectado, pero el NH4 se redujo (P<0,05) con P. tetradius en el ciego. La concentración de AGV aumentó (P<0,01) en ciego con el uso de los inóculos. Los cambios en digestibilidad de MS y fibra se relacionaron con el incremento de las poblaciones microbianas en ciego y colon de conejos que recibieron inóculos bacterianos, lo cual explicó la reducción de NH4 y el incremento de AGV.Summary
In order to evaluate the effect of two bacterial inocula isolated from the cecum on cecal fermentation and total feed digestibility in growing rabbits, a growth essay was carried out with 60 New Zealand White rabbits of 38 days of age, with three treatments: T1= commercial diet (control); T2= T1 plus Clostridium sordellii inoculum; T3= T1 plus Peptostreptococcus tetradius inoculum. A concentration of 75×107 bacteria per gram of dry matter (DM) was used. In vivo digestibility was evaluated at the 3rd and 5th weeks. At 77 days of age the animals were sacrificed and samples collected from the cecal appendix (AC), 13th cecal loop (TAC) and distal colon (CD), so as to determine total bacterial concentration (BT) and cellulolitic bacteria (BC), pH, NH4 and volatile fatty acids (AGV). No changes were observed (p<0.05) in the first digestibility essay, but in the second essay P. tetradius increased (p<0.05) DM, neutral and acid detergent fiber digestibility. BC concentration increased (p<0.05) in cecum and CD. The pH was not affected but cecal NH4 was reduced (p<0.05) with P. tetradius. AVG concentration increased (p<0.01) in the cecum by the use of inocula. Changes in DM and fiber digestibility were related to the increase in microbial populations in cecum and colon of rabbits receiving bacterial inocula, which explains the reduction in NH4 and the AGV increase.
Resumo
Para avaliar o efeito de dois inóculos bacterianos isolados do cego sobre a fermentação cecal de coelhos em crescimento e a digestibilidade total do alimento, se desenvolveu um ensaio de crescimento com 60 coelhos da raça Nueva Zelanda Blanco de 38 dias de idade, destinados a três tratamentos: T1= dieta comercial (testemunha); T2= T1 mais inóculo a base de Clostridium sordellii; T3= T1 mais inóculo a base de Peptostreptococcus tetradius. Utilizou-se uma concentração de 75×107 bactérias×g-1MS. Na 3ª e 5ª semanas experimentais se avaliou a digestibilidade in vivo. Aos 77 dias de idade os animais foram sacrificados e recolheram-se amostras do apêndice cecal (AC), 13ª asa cecal (TAC) e cólon distal (CD) para determinar a concentração de bactérias totais (BT) e celulolíticas (BC), pH, NH4 e ácidos grasso voláteis (AGV). Não se observaram mudanças (P<0,05) no primeiro ensaio de digestibilidade; no entanto, no segundo ensaio P. tetradius incrementou (P<0,05) a digestibilidade da matéria seca (MS), fibra detergente neutro e ácido. A concentração de BC aumentou (P<0,05) no cego e CD. O pH não foi afetado, mas o NH4 se reduziu (P<0,05) com P. tetradius no cego. A concentração de AGV aumentou (P<0,01) no cego com o uso dos inóculos. As mudanças em digestibilidade de MS e fibra se relacionaram com o incremento das populações microbianas no cego e cólon de coelhos que receberam inóculos bacterianos, o qual explicou a redução de NH4 e o incrementou de AGV.
Palabras clave / Bacterias Cecales / Conejos en Crecimiento / Digestibilidad / Fermentación Cecal / Inóculos Bacterianos /
Recibido: 24/03/2004. Modificado: 02/07/2004. Aceptado: 14/07/2004.
Introducción
Mediante la cecotrofia el conejo cubre parte de sus requerimientos de vitaminas del complejo B, se incrementa la digestibilidad de la materia seca, proteína y fibra de la dieta, y se favorece la respuesta inmune ante enfermedades infecciosas del tubo digestivo (Lebas et al., 1998; Naranjo et al., 2002). Los cecótrofos son heces producidas en el ciego en un medio donde dominan bacterias con fermentación anaerobia.
A pesar de la importancia de la cecotrofia en los hábitos alimenticios del conejo y su repercusión en la producción, se conoce muy poco sobre las especies bacterianas involucradas y de su potencial de aplicación como inóculo alimenticio. Sin embargo, el proceso de inoculación natural mediante el consumo de cecótrofos despierta el interés de utilizar esas bacterias como inóculos alimenticios.
]]> Los cultivos microbianos comerciales, son preparaciones que contienen microbios benéficos, tales como lactobacilos y levaduras, y su administración en conejos recién destetados puede ayudar a prevenir la proliferación de bacterias patógenas y el desarrollo de diarreas, ya que el estómago de este animal alcanza su nivel de acidez a las ocho semanas de edad (Onifade et al., 1999). No obstante, el uso de cultivos microbianos comerciales no ha tenido una respuesta clara en el comportamiento productivo del conejo. Por tal motivo, el objetivo de este trabajo fue evaluar el uso de dos inóculos de bacterias aisladas del ciego, en la digestibilidad del alimento, poblaciones microbianas y fermentación cecal de conejos en crecimiento.Materiales y Métodos
El experimento se realizó en la Granja Cunícola y en los Laboratorios de Nutrición y Microbiología Aplicada a Producción Animal, del Programa de Ganadería (IREGEP) del Colegio de Postgraduados, en Montecillo, Texcoco, Estado de México, México.
Se aislaron dos especies de bacterias cecales del conejo, identificadas como Clostridium sordellii y Peptostreptococcus tetradius (Cobos et al., 2004). En cultivos puros axénicos, las bacterias fueron reproducidas para obtener inóculos liofilizados, con el propósito de utilizarlos en el alimento de conejos. Se desarrolló un ensayo de crecimiento durante 39 días (6 semanas) con 60 conejos destetados de la raza Nueva Zelanda Blanco, sin sexar, alojados en jaulas de alambre galvanizado dispuestas en batería. Se asignaron cuatro conejos por jaula, lo que constituyó la unidad experimental. La distribución de los tratamientos en las jaulas se hizo a través de un procedimiento aleatorio, sin reemplazo; los gazapos fueron identificados y distribuidos también al azar a las unidades experimentales.
A los animales se les proporcionó agua y alimento ad libitum. Se utilizó una dieta comercial (88,72% MS; 15,5% PC; 42,45% FDN; 23,9% FDA; 10% cenizas). La alimentación de los animales se hizo diariamente, mientras que las mediciones de peso y consumo de alimento se efectuaron semanalmente.
Los tratamientos fueron: T1= dieta comercial (testigo); T2= T1 más un inóculo a base de C. sordellii; T3= T1 más un inóculo a base de P. tetradius. Se proporcionó una concentración de 75x107 bacterias por g de MS del alimento. Para esto, el inóculo liofilizado fue diluido en 40ml de agua destilada estéril y asperjado sobre el alimento con el uso de atomizadores. Posteriormente, el alimento fue secado a 50ºC durante 4h.
Digestibilidad aparente
Se evaluó la digestibilidad aparente (%) de la materia seca (MS), materia orgánica (MO), proteína total (PT), fibra detergente neutro (FDN) y ácido (FDA) durante la tercera y quinta semana del experimento, mediante el método de colección total de heces (Harris, 1970).
Al finalizar el experimento, a los 39 días se sacrificaron los animales, sin ayuno, se les extrajo el ciego y se elaboraron muestras compuestas de los cuatro animales que constituían la unidad experimental. Las muestras se colectaron en forma aséptica del apéndice y 13ª asa cecal, y las heces duras fueron colectadas en la porción del colon distal. Las muestras se depositaron en frascos de plástico estériles, para hacer las siguientes mediciones:
Concentración de bacterias totales. Se estimó la concentración total de bacterias utilizando la técnica del número más probable (NMP), por medio de diluciones de 10-1 a 10-12, con tres repeticiones por dilución (Harrigan y McCance, 1979). Para esto se empleó un medio anaerobio descrito por Cobos y Yokoyama (1995; Tabla I).
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Concentración de bacterias celulolíticas. Ésta se estimó utilizando la técnica del número más probable (NMP), por medio de diluciones de 10-1 a 10-10, con tres repeticiones por dilución (Harrigan y McCance, 1979). Se empleó un medio anaerobio (Cobos y Yokoyama, 1995) similar al utilizado para bacterias totales, a excepción de glucosa, celobiosa y almidón que fueron sustituidos por una tira de papel Whatman Nº541 que proporcionó celulosa (Tabla I).
pH. Se mezcló 1g de muestra con 4ml de agua destilada, se homogeneizó con el uso de un vórtex y se midió el pH con un potenciómetro marca Orión (Modelo SA 210).
Concentración de nitrógeno amoniacal. Para la determinación del ión amonio se utilizó la técnica de McCullough (1967). Se diluyeron 5g de muestra en 5ml de agua desionizada, la muestra se homogeneizó con un vórtex, se centrifugó a 3500g x 10min, se extrajo el sobrenadante y se agregó ácido metafosfórico en una proporción 4:1 (ml de muestra:ácido metafosfórico); las muestras se conservaron en congelación a -4ºC hasta su análisis.
Concentración de ácidos grasos volátiles (AGV). Se diluyeron 5g de muestra en 5ml de agua desionizada, la muestra se homogeneizó con un vórtex, se centrifugó a 3500g x 10min, se separó el sobrenadante y se agrego ácido metafosfórico en una proporción 4:1; las muestras se conservaron en congelación a -4ºC hasta su análisis. El contenido de AGV de las muestras se estimó por cromatografía de gases (Erwin et al., 1961).
Análisis estadístico
Se empleó un diseño completamente al azar, asignando cuatro conejos por unidad experimental. Los datos fueron analizados mediante el procedimiento Proc GLM del paquete estadístico SAS (2001) y las medias de tratamientos se compararon con la prueba de Tukey. Para la variable digestibilidad in vivo se empleó el consumo promedio de alimento como covariable.
Resultados y Discusión
Los cultivos microbianos no afectaron (P>0,05) la digestibilidad de la dieta durante la tercera semana experimental (Tabla II). Sin embargo, durante la quinta semana, la degradación de MS, FDN y FDA incrementaron (P<0,05; Tabla II) con la adición de P. tetradius; así mismo, C. sordellii mejoró la digestibilidad de FDA; un incremento en la población de bacterias celulolíticas (Tabla III) pudo explicar estos resultados. La producción de factores secundarios en los inóculos (Snoeyenbos, 1989) o el potencial de degradación de celulosa de P. tetradius (Hernández, 2000), pudieron contribuir a este fin. De forma natural, la capacidad digestiva de la fibra disminuyó con el tiempo (grupo testigo; tercera vs quinta semana experimental), mientras que la adición de los cultivos microbianos mejoró esta capacidad a medida que crecieron los conejos.
A pesar de la baja contribución que puede tener el tracto digestivo del conejo en la degradación de la fibra (25 a 35% FDN), ésta es importante, sobre todo en el ciego donde ocurre el 75% de su fermentación (García et al., 2000); además la fibra contribuye en la prevención de problemas digestivos y ayuda a estabilizar la flora microbiana en la etapa postdestete (Gidenne, 2002; Gidenne et al., 2002). Bajo este esquema, es necesario un estudio más detallado para acelerar la actividad microbiana de los inóculos evaluados cuando el conejo inicie el consumo de alimento sólido.
Los cultivos bacterianos aumentaron (P<0,05; Tabla III) la concentración total de bacterias en la región del colon dístal, sin afectar las poblaciones en apéndice y 13ª asa cecal; asimismo, se incrementó (P<0,05) la concentración de bacterias celulolíticas en las tres regiones estudiadas del tubo digestivo. Resultados similares fueron observados cuando se adicionó cultivo de levadura (Williams, 1989) o de lactobacilos (Salminen et al., 1998) en el alimento de conejos en crecimiento, y se relacionó con la capacidad de los inóculos para producir factores de crecimiento microbiano (Gidenne, 1996).
El incremento de bacterias totales en el colon podría ser insignificante para el metabolismo del animal; sin embargo, a través de exclusión competitiva, cobra importancia al estabilizar la flora microbiana y evitar la proliferación de patógenos en esta región (Bennegadi et al., 2001). Hernández y Cobos (2001) encontraron diferencias en las poblaciones de bacterias celulolíticas que se desarrollan a lo largo del tubo digestivo posterior del conejo (9,0x107; 4,0x104 y 4,0x102 bacterias por g en el apéndice cecal, porción media del ciego y colon distal, respectivamente). Los presentes resultados mostraron una tendencia similar (Tabla III) cuando no se adicionaron cultivos bacterianos (T1). No obstante, el efecto de los inóculos fue evidente, al incrementar la población de bacterias celulolíticas. Su origen nativo del ciego, posiblemente influyó en estos resultados.
El pH del tubo digestivo no cambió (P>0,05; Tabla IV) por efecto de los inóculos, lo cual sugiere un mecanismo de acción distinto al de cultivos elaborados con lactobacilos, los cuales ejercen un efecto acidificante (Cheeke et al., 1989; Hoyos y Cruz, 1990). Aunque las especies C. sordellii y P. tetradius pueden producir ácido láctico en concentraciones menores (Holt et al., 1994; Joklik et al., 1997), no alteran el pH del tubo digestivo donde se desarrollan.
Los valores de pH determinados en ciego y colon fueron superiores a los reportados en la literatura (5,9 a 6,5, en ciego y 6,5 en colon; Santoma, 1989; Lebas et al., 1998). El apéndice cecal mostró una reacción alcalina, similar a los resultados obtenidos en un estudio preliminar (7,36 y 6,33, apéndice y 13ª asa cecal, respectivamente; Hernández y Cobos, 2001), explicándose por la secreción de iones bicarbonato en este segmento del ciego (Williams et al., 1961).
El cultivo microbiano a base de P. tetradius redujo (P<0,05, Tabla IV) la concentración de amonio en apéndice y 13ª asa cecal (62 y 45%; respectivamente). Pruebas preliminares demostraron que las dos bacterias poseen la enzima ureasa (Hernández, 2000) y al igual que la mayoría de las bacterias cecales, tienen alta afinidad por el amonio para sintetizar proteína microbiana (Al-Bar y Al-Aghbari, 1996). No obstante, la capacidad de P. tetradius para reducir la concentración de amonio se relacionó con un incremento en la digestión de MS, FDN y FDA, lo cual se tradujo en mayor energía disponible para la síntesis de proteína microbiana (Tabla III), congruente con lo reportado por Makkar et al. (1990) y García et al. (2000).
Los cultivos bacterianos incrementaron (P<0,05; Tabla V) la concentración de AGV en apéndice y 13ª asa cecal. Tal vez el resultado más importante fue el observado en la región de la 13ª asa cecal, donde se localiza de 40 a 50% del quimo alimenticio total (Lebas et al., 1998). En esta región, los inóculos incrementaron (P<0,01) la concentración de AGV, propiciada por un aumento de ácido acético. De igual forma, el uso de P. tetradius aumentó (P<0,01) la concentración de ácido propiónico. Los resultados obtenidos fueron explicados por el incremento en la digestibilidad de la MS, FDN, FDA y el aumento de bacterias celulolíticas. Un estudio similar (Jehl y Gidenne, 1996) relacionó la degradación de la fibra con mayor concentración de ácido acético, cuando aumenta la población bacteriana.
Los cultivos microbianos evaluados mostraron potencial para mejorar la digestibilidad del alimento y la fermentación cecal, además de incrementar las poblaciones de bacterias celulolíticas. P. tetradius mostró superioridad al mejorar la digestibilidad de MS, FDN y FDA, con relación a C. sordellii, que solamente afectó la digestión de FDA. Los cambios observados en la digestibilidad de la MS y fibra, se explican por el incremento en las poblaciones microbianas en el ciego y colon de conejos que recibieron inóculos bacterianos, traduciéndose en un incremento de compuestos energéticos y mayor síntesis de proteína microbiana.
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