Pruebas normalizadas para la evaluación de la biodegradabilidad de sustancias químicas. una revisión
Gabriela A. Vázquez-Rodríguez y Rosa Icela Beltrán-HernÁndez
Gabriela A. Vázquez-Rodríguez. Doctora en Microbiología-Biotecnología, Centre de Biotechnologie Gilbert Durand, Institut National des Sciences Apliquées de Toulouse, Francia. Profesor Investigador, Centro de Investigaciones Químicas, Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo, México. Dirección: Laboratorio de Ciencias Ambientales, Carretera Pachuca-Tulancingo km. 4.5, Ciudad Universitaria, C.P. 42076, Pachuca, Hgo., México. e-mail: gvazquez@uaeh.edu.mx
Rosa Icela Beltrán-Hernández. Doctora en Ciencias en Biotecnología, CINVESTAV-IPN, México. Profesor Investigador, Centro de Investigaciones Químicas, Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo, México. e-mail: rosa@uaeh.edu.mx
Resumen
La biodegradabilidad es una propiedad de las sustancias químicas que determina su persistencia ambiental. Diversos organismos han estandarizado métodos para la evaluación de esta propiedad, entre los que destacan, por su amplio uso a nivel internacional, las pruebas de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE). En este trabajo se presenta una descripción general de estas pruebas, y se discuten sus principales ventajas e inconvenientes. Para tal efecto, se utiliza la estructura propuesta por dicha organización, que distingue tres niveles sucesivos de ensayo: las pruebas de biodegradabilidad inmediata, de biodegradabilidad intrínseca y de simulación. La complejidad de las condiciones experimentales empleadas aumenta en el mismo orden, por lo que dicho esquema permite evaluar a bajo costo el potencial de biodegradación de cualquier molécula orgánica. En este artículo se sugieren algunas mejoras a los métodos, tales como la aplicación de modelos cinéticos para la expresión de los resultados y el uso de la sustancia de prueba como fuente de N, P o S. Se revisan en particular las pruebas de simulación, que permiten conocer el comportamiento de las sustancias en medios naturales o industriales específicos, y se destaca la importancia de normalizar nuevos métodos de simulación y de optimizar los existentes para hacerlos más accesibles a los posibles usuarios. Entre los medios naturales susceptibles de ser normalizados destacan los anóxicos en presencia de distintos aceptores externos de electrones (i.e., nitratos, sulfatos o hierro). Finalmente, se presentan aplicaciones recientes de estas pruebas, así como algunas áreas de investigación futura.
Summary
As knowledge of the biodegradability of organic compounds is essential to determine their environmental fate, several standardized biodegradability tests have been proposed by regulatory agencies. This paper presents an overview of the most commonly used standardized methods for biodegradability assessment of chemicals, those of the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). A general description is given of these tests and of their most important advantages and disadvantages. The tests presentation follows the OECD strategy, which classifies the assays in three successive levels: ready, inherent and simulation tests. Since experimental complexity increases in the same order, this strategy permits the biodegradability assessment of any organic compound in a cost-effective way. Some improvements to the tests are suggested, such as the application of kinetic models for the expression of test results and the use of the test compound as a source of N, P or S. The simulation tests, which allow the study of the behavior of chemicals in specific natural or industrial environments, are reviewed. The need of both new simulation methods and the optimization of available ones in order to extend their use is emphasized. A relevant simulation test to be standardized is the anoxic medium with external electron acceptors (i.e., nitrates, sulfates or iron). Finally, some recent applications of these tests as well as some proposals for future research in the field are presented.
Resumo
]]> A biodegradabilidade é uma propriedade das substâncias químicas que determina sua persistência ambiental. Diversos organismos tem estandardizado métodos para a avaliação desta propriedade, entre os que destacam, por seu amplo uso a nível internacional, as provas da Organização para a Cooperação e o Desenvolvimento Econômico (OCDE). Neste trabalho apresenta-se uma descrição geral destas provas, e discutem-se suas principais vantagens e inconvenientes. Para tal efeito, utiliza-se a estrutura proposta por dita organização, que distingue três níveis sucessivos de ensaios: as provas de biodegradabilidade imediata, de biodegradabilidade intrínseca e de simulação. A complexidade das condições experimentais empregadas aumenta na mesma ordem, pelo que dito esquema permite avaliar a baixo custo o potencial de biodegradação de qualquer molécula orgânica. Neste artigo se sugerem algumas melhoras aos métodos, tais como a aplicação de modelos cinéticos para a expressão dos resultados e o uso da substância de prova como fonte de N, P ou S. Revisam-se em particular as provas de simulação, que permitem conhecer o comportamento das substâncias em meios naturais ou industriais específicos, e se destaca a importância de normalizar novos métodos de simulação e de melhorar os existentes para fazê-los mais acessíveis aos possíveis usuários. Entre os meios naturais susceptíveis de ser normalizados destacam os anóxicos na presença de distintos aceptores externos de elétrons (i.e., nitratos, sulfatos ou ferro). Finalmente, se apresentam aplicações recentes destas provas, assim como algumas áreas de investigação futura.Palabras Clave / Normalización / OCDE / Pruebas de Biodegradabilidad / Sustancias Antropogénicas /
Recibido: 06/01/2004. Modificado: 23/09/2004. Aceptado: 28/09/2004.
La biodegradabilidad es un parámetro determinante en el comportamiento ambiental de las sustancias químicas y una propiedad deseable de los productos que se liberan en grandes cantidades al medio natural, tales como detergentes, pesticidas, materiales de embalaje, etc. Mediante el proceso conocido como biodegradación, los microorganismos transforman los compuestos orgánicos, la mayoría de las veces en productos menos tóxicos que los compuestos originales. La biodegradación puede ser ‘primaria’ y conducir a simples alteraciones estructurales del compuesto, o bien implicar su conversión a productos inorgánicos de bajo peso molecular y constituyentes celulares, en cuyo caso se denomina ‘biodegradación última’ o ‘mineralización’ (OCDE, 1992; Ecuación 1).
microorganismos
Compuesto orgánico + O2 ————————> CO2 + H2O + sales + biomasa (1)
La biodegradabilidad ha sido definida como la capacidad intrínseca de una sustancia a ser transformada en una estructura química más simple por vía microbiana (Ottenbrite y Albertsson, 1992). Para su evaluación se han diseñado una serie de pruebas, las cuales buscan cuantificar el grado de persistencia de estructuras químicas en ambientes naturales o industriales. Algunas de estas pruebas han sido normalizadas para garantizar que sus resultados son confiables y válidos independientemente del laboratorio en el que sean obtenidos.
En el presente trabajo se hace una revisión de los métodos para la evaluación de la biodegradabilidad que han sido normalizados o que están en proceso de normalización por parte de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE). Éstas son las pruebas de biodegradabilidad más utilizadas a nivel internacional y de ellas se deriva la mayoría de los métodos estandarizados por la Organización Internacional de Normalización (ISO), por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (US-EPA) y por la Oficina Europea de Sustancias Químicas (ECB). Así mismo, se presenta la estrategia de evaluación de la biodegradabilidad más comúnmente utilizada, las principales ventajas y limitaciones de las pruebas, así como algunas tendencias de investigación futura.
Estrategia de Evaluación de la Biodegradabilidad
En el esquema establecido por el Programa de Evaluación de Productos Químicos de la OCDE, la biodegradabilidad de una sustancia se determina utilizando tres niveles sucesivos de ensayo: las pruebas de biodegradabilidad inmediata, de biodegradabilidad intrínseca y de simulación (OCDE, 1992). En la Tabla I se muestran las pruebas que la OCDE ha propuesto para cada nivel de evaluación, así como las pruebas ISO, US-EPA y ECB correspondientes.
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Inicialmente se lleva a cabo una prueba de biodegradabilidad inmediata, con la finalidad de clasificar las moléculas en la categoría ‘fácilmente biodegradable’ con medios analíticos simples. Las condiciones experimentales de las pruebas inmediatas restringen al máximo las posibilidades de que la biodegradación suceda, razón por la cual se considera que un resultado positivo indica la biodegradabilidad de la sustancia en la mayoría de los medios naturales y de los sistemas de tratamiento (Nyholm, 1991).
Si el resultado de la prueba de biodegradabilidad inmediata es negativo, se procede a realizar una prueba intrínseca. Estas pruebas utilizan condiciones experimentales más favorables a la degradación, por lo que un resultado positivo implica que la sustancia es ‘intrínsecamente biodegradable’ bajo las condiciones empleadas, aunque no necesariamente en el medio natural. Por otra parte, un resultado negativo indica muy probablemente la persistencia ambiental de la sustancia.
Finalmente, si la sustancia mostró una biodegradabilidad mediocre en una prueba intrínseca, se llevan a cabo pruebas de simulación. Tales pruebas tienen como objetivo estudiar su comportamiento en sistemas de tratamiento o medios naturales relevantes, para lo cual debe contarse con un cierto conocimiento de la distribución de la sustancia en los diferentes compartimientos ambientales (agua, suelos, etc.). Si el resultado de la prueba de simulación pertinente es a su vez negativo, se presume que la sustancia persiste en el ambiente y que puede considerársele sujeta a restricciones en cuanto a su esquema de producción o comercialización; así mismo, suele exigirse la búsqueda de compuestos sustitutos para un cierto uso (Kaiser, 1998).
Métodos de Evaluación de la Biodegradabilidad
Las pruebas de biodegradabilidad inmediata
La OCDE ha normalizado varias pruebas de biodegradabilidad inmediata, cuyas condiciones experimentales se resumen en la Tabla II. El principio general de estas pruebas es la incubación aerobia estática, o por lote, de una cantidad reducida de biomasa en un medio mineral, a pH neutro y a una temperatura entre 20 y 25ºC. La sustancia en estudio se añade a una concentración definida, como única fuente de carbono y energía. El inóculo consiste en una población microbiana natural que no haya sido expuesta al compuesto de prueba.
Estas pruebas pueden aplicarse a una gran variedad de compuestos, debido a que se basan en el seguimiento de parámetros directos y no específicos a la molécula que se estudia, como el Carbono Orgánico Disuelto (COD), o bien de parámetros indirectos correlacionados con la mineralización de la molécula, como la Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBO) o la producción de CO2. Simultáneamente a la prueba se corren varios testigos, que aseguran que los resultados no se deben a una degradación abiótica, a la eliminación física de la molécula por adsorción, a la toxicidad de la sustancia o a una actividad deficiente del inóculo; ésta última se evalúa con moléculas de referencia fácilmente biodegradables, tales como la anilina o el acetato de sodio. Los resultados de los ensayos respirométricos se corrigen con la respiración endógena del inóculo, la cual se mide en ausencia de la sustancia de prueba.
]]> El nivel límite de biodegradación exigido por estas pruebas es una disminución del 70% cuando se monitorea el COD, y del 60% de la Demanda Teórica de O2 (ThO2) o de la Producción Teórica de CO2 (ThCO2) cuando se trata de pruebas respirométricas, valores que deben alcanzarse en un período de 28 días. ThO2 y ThCO2 se calculan a partir de la estructura química de la molécula considerando una biodegradación total de la misma (OCDE, 1992). Para un resultado positivo, y a excepción de la prueba MITI I (301 C), los niveles límite de biodegradación deben además alcanzarse en los diez días que se suceden al final de la fase de latencia, la cual se define arbitrariamente como el tiempo necesario para alcanzar una biodegradación del 10%. A este criterio se le conoce como ‘la ventana de los 10 días’. El nivel máximo de biodegradación presentado al cabo de 28 días, la duración de la fase de latencia (tL) y el tiempo de vida media (t1/2), definido como el tiempo transcurrido para obtener una biodegradación del 50%, se reportan como resultado de las pruebas. La obtención de estos parámetros está representada en la Figura 1.
La selección de una prueba se lleva a cabo considerando las propiedades fisicoquímicas de la sustancia. Los compuestos volátiles deben evaluarse en sistemas cerrados y preferiblemente mediante la concentración de O2 disuelto (i.e., prueba 301 D). La biodegradación de los compuestos poco solubles en agua no deberá cuantificarse mediante el consumo de COD (i.e., evitar las pruebas 301 A y E), mientras que deberán preferirse los ensayos respirométricos para los compuestos adsorbibles.
Sin embargo, la sola elección de un método puede afectar el resultado de la prueba. Por la reducida concentración de biomasa que estipulan, las pruebas 301 D y E proporcionan más resultados negativos, ya que frecuentemente necesitan largos períodos para que los microorganismos puedan reproducirse suficientemente. Por otra parte, dado que un resultado positivo en alguna de estas pruebas ‘restrictivas’ garantiza que el compuesto se biodegradará rápidamente, son las más indicadas para los compuestos que se encontrarán en grandes cantidades en el medio ambiente.
Se ha reportado que la cinética de biodegradación de un compuesto determinado depende de la prueba que se seleccione. Reuschenbach et al. (2003) encontraron que la anilina se biodegrada más rápidamente en la prueba 301 A, basada en el seguimiento del COD, que en la prueba 301 F y más aún que en la 301 B, basadas en el consumo de O2 y en la producción de CO2, respectivamente. La prueba 301 B mide el CO2 producido, el cual es capturado por un álcali en un dispositivo externo al recipiente en el que se lleva a cabo la biodegradación. Si éste no cuenta con aireación y agitación suficientes, se producirá una acumulación de HCO3- que modificará la cinética de biodegradación. Además, el método de cuantificación del CO2 capturado es impreciso per se, ya que éste se calcula a partir de la diferencia entre los valores de titulación del álcali del recipiente de prueba y del testigo, que son relativamente elevados.
En virtud de que la prueba 301 B no es muy confiable desde el punto de vista cinético, es recomendable que el criterio de ‘la ventana de los 10 días’ se elimine cuando se utiliza dicho método. De hecho, se ha mostrado que en el caso de surfactantes este criterio produce falsos resultados negativos (Richterich y Steber, 2001), aun cuando se utilicen otras pruebas de biodegradabilidad inmediata.
La prueba 310 (en proceso de normalización; OCDE, 2001c) fue propuesta para solventar algunas de las limitaciones de la prueba 301 B. Esta prueba, que permite probar compuestos volátiles, poco solubles en agua y adsorbibles, se lleva a cabo en recipientes cerrados, en los que se deja un volumen determinado de aire. Durante y al final de la incubación, se sacrifican botellas de réplica para determinar el C inorgánico presente en el aire o en el líquido después de añadir un ácido o una base, respectivamente. Considerando la relación de volúmenes de líquido y de aire, es posible determinar la totalidad de CO2 producido. Mediante un ensayo interlaboratorio se mostró que esta prueba es la más adecuada para la determinación de la biodegradabilidad inmediata de surfactantes (Painter et al., 2003).
Las pruebas de biodegradabilidad intrínseca
Las pruebas de biodegradabilidad intrínseca se desarrollan bajo condiciones ambientales más favorables a la biodegradación, sobre todo en lo que concierne a la duración del ensayo y al mantenimiento de una viabilidad elevada del inóculo. Lo anterior se logra mediante la adaptación previa del inóculo a la sustancia y la adición de una fuente adicional de C. A la fecha, la OCDE ha normalizado tres pruebas de biodegradabilidad intrínseca en medio aerobio: los ensayos SCAS (Semi-Continuous Activated Sludge), Zahn-Wellens y MITI II, descritos en las líneas directrices 302 A, B y C, respectivamente (Tabla III).
La prueba MITI II permite evaluar la biodegradabilidad de sustancias insolubles en agua. Sin embargo, al igual que la prueba inmediata MITI I, especifica un protocolo de preparación del inóculo sumamente complicado, que precisa la mezcla de 10 muestras naturales (i.e., suelo, agua superficial, lodos activados) y su posterior precultivo con peptona y glucosa en modo semidiscontinuo durante al menos 30 días (OCDE, 1992). Varios autores han reportado que este procedimiento, lejos de aumentar el potencial de biodegradación del inóculo, produce más resultados negativos que otras pruebas con igual concentración de biomasa (Painter, 1995).
Recientemente se propuso la prueba CONCAWE (302 D, en proceso de normalización) para la determinación de la biodegradabilidad intrínseca de productos derivados del petróleo, y en general de sustancias volátiles y poco solubles. Este ensayo utiliza la misma metodología que la prueba inmediata 310, pero a diferencia de ésta, utiliza una población microbiana mixta previamente adaptada a la sustancia de prueba y un período de incubación de 8 semanas (OCDE, 2001a). Dado que Battersby et al. (1999) encontraron que la prueba proporciona resultados con reproducibilidad semejante a la de otras pruebas inherentes, constituye una mejor alternativa que el ensayo MITI II para el estudio de la biodegradabilidad de sustancias insolubles en agua.
Las pruebas de simulación
El ensayo 303 A, que reproduce una planta de tratamiento de aguas residuales mediante lodos activados, es la prueba de simulación más utilizada. En esta prueba se determina la velocidad de remoción de la sustancia (10-20mgCOD/l), contenida en un agua residual sintética a base de peptona, en un módulo de lodos activados, compuesto básicamente de un reactor agitado con un tiempo de retención de lodos de 6 días y un decantador que separa el agua tratada. La biodegradabilidad de la sustancia se calcula a partir del COD removido en un tiempo de residencia hidráulica de 3-6 horas y considerando los resultados de una prueba testigo realizada simultáneamente sin la sustancia. Un inconveniente de la prueba es que utiliza concentraciones muy elevadas con respecto a las que suelen encontrarse en la mayoría de las plantas de tratamiento, lo que conduce a cinéticas y mecanismos de biodegradación distintos a los que suceden en la realidad. Por tal motivo, Painter (1995) sugirió realizar estas pruebas a una concentración aproximada de 10µg/l, lo cual necesita una técnica analítica específica o la sustancia marcada con 14C. La OCDE también propone una variante de esta prueba, en la cual se simula un sistema de tratamiento de aguas residuales por biomasa fija (303 B).
Pruebas de biodegradabilidad en suelos. La prueba 304 A fue normalizada por la OCDE en 1981 para determinar la biodegradabilidad intrínseca de sustancias químicas en suelos. Una versión más completa de esta prueba ha sido normalizada recientemente (307), que permite estudiar la transformación aerobia y anaerobia en suelos de compuestos para los cuales exista un método analítico de sensibilidad suficiente (OCDE, 2002a). Este ensayo implica la adición de la sustancia de prueba, la cual puede ser o no marcada radiactivamente, a muestras de suelo y su posterior incubación en un biómetro a temperatura y humedad constantes y en ausencia de luz. A diferentes períodos de incubación se realiza una extracción de las muestras y se determinan los contenidos de la sustancia de prueba y de los principales productos de degradación. Los productos volátiles deben ser colectados absorbiéndolos en los medios apropiados para su posterior cuantificación. Cuando se usa la sustancia marcada con 14C es posible medir su velocidad de mineralización mediante el 14CO2 producido. Para el estudio de las rutas de biodegradación de una sustancia es suficiente realizar la evaluación con un solo tipo de suelo por un período no mayor de 120 días. Para la determinación de velocidades de biodegradación se aconseja realizar las pruebas con al menos tres tipos de suelo diferentes en su contenido de C orgánico, pH, contenido de arcilla y concentración de biomasa; estos tipos de suelo deben ser representativos del medio receptor de la molécula que se evalúa y en este caso la duración del estudio puede alargarse hasta 6 o 12 meses.
Se ha encontrado que la adición de una sustancia fácilmente biodegradable estimula la degradación de la materia orgánica nativa del suelo, lo que se conoce con el nombre de imprimación (Alexander, 1977). El uso de sustancias marcadas al 14C permite eliminar este error, al evaluar únicamente el CO2 producto de la degradación de la sustancia.
Pruebas de biodegradabilidad en medio marino. En virtud de las particularidades del medio marino, sobre todo en lo que respecta a las características de las bacterias responsables de los procesos de biodegradación (i.e., su halotolerancia), la OCDE propone una prueba de simulación de este compartimiento ambiental (306). Esta prueba estática usa agua marina como medio e inóculo a la vez, y existe en dos variantes: el ensayo en matraz agitado que mide el consumo de COD durante 60 días, y la prueba de DBO en botella cerrada, con una duración de 28 días. Dado que se utiliza el compuesto de prueba como única fuente de C y de energía, así como una cantidad muy reducida de biomasa, frecuentemente se considera este método como una prueba de biodegradabilidad inmediata (Nyholm, 1991).
Pruebas de biodegradabilidad en sedimentos. Los sedimentos naturales son el receptáculo final de un gran número de sustancias químicas descargadas al medio acuático, principalmente de aquellas que por su hidrofobicidad se adsorben a la materia particulada. La prueba OCDE 309 (en proceso de normalización; OCDE, 2001b), diseñada para evaluar la biodegradabilidad aerobia de compuestos a bajas concentraciones (<100µg/l) en aguas superficiales, es un ensayo en matraz agitado que contempla la adición de sedimento (1g/l) para simular la interfase sedimento/agua. La biodegradación se mide mediante el monitoreo de la molécula de prueba marcada con 14C o del 14C O2 producido, o utilizando técnicas analíticas lo suficientemente sensibles, durante un máximo de 60 días. En función del medio que se pretenda estudiar, el sedimento puede caracterizarse por un elevado contenido en C orgánico (2,5-7,5%) y una textura fina (contenido de arcillas >50%), o bien por un contenido en C orgánico reducido (0,5-2,5%) y una textura gruesa (contenido de arcillas <50%).
En un ensayo más complejo (308), la OCDE propone la simulación de las diferentes condiciones que pueden prevalecer en un sistema sedimentario (OCDE, 2002b). En una de sus dos variantes, la prueba simula una columna de agua aerobia con una capa subyacente de sedimento sujeta a un gradiente de O2. En la otra variante, se simula un sistema agua-sedimento completamente anaerobio. Esta prueba permite, si se utiliza la molécula marcada con 14C , la identificación y cuantificación de los productos de transformación, así como su distribución en las fases sólida y líquida. Los sedimentos deben caracterizarse en función del pH, contenido en C orgánico, potencial redox y concentración de biomasa.
]]> Prueba de biodegradabilidad anaerobia. En estudios anteriores (OCDE, 1981) se ha encontrado que algunos ambientes anaerobios (i.e., sedimentos) están sujetos a concentraciones de contaminantes mayores que los ambientes aerobios. Aunado a lo anterior, se ha evidenciado que los microorganismos anaerobios son metabólicamente más versátiles de lo que se creía (Caldwell et al., 1998; Anderson y Lovley, 2000), lo cual ha incentivado el estudio y la aplicación de sistemas anaerobios para el tratamiento y la evaluación de la biodegradabilidad de una gran variedad de contaminantes. Para tal efecto la OCDE propuso el método 311, actualmente en proceso de normalización (OCDE, 2001d). El método consiste en incubar en recipientes herméticos, durante 60 días a 35 ±2ºC, lodos provenientes de un digestor anaerobio (1-3gSST/l; SST: sólidos suspendidos totales) en presencia de una concentración de 20 a 100mgC/l de la sustancia de prueba. La cuantificación de la presión ejercida por los gases producto de la biodegradación anaerobia (i.e., CO2 y CH4) permite calcular el grado y la velocidad de degradación de la sustancia. Como control se emplean sustancias de referencia fácilmente biodegradables, tales como fenol o benzoato de sodio. Cuando se desconoce si la sustancia es tóxica para los microorganismos anaerobios, se recomienda un control adicional en el que se adicionan la sustancia de prueba y la de referencia en la misma concentración; así mismo, cuando se trabaja con una sustancia poco soluble y se emplea un disolvente, debe incluirse un control en el que se adicionan el disolvente, el medio de cultivo y el inóculo. Este método también considera el empleo de un inóculo preadaptado a la sustancia de estudio, cuando se sospecha que ésta no es fácilmente biodegradable.El método OCDE 311 está limitado a la evaluación de un sistema metanogénico; sin embargo los microorganismos anaerobios pueden utilizar una variedad de aceptores finales de electrones (i.e., nitratos, sulfatos, Mn y Fe), los cuales están presentes en ambientes naturales y en aguas residuales industriales. Además, no puede asumirse que el potencial metabólico en un ambiente anaerobio es el mismo con los diferentes aceptores finales de electrones (Strevett et al., 2002). Por ejemplo, Hee-Sung et al. (2002), al estudiar la biodegradación de pirrolidina y piperidina en ambientes desnitrificantes, sulfatorreductores y metanogénicos, observaron una degradación completa en el ambiente desnitrificante y ninguna degradación en los otros dos ambientes después de seis meses. Otra limitante del método OCDE 311 es en relación al medio de cultivo, el cual carece de compuestos orgánicos (i.e., vitaminas y aminoácidos), los cuales pueden ser requeridos por los microorganismos anaerobios para su óptimo crecimiento (Colleran y Pender, 2002).
El Problema del Inóculo
Sin duda, el inóculo es el factor que más afecta la reproducibilidad de las pruebas de biodegradabilidad, especialmente en el caso de las pruebas inmediatas. Estas pruebas sólo hacen tres especificaciones respecto al inóculo: debe ser de origen natural, su densidad no debe ser mayor a 30mgSST/l y no debe tener contacto previo con el compuesto de prueba (OCDE, 1992). Lo anterior permite la inoculación con aguas superficiales, lodos activados, aguas residuales domésticas, lixiviados de suelo e incluso con una mezcla de éstos (Tabla II), con la única reserva de que los lodos activados se aconsejan para las pruebas con concentraciones de biomasa elevadas (301 A, B y F), y las aguas residuales para las pruebas a baja densidad microbiana (301 D y E). Por otra parte, el nivel de inoculación se especifica únicamente en términos de relación volumétrica, mientras que no se exige una verificación de la masa celular introducida al ensayo. Tal falta de control del inóculo se refleja en los resultados de las pruebas, ya que la concentración microbiana inicial define la cinética de biodegradación (Simkins y Alexander, 1984), el grado de mineralización de la sustancia (Vázquez-Rodríguez et al., 1999) y, por ende, la obtención de un resultado positivo en la prueba.
Para mitigar este problema, se ha sugerido el uso de inóculos preadaptados a la sustancia que se evalúa (Thouand et al., 1996). Por tal motivo, la prueba inmediata 310 (en proceso de normalización) contempla la utilización de inóculos preadaptados, a condición de que esto se especifique en el informe de los resultados. Una sustancia que presenta un resultado positivo en tales condiciones se considera ‘intrínsecamente biodegradable’ (OCDE, 2001c), ya que es posible que se biodegrade rápidamente sólo en los medios que reciban aportes continuos de dicha sustancia.
El control del inóculo de las pruebas de biodegradabilidad inmediata implica conciliar dos requisitos aparentemente opuestos que son la presencia de un espectro amplio de microorganismos y el ‘comportamiento reproducible’ del inóculo, al menos respecto a las moléculas de referencia positiva, lo que hasta la fecha no se ha conseguido. Aunque la variabilidad de los resultados de las pruebas inmediatas es posiblemente un reflejo de lo que sucede en el medio natural, deben conducirse más estudios que apoyen o refuten el poder predictivo de estas pruebas a escala ambiental.
Conclusiones
La normalización de las pruebas de biodegradabilidad enfrenta un problema que es inherente a cualquier intento de simulación ambiental in vitro. Cuando se pretende integrar en el laboratorio el mayor número de variables, buscando reflejar la complejidad real de los fenómenos naturales, disminuye también la posibilidad de construir métodos reproducibles y por lo tanto susceptibles de normalización. Así, las pruebas de biodegradabilidad normalizadas deben contar con metodologías experimentales simples y al mismo tiempo aproximarse lo más posible a los fenómenos que realmente suceden en la naturaleza.
No obstante, es posible cambiar ciertas prácticas que en un principio tuvieron como propósito la fácil implementación de las pruebas y que ahora limitan el uso de los datos que proporcionan. Por ejemplo, es necesario modificar la expresión de los resultados cinéticos de las pruebas (usualmente en términos de tiempo de latencia y nivel máximo de biodegradación), de modo que éstos puedan usarse en la predicción cuantitativa del comportamiento de las sustancias. La aplicación de modelos cinéticos y su validación a distintas concentraciones de la sustancia sería de gran utilidad para el análisis cuantitativo del riesgo ambiental asociado a su dispersión.
Otro aspecto importante que debe considerarse es el uso de la sustancia de prueba como única fuente de C. Lo anterior conduce a una subestimación de su potencial de degradación, ya que en el medio natural son frecuentes los procesos cometabólicos. La adición de una fuente de C fácilmente asimilable (i.e., glucosa) podría aumentar la relevancia de los resultados de las pruebas, aunque por otra parte haría indispensable el uso de una técnica analítica específica para el seguimiento de la molécula de interés.
]]> Todas las pruebas normalizadas han sido diseñadas para considerar la sustancia de prueba como fuente de C. Sin embargo, ciertos compuestos orgánicos pueden también constituir fuentes de N, P o S. Con algunas modificaciones a los métodos, sobre todo en lo que respecta al medio de cultivo, podría conocerse más acerca de la biodegradabilidad de dichos compuestos.Las pruebas de biodegradabilidad inmediata, por su simplicidad, son las más utilizadas y referenciadas en la literatura especializada. Por ello, sus principales inconvenientes ya han sido detectados y revisados, y se ha normalizado un método (310) como alternativa a la limitada prueba 301 B. Aunque han sido menos aplicadas, la situación de las pruebas inherentes es semejante. Con la normalización de la prueba CONCAWE se superarán las desventajas de la prueba MITI II, y se dispondrá de un método confiable para el ensayo de compuestos volátiles y poco solubles.
En contraste, a excepción de las pruebas 306 y 311, las pruebas de simulación implican un alto costo que limita su aplicación y por ende su optimización por parte de los usuarios. No obstante, es de importancia que se mejoren las pruebas de simulación disponibles, y que se propongan nuevos métodos que reproduzcan de manera realista, y más económica, los medios receptores de sustancias químicas. Entre los medios susceptibles de ser normalizados destacan los anaerobios en presencia de distintos aceptores finales de electrones (i.e., nitratos, sulfatos, Mn o Fe). Una mayor aplicación de las pruebas de biodegradabilidad en general, y de las de simulación en particular, contribuirá sin duda a aumentar el conocimiento acerca del comportamiento ambiental de las sustancias químicas.
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