EFECTO DE LA BIOFERTILIZACIÓN EN VIVERO DEL CACAO (Theobroma cacao L) CON Azospirillum brasilense TARRAND, KRIEG ET DÖBEREINER Y Glomus intraradices SCHENK ET SMITH

Juan F. Aguirre-Medina, Alexander Mendoza-López, Jorge Cadena-Iñiguez y Carlos H. Avendaño-Arrazate

Juan Francisco Aguirre-Medina. Ingeniero Agrónomo, Universidad de Sonora, México. Maestría y Doctorado en Botánica, Colegio de Postgraduados (COLPOS), México. Investigador Titular, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), Chiapas, México.

Alexander Mendoza-López. Ingeniero Agrónomo, Universidad Autónoma de Chiapas (UAChiapas), México. Técnico Unión Mundial para La Naturaleza, Chiapas, México.

Jorge Cadena-Iñiguez. Ingeniero Agrónomo, UAChiapas, México. Maestría y Doctorado en Botánica, COLPOS, México. Profesor Investigador, Grupo Interdisciplinario de Investigación en Sechium edule en México A.C., Texcoco, México. Dirección: Agustín Melgar 10, Col. Las Salinas, Texcoco, Estado de México, C. P. 56153 México. e-mail: jocadena@colpos.mx

Carlos Hugo Avendaño-Arrazate. Ingeniero Agrónomo, Universidad Autónoma de Chapingo, México. Maestría y Doctorado en Genética, COLPOS, México. Profesor Investigador, Grupo Interdisciplinario de Investigación en Sechium edule en México A.C., Texcoco, México.

RESUMEN

Theobroma cacao L. es una especie originaria de América y ha estado ligada al desarrollo de diversas culturas indígenas en las regiones tropicales húmedas. Su semilla se utiliza para la elaboración de alimentos, bebidas y golosinas y su demanda se ha incrementado cuando se cultiva sin agroquímicos. La nutrición de la planta mediante biofertilizantes microbianos es una alternativa para incrementar la oferta de cacao orgánico. En este trabajo se identificó el aporte de dos microsimbiontes en el desarrollo vegetal y nutrimental del cacao en dos condiciones de suelo del Soconusco, Chiapas, México, uno de ellos tratado con bromuro de metilo y otro sin tratar. Las semillas de cacao se inocularon con Azospirillum brasilense y Glomus intraradices, solos o combinados al momento de la siembra. Se registraron variables morfológicas y fisiológicas del rendimiento y el contenido de N₂, P y Ca²⁺ en el tejido vegetal cada 30 días durante seis meses. Los resultados indicaron una respuesta diferencial entre condiciones de suelo y microsimbiontes en la asignación de materia seca. Los órganos de la planta más modificados fueron la raíz y la lámina foliar. Las plantas inoculadas mostraron mayor concentración de N₂ en suelo no tratado. G. intraradices fue más efectivo en promover la incorporación de P en suelo no tratado y de Ca²⁺ en ambas condiciones del suelo.

Theobroma cacao L. originated in America and has been associated with the development of various Indian cultures in the tropical forest. Its beans are used for the production of food, beverages and sweets. The demand of cocoa cultivated without agrochemical products has increased. Plant nutrition with microbial fertilizers is an alternative for increasing its organic production. In this experiment the contribution of two micro organisms to the development and nutritive characteristics of cocoa was determined under two soil conditions, treated with methyl bromide or untreated, in the Soconusco region, Chiapas, Mexico. The cocoa beans were inoculated with Azospirillum brasilense and Glomus intraradices, alone or in combination at sowing. Morphological and physiological characters, and the N₂, P and Ca²⁺ content in the vegetal tissue were recorded every 30 days for six months. The results indicate a differential response for soil condition and micro organisms in the production of dry matter. Root and foliar lamina were the most affected organs. The inoculated plants showed a higher N₂ concentration. G. intraradices translocated more P in the untreated soil and more Ca²⁺ under either soil conditions.

RESUMO

Theobroma cacao L. é uma espécie originária de América e tem estado relacionada ao desenvolvimento de diversas culturas indígenas nas regiões tropicais úmidas. Sua semente se utiliza para a elaboração de alimentos, bebidas e guloseimas e sua demanda tem se incrementado quando se cultiva sem agroquímicos. A nutrição da planta mediante biofertilizantes microbianos é una alternativa para incrementar a oferta de cacau orgânico. Neste trabalho se identificou a contribuição de dois microsimbiontes no desenvolvimento vegetal e nutrimental do cacau sob duas condições de solo do Soconusco, Chiapas, México, um deles tratado com bromuro de metilo e o outro sem tratar. As sementes de cacau foram inoculadas com Azospirillum brasilense e Glomus intraradices, sozinhos ou combinados no momento da plantação. Registraram-se variáveis morfológicas e fisiológicas do rendimento e o conteúdo de N2, P e Ca2+ no tecido vegetal a cada 30 dias durante seis meses. Os resultados indicaram uma resposta diferencial entre condições de solo e microsimbiontes na designação de matéria seca. Os órgãos da planta mais modificados foram a raiz e a lâmina foliar. As plantas inoculadas mostraram maior concentração de N2 em solo não tratado. G. intraradices foi mais efetivo em promover a incorporação de P em solo não tratado e de Ca2+ em ambas as condições do solo.

PALABRAS CLAVE / Cacao / Componentes del Rendimiento / Contenido de N, P y Ca²⁺ /

El cacao (Theobroma cacao L.) fue domesticado por los Mayas y su fruto simbolizó riqueza, poder y origen divino. Actualmente, en México existen plantaciones cacaoteras en las que predominan los materiales tipo forastero de edad avanzada, los cuales se explotan solos o asociados con diversas especies maderables, frutales u ornamentales mediante un manejo basado en fertilizantes inorgánicos y agroquímicos. Para la renovación de estas plantaciones se requiere propagar nuevas plantas en condiciones de vivero, para lo que se hace necesario disponer de sustratos con buenos niveles de fertilidad, a fin de inducir un rápido y vigoroso desarrollo de las plantas. El uso de algunos recursos microbiológicos del suelo se postula como alternativa para nutrir por la vía biológica el cacao. La biofertilización en viveros, entendida como la inoculación microbiana a las plantas, favorece su nutrición manteniendo el equilibrio ecológico del agroecosistema (Reganold et al., 1990), y reduce costos de producción y pérdidas de plantas (Sieverding, 1989). Existen evidencias de las bondades de la asociación planta-microorganismo en diferentes cultivos, favoreciendo el incremento del rendimiento y reduciendo el uso de fertilizantes de origen sintético (Alarcón y Ferrera-Cerrato, 2000). La inoculación con micorriza arbuscular de plántulas de cafeto (Coffea arabica L.); Zasoski, 1991; Saggin et al., 1992) y cítricos (Citrus spp.; Vinayak y Bagyaraj, 1990) redujo hasta en 50% su permanencia en vivero. Los efectos benéficos de la inoculación micorrízica no se limitan a la etapa de vivero, sino que continúan en el sitio definitivo, reducen el porcentaje de mortalidad después del trasplante (Sieverding, 1989) y disminuyen los requerimientos de fertilización química de origen sintético (Siqueira et al., 1993). Con base en lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue determinar el efecto de la biofertilización con Azospirillum brasilense y Glomus intraradices en dos condiciones de suelo, evaluando el rendimiento a través del desarrollo de algunos componentes morfológicos y fisiológicos en plántulas de Theobroma cacao L., así como el contenido de N, P y Ca²⁺.

El estudio se realizó en el campo experimental Rosario Izapa, en el Soconusco, Chiapas, México, durante el verano de 2001, en condiciones de invernadero con una temperatura media máxima de 34°C y mínima de 17°C, y 85% de humedad relativa. El suelo utilizado pertenece al grupo de los andosoles mólicos, típico de la región cacaotera del Soconusco, con las siguientes características: textura migajón arenosa; 2,3% de materia orgánica; pH de 5,7; 17,0mg·kg^-1 de NO₃^-; 14,0mg·kg^-1 de NH₄⁺; 7,0mg·kg^-1 de P (Olsen) y 1893mg·kg^-1 de Ca²⁺. La mitad del suelo utilizado fue tratada con bromuro de metilo (bromurado) a razón de 1lb cada 2m^-3. Se llenaron macetas de 5l de capacidad, perforadas en la parte inferior para favorecer el drenaje, con el suelo tratado o sin tratar. Se usaron semillas de cacao (Theobroma cacao L.) procedentes de la colección del banco de germoplasma del campo experimental Rosario Izapa-INIFAP-México.

Las semillas se lavaron e impregnaron con un adherente a base de carboximetil celulosa, sobre el cual se integraron la bacteria Azospirillum brasilense Tarrand, Krieg et Döbereiner y el hongo Glomus intraradices Schenk et Smith. Se utilizaron 1×10⁹ células de A. brasilense por g de turba, y el hongo micorrizógeno fue producido en suelo estéril como sustrato con ³2000 esporas por 100g de suelo. La planta hospedante fue Allium poro, con 95% de infección en su sistema radical al momento de la cosecha. Se usó un diseño experimental completamente al azar, con ocho tratamientos que consideraron efectos simples de los inoculantes y las combinaciones de los mismos, un testigo sin inocular en las dos condiciones de suelo y cuatro repeticiones por tratamiento. La unidad experimental consistió de una maceta con dos plantas. Se realizaron seis muestreos destructivos, uno por mes, usando tres macetas de cada tratamiento. Los riegos fueron con agua destilada.

Altura, número de hojas y biomasa. La altura (cm) fue registrada cada 30 días desde la corona radical hasta la yema apical en el vástago principal de la planta y se cuantificó el número de hojas totales por planta durante cada muestreo. La biomasa se obtuvo mediante el peso (g) de los componentes fisiológicos de las plantas en báscula analítica (Ohaus) después de secado en estufa de aire forzado a 75-80°C hasta peso constante.

Área foliar. Se registró en cm² con un integrador de área foliar (LI-COR, LI 3100).

Análisis foliar. El análisis vegetal se realizó con un equipo ICP-AES para P y Ca²⁺, y el contenido de N₂ fue determinado por el método de Kjeldhal.

Únicamente para los tratamientos con G. intraradices se cuantificó el porcentaje de colonización con la técnica de Phillips y Hayman (1970), observando al microscopio óptico con objetivo de inmersión en 100 segmentos de raíz con longitud de ~1,5-1,6cm a los 150 días después de la siembra.

El análisis estadístico se realizó mediante un análisis de varianza, con el procedimiento PROC ANOVA. Posteriormente se aplicó una comparación de medias Tukey con a= 0,05 utilizando el programa SAS versión 5.0. (SAS, 1985).

La altura de la planta fue mayor en las plántulas de cacao biofertilizadas, las cuales crecieron en promedio 9cm más y produjeron cinco hojas más, cuando crecieron en el suelo sin tratar en comparación con el suelo tratado (bromurado), y las diferencias fueron más evidentes a partir de los 120 días después de la siembra (Tabla I). A los 180 días de la siembra, las plantas biofertilizadas produjeron en promedio 12,4% más materia seca, en comparación con el testigo (Tabla I). Chulan y Martin (1992), consignaron resultados semejantes con la inoculación de micorriza arbuscular en cacao. En otras plantas, la inoculación de Azospirillum y Glomus ha resultado en interacción positiva para estimular el crecimiento vegetal (Pacovsky, 1988). Diversos autores han encontrado efectos positivos de la simbiosis entre algunos cultivos perennes tales como cítricos (González-Chávez y Ferrera-Cerrato, 1996), papaya (Sánchez-Espíndola et al., 1996), aguacate (Azcón-Aguilar et al., 1992), y diversos cultivos anuales (Irizar-Garza et al., 2003). Con relación a la biomasa, la mayor asignación de materia seca a partir de 120 días fue con A. brasilense y cuando se combinó con G. intraradices (Tabla I); en cambio, las plantas inoculadas únicamente con G. intraradices produjeron menor peso seco de raíz, en comparación con los tratamientos con Azospirillum y el testigo.

En el suelo sin tratar las diferencias más contrastantes se presentaron después de los 90 días de siembra en plantas inoculadas con A. brasilense. El crecimiento de las raíces es uno de los aportes más resaltantes de los microorganismos en simbiosis con las plantas (Rovira et al., 1983). El efecto de A. brasilense en inducir mayor desarrollo radical ha sido consignado en diferentes plantas anuales cuando se inocula solo (Okon y Kapulnik 1986), o bien con la simbiosis de Azospirillum-Glomus en frijol (Andreeva et al., 1992), o Glomus-Rhizobium en Leucaena (Aguirre y Velasco, 1994). En algunas plantas anuales tales como el frijol, Aguirre y Kohashi (2002) obtuvieron el mismo resultado. Al parecer, la hifa del hongo sustituye los pelos radicales (Azcón-Aguilar y Barea, 1980); de lo contrario, se esperaría que los tratamientos con mayor sistema radical, como los inoculados con Azospirillum y el testigo, tuvieran mayor absorción de nutrientes del suelo, pero en este caso sucede lo contrario. Al respecto, Böhm (1979) advirtió que el peso seco de la raíz y su actividad no están correlacionados porque la cantidad de raíces finas que realizan la absorción es una fracción pequeña del total. Bowen et al. (1975), en cambio, confirmaron que las raíces micorrizadas incrementan el poder de absorción a través de sus hifas externas. En la presente investigación el porcentaje promedio de infección micorrízica fue del 36%.

La asignación de materia seca a la raíz y el tallo principal fue contrastante al comparar las dos condiciones del suelo. Durante el primer mes, en el suelo tratado, las plantas de cacao asignaron a la raíz en promedio el 36% del total de la materia seca, frente a 27% en el suelo sin tratar. En los muestreos subsecuentes la asignación en promedio fue de 22% a este órgano en el suelo tratado y 24% en el suelo sin tratar. Este comportamiento podría reflejar la limitación inicial en la interacción de los microsimbiontes con la raíz y su efecto en la síntesis de carbohidratos, o bien la utilización de energía para favorecer los mecanismos de reconocimiento planta-bacteria que promueven el establecimiento de la simbiosis.

Con relación al peso seco del tallo principal en las dos condiciones de suelo, la mayor asignación de materia seca fue con Glomus y cuando se combinó con Azospirillum (Tabla I). En este caso, los microsimbiontes inoculados fueron eficaces en inducir mayor crecimiento del tallo principal, efecto que según O’ Keefe y Sylvia (1992) se debe al incremento en la superficie de absorción externa que se presenta con el crecimiento del micelio.

El peso seco de la lámina foliar y del pecíolo fue superior con Glomus en el suelo tratado; mientras que, en el suelo sin tratar lo fue con Azospirillum (Tabla II). En otras plantas como Leucaena, se incrementan estos mismos componentes del rendimiento con la simbiosis Glomus-Rhizobium (Aguirre y Velasco, 1994). En relación al área foliar, las plantas biofertilizadas en el suelo sin tratar presentaron los mayores valores (Tabla II). Resultados semejantes han sido obtenidos en otras plantas micorrizadas como papaya (Sánchez-Espíndola, et al., 1996), Citrus volkameriana (González-Chávez y Ferrera-Cerrato, 1996) y en diversas leguminosas forrajeras (Aguirre et al., 1988). De los microorganismos inoculados, A. brasilense promovió la mayor área foliar y en el suelo tratado este efecto se observó con la simbiosis doble, alcanzando la mayor asignación de materia seca a la lámina foliar.

Las plantas micorrizadas promovieron mayor contenido de P en el tejido vegetal del cacao (Figura 2). Existen evidencias del transporte de P por los hongos micorrizógenos hacia la planta (Gianinazzi-Pearson y Gianinazzi, 1986; Godbold, 1999), por lo que es prudente considerar las bondades agronómicas de este proceso en el desarrollo de las plantas, especialmente en los suelos tropicales donde el P es un factor limitante (Fairhurst et al., 1999). El contenido de Ca²⁺ fue también mayor en los tratamientos biofertilizados (Figura 3). Para estos tres elementos, N₂, P y Ca²⁺, los valores más altos se obtuvieron en el suelo no tratado a partir de los 90 y 180 días de la siembra con G. intraradices. Este mismo comportamiento se observó en el suelo tratado, pero en menor proporción que el anterior; sin embargo, en la última evaluación, el tratamiento micorrizado mostró mayor contenido de Ca²⁺ en el tejido del cacao.

La biofertilización del cacao en vivero con los microorganismos utilizados, solos o combinados, favorece el desarrollo y la asignación de materia seca de los componentes morfológicos y fisiológicos del rendimiento de la planta. Los órganos con mayor efecto fueron la raíz y la lámina foliar. La respuesta del cacao a los microsimbiontes en el suelo tratado y sin tratar sugiere la interacción con otros microorganismos en la inducción de su desarrollo vegetal. La mayor respuesta de las plántulas de cacao a la biofertilización en suelo tratado, se indujo con Glomus intraradices, solo o en combinación con Azospirillum brasilense en el suelo no tratado. En general, las plantas inoculadas presentaron en el tejido vegetal los valores más altos de N₂, P y Ca²⁺ en suelo no tratado en comparación con el testigo.

1. Aguirre MJF (2004) Biofertilizantes microbianos: antecedentes del programa y resultados de validación en México. En Simposio de Biofertilizantes: La biofertilización como tecnología sostenible. Campo Experimental Río Bravo-INIFAP-México. pp. 71-86.        [ Links ]

2. Aguirre MJF, Velasco ZME (1994) Componentes morfológicos y fisiológicos del rendimiento de Leucaena leucocephala al inocularse con micorriza VA y/o Rhizobium loti. Agric. Tec. Mex. 20: 43-54.        [ Links ]

3. Aguirre MJF, Kohashi Shibata J (2002) Componentes Morfológicos y Fisiológicos del Rendimiento, Dinámica de la Colonización Micorrízica y contenido de Fósforo en Frijol Phaseolus vulgaris L. Agric. Tec. Mex. 28: 23-33.        [ Links ]

4. Aguirre MJF, Valdés M, Silvestre-Bradley R (1988) Simbiosis entre rizobios y cuatro leguminosas tropicales adaptadas en Chiapas, México. Pasturas Tropicales 10: 18-21.        [ Links ]

5. Alarcón A, Ferrera-Cerrato R (2000) Biofertilizantes: Importancia y utilización en la agricultura. Agric. Tec. Mex. 26: 191-203.        [ Links ]

6. Ames RN, Bethlenfalvay G (1987) Localized increase in nodule activity but no competitive interactions of cowpea rhizobia due to pre-establishment of vesicular-arbuscular mycorrhiza. New Phytol. 106: 207-215.        [ Links ]

7. Andreeva IN, Mandkhan K, Re’kina TV, Mishustin EN, Izmailnov SF (1992) Effect of Azospirillum brasilense on formation and nitrogen-fixing activity of bean and soybean nodules. Soviet Plant Physiol. 38: 646-651.        [ Links ]

8. Azcón-Aguilar C, Barea JM (1980) Micorrizas. Investigación y Ciencia. 47: 8-16.        [ Links ]

9. Azcón-Aguilar C, Barcelo A, Vidal MT, Delavina G (1992) Further studies on the influence of mycorrhiza on growth and development of micropropagated avocado plants. Agronomie 12: 837-840.        [ Links ]

10. Barea JM, Azcón-Aguilar C (1983) Mycorrhiza and their significance on nodulating nitrogen fixing plants. Adv. Agron. 36: 1-54.        [ Links ]

11. Böhm W (1979) Methods of Studying Root Systems. Springer. Berlín, Alemania. pp. 127-139.        [ Links ]

12. Bowen GD, Bevege DG, Mosse B (1975) Phosphate physiology of vesicular-arbuscular mycorrhizas. En Sander FE, Mosse B, Tinker PB (Eds.) Endomycorrhizas. Academic Press. Nueva York, EEUU. pp. 241-260.        [ Links ]

13. Chulan HA, Martín K (1992) The vesicular-arbuscular (V-A) mycorrhiza and its effects on growth of vegetatively propagated Theobroma cacao. Plant Soil 144: 227-233.        [ Links ]

14. Fairhurst T, Lefroy R, Mutert E, Batjes N (1999) The importance, distribution and causes of phosphorus deficiency as a constraint to crop production in the tropics. Agrofor. Forum 9: 2-8.        [ Links ]

15. Gianinazzi-Pearson V, Gianinazzi S (1986) The physiology of improved phosphorus nutrition in mycorrhizal plants. En Gianinazzi-Pearson V, Gianinazzi S (Eds.) Physiological and Genetics aspect of Mycorrhizae. INRA. París, Francia. pp 101-109.        [ Links ]

16. Godbold DL (1999) The role of mycorrhiza in phosphorus acquisition. Agrofor. Forum 9: 25-27.        [ Links ]

17. González–Chávez MC, Ferrera-Cerrato R (1996) Efecto de diferentes dosis de inoculo endomicorrízico en la dinámica de crecimiento de Citrus volkamericana. En Pérez-Moreno J, Ferrera-Cerrato R (Eds.) Agroecología y Desarrollo Sostenible. Colegio de Postgraduados. Montecillo, México. pp. 374-376.        [ Links ]

18. Irizar-Garza MBG, Vargas-Vázquez P, Garza-García D, Tut y Couoh C, Rojas-Martínez I, Trujillo-Campos A, García-Silva R, Aguirre-Montoya D, Martínez-González JC, Alvarado-Mendoza S, Grajeda-Cabrera O, Valero-Garza J, Aguirre-Medina JF (2003) Respuesta de cultivos agrícolas a los biofertilizantes en la región central de México. Agric. Tec. Mex. 29: 213-225.        [ Links ]

19. Kucey RMN, Paul EA (1982) Carbon flow photosynthesis and N₂ fixation on mycorrhizal and nodulated faba beans (Vicia faba L.). Soil Biol. Biochem. 14: 407-412.        [ Links ]

20. O´keefe DM, Sylvia DM (1992) Chronology and mechanisms of P uptake by mycorrhizal sweet potato plants. New Phytol. 122: 651-659.        [ Links ]

21. Okon Y, Kapulnik Y (1986) Development and function of Azospirillum inoculated roots. Plant Soil 90: 3-16.        [ Links ]

22. Pacovsky RS (1988) Influence of inoculation with Azospirillum brasilense and Glomus fasciculatum on sorghum nutrition. Plant Soil 110: 275-282.        [ Links ]

23. Phillips JM, Hayman DJ (1970) Improved procedures for clearing and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection. Trans. Br. Mycol. Soc. 55: 158-161.        [ Links ]

24. Reganold JP, Papendick RI, Parr JF (1990) Sustainable agriculture. Sci. Am. 262: 111-120.        [ Links ]

25. Rovira AD, Bowen GD, Foster RC (1983) The significance of rhizosphore microflora and mycorrhiza in plant nutrition. En Encyclopedia of Plants. New Series 15. Springer. Berlín, Alemania. pp. 61-95.        [ Links ]

26. Saggin OJ, Siqueira JO, Colozzi–Filho A, Oliveira E (1992) A infestação do solo com fungos micorrízicos no crescimento post-transplante de mudas de cafeiro não micorrizadas. Rev. Bras. Cienc. Solo 16: 39-46.        [ Links ]

27. Sánchez-Espindola ME, González-Chávez MC, Ferrera-Cerrato R (1996) Manejo de micorriza arbuscular en plantas de papaya. En Pérez-Moreno J, Ferrera-Cerrato R (Eds.) Agroecología y Desarrollo Sostenible. Colegio de Postgraduados. Montecillo, México. pp. 405-407.        [ Links ]

28. SAS (1985) SAS User’s Guide: Statistics. Vers. 5. SAS Institute Cary, NC, EEUU. 208 pp.        [ Links ]

29. Sieverding E (1989) Ecology of VAM fungi in tropical agrosystems. Agr. Ecosyst. Env. 29: 369-390.        [ Links ]

30. Siqueira JO, Colozzi–Filho A, Saggi OJ, Guimarães TG, Oliveira E (1993) Crescimento de mudas e produção do cafeeiro sob influencia de fungos micorrízicos e superfosfato. Rev. Bras. Cienc. Solo 17: 53-60.        [ Links ]

31. Vinayak K, Bagyaraj DJ (1990) Vesicular-arbuscular mycorrhizae screened for Troyer Citrange. Biol. Fertil. Soil. 9: 311-314.        [ Links ]

32. Zasoski RJ (1991) Effects of nitrogen sources and mycorrhizal inoculation with different species on growth and nutrient composition of young coffee seedlings. Café Cacao Thé 35: 121-129.        [ Links ] ]]> 1 2004 71-86 2 1994 20 43-54 3 2002 28 23-33 4 1988 10 18-21 5 2000 26 191-203 6 1987 106 207-215 7 1992 38 646-651 8 1980 47 8-16 9 1992 12 837-840 10 1983 36 1-54 11 1979 127-139 12 241-260 13 1992 144 227-233 14 1999 9 2-8 15 101-109 16 1999 9 25-27 17 374-376 18 2003 29 213-225 19 1982 14 407-412 20 1992 122 651-659 21 1986 90 3-16 22 1988 110 275-282 23 1970 55 158-161 24 1990 262 111-120 25 61-95 26 1992 16 39-46 27 405-407 28 SAS 1985 208 29 1989 29 369-390 30 1993 17 53-60 31 1990 9 311-314 32 1991 35 121-129