María Elena Materán, María Carolina Vega, Manuel Sánchez-Olate, Katia Sáez, Roberto Rodríguez y Darcy Ríos
María Elena Materán Oviedo. M.Sc. en Agronomía, Universidad Central de Venezuela, Venezuela. Doctora en Ciencias Forestales, Universidad de Concepción (UDEC), Chile. Profesora, Universidad Nacional Experimental de Guayana (UNEG), Venezuela. Dirección: Centro Biotecnológico de Guayana. UNEG. Av. Las Américas. Edif.. General de Seguros, Puerto Ordaz, Edo. Bolívar, Venezuela. e-mail: mmateran@uneg.edu.ve
María Carolina Vega Castro. Ingeniera Forestal, UDEC, Chile. Operadora Forestal, UDEC, Chile. e-mail: mcarolina01@hotmail.com
Manuel Eduardo Sánchez-Olate.Ingeniero Forestal y Doctor en Biología, Universidad de Oviedo (UNIOVI), España. Profesor, UDEC, Chile. e-mail: msanche@udec.cl
Katia L. Sáez C. Ingeniera Matemática y Magíster en Estadística, UDEC, Chile. Doctora en Ingeniería Eléctrica, Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro, Brasil. Directora del Departamento de Estadística, UDEC, Chile. e-mail: ksaez@udec.cl
Roberto Rodríguez Fernández. Biólogo y Doctor en Biología, UNIOVI, España. Profesor, UNIOVI, España. e-mail: rrodri@uniovi.es.
Darcy Graciela Ríos Leal. Profesora de Biología y Química, M.Sc. en Botánica y Doctora en Biología, UNIOVI, España. Profesora, UDEC, Chile. e-mail: drios@udec.cl
RESUMEN
Se evaluaron dos protocolos de asepsia, tipos de púa (yemas y braquiblastos), épocas de recolección (otoño y verano) y posición de la púa (apical y basal) en el ortet, sobre el establecimiento y consolidación de microinjertos de Pinus radiata D. Don. Las púas se obtuvieron de clones adultos cultivados en vivero. Las asepsias consistieron en la inmersión en hipoclorito de sodio 2,5% v/v i.a, durante 15min (A1); o por 20min, seguido de la inmersión en una solución de benomyl+cisteína 50mg·l-1 c/u, hasta su utilización (A2). Como patrón se utilizaron hipocótilos provenientes de semillas germinadas in vitro en medio QL sin reguladores de crecimiento. Se realizaron microinjertos según la técnica apical de cuña. Estos se mantuvieron en tubos con medio QL + 0,1 mg·l-1 AIB y 1mg·l-1 BAP, a 25 ±2°C, intensidad lumínica de 80µmol·m-2·s-1 y fotoperíodo de 16h. Se utilizó un diseño completamente al azar en arreglo factorial (24), con 13 repeticiones. El establecimiento mostró diferencias significativas entre las interacciones tipo de asepsia/época del año y tipo de púa/época del año, resultando ser las yemas apicales recolectadas durante el otoño y la asepsia tipo A2, los mejores tratamientos para el establecimiento de los microinjertos de P. radiata. La consolidación estuvo influenciada por el tipo de púa y la época del año en que se realizaron los microinjertos, siendo nuevamente la yema apical (YA) el material más reactivo.
]]> Reactivation of elite pinus radiata d. don. plant tissue by in vitro micrograftingSUMMARY
The effect of two asepsis protocols, scion type (apical shoot tips and brachyblast), gathering season (autumn and summer) and insertion position of the scion in the ortet (apical and basal) upon the micrograft establishment and consolidation of Pinus radiata D. Don. was evaluated. Scions were obtained from mature nursery cultivated clones. The asepsis consisted on the immersion in sodium hypochlorite to 2.5% v/v i.a for 15min (A1); or for 20min, followed by the immersion in a solution with benomyl+cisteyne 50mg·l-1 each, until their use (A2). Hypocotyls from seeds germinated in vitro in QL medium without growth regulators were used as rootstock grafting. Micrografting was carried out using the apical wedge technique. The micrografts were kept in tubes with QL medium + 0.1mg·l-1 AIB and 1mg·l-1 BAP at 25 ±2°C, light intensity of 80µmol·m-2·s-1 and photoperiod of 16h. A completely random design with factorial arrangement (24) was used, with 13 replications. Micrograft establishment showed significant differences in the type of interactions between asepsis/gathering season and type of scion/gathering season, turning out to be the apical shoot-tips gathered during the autumn and the A2 asepsis the best treatments for the micrograft establishment of P. radiata. The consolidation was influenced by the scion type and the time of the year when micrografting was carried out, the apical shoot tips (BA) behaving again as the most reactive material.
Reativação de material vegetal elite de pinus radiata d. Don. Mediante microenxerto in vitro
RESUMO
Avaliaram-se dois protocolos de assepsia, tipos de garfos (gemas e braquiblastos), épocas de colheita (outono e verão) e posição dos garfos (apical e basal) no ortet, sobre o estabelecimento e consolidação de microenxertos de Pinus radiata D. Don. Os garfos se obtiveram de clones adultos cultivados em viveiro. As assepsias consistiram na imersão em hipoclorito de sódio 2,5% v/v i.a, durante 15min (A1); ou por 20min, seguido da imersão em uma solução de benomyl+cisteína 50mg·l-1 c/u, até sua utilização (A2). Como padrões foram utilizados hipocótilos provenientes de sementes germinadas in vitro em meio QL sem reguladores de crescimento. Realizaram-se microenxertos segundo a técnica apical de cunha. Estes foram mantidos em tubos com meio QL + 0,1 mgl-1 AIB e 1mgl-1 BAP, a 25 ±2°C, intensidade lumínica de 80µmol·m-2·s-1 e fotoperíodo de 16h. Utilizou-se um desenho completamente aleatório em arranjo fatorial (24), com 13 repetições. O estabelecimento mostrou diferenças significativas entre as interações tipo de assepsia/época do ano e tipo de garfo/época do ano, resultando ser, as gemas apicais recolhidas durante o outono e a assepsia tipo A2, os melhores tratamentos para o estabelecimento dos microenxertos de P. radiata. A consolidação esteve influenciada pelo tipo de garfo e a época do ano em que se realizaram os microenxertos, sendo novamente a gema apical (GA) o material mais reativo.
PALABRAS CLAVE / Asepsia / Microinjerto / Micropropagación / Pinus radiata / Tipo de Púa /
Recibido: 27/06/2007. Modificado: 12/11/2007. Aceptado: 15 /11/2007
Introducción
Dentro de los programas de mejora forestal, la masificación del germoplasma mediante clonación de individuos adultos representa una alternativa ventajosa y rentable. Sin embargo, la manipulación de individuos adultos solo es posible después de procesos de revigorización in vivo o in vitro, donde la eficacia de estos últimos tratamientos dependen de la especie e incluso del clon (Bonga, 1993; Rodríguez et al., 2005).
]]> El éxito de la propagación vegetativa de especies leñosas disminuye a medida que se avanza en el cambio de fase, de juvenil a fase madura (Fraga et al., 2002), lo cual afecta la capacidad de enraizamiento del material vegetal (Salisbury y Ross 2000; Rodríguez et al., 2005). No obstante, se han señalado casos de yemas maduras cultivadas in vitro en las que se observa una regresión hacia un estado juvenil como respuesta a técnicas y condiciones de cultivo (Rodríguez et al., 2005). Por ello se han implementado métodos para inducir revigorización al material en estado fisiológico avanzado y rejuvenecimiento al material adulto que presenta un mayor desarrollo ontogénico (Fraga et al., 2002; Zapata, 2002). La revigorización in vitro podría ser una solución al enraizamiento deficiente y a la falta de vigor que muestran los brotes provenientes de árboles adultos de muchas especies leñosas (Fraga et al., 2002; Rodríguez et al., 2005).En condiciones in vitro se pueden destacar las técnicas de subcultivo seriado, microinjerto, cultivo de meristemas, cultivo de yemas adventicias y embriogénesis somática (Fraga et al., 2002; Zapata, 2002). El microinjerto permite la revigorización de yemas vegetativas ontogénicamente adultas sobre portainjertos juveniles, que se corresponde con detección de patrones proteicos característicos de individuos juveniles (Zapata, 2002). Además, tiene la capacidad potencial para inducir reversión de características fenotípicas del estado adulto a estados más juveniles, haciendo posible la recuperación de explantes, lo que facilita la manipulación de sus capacidades morfogénicas y, por lo tanto, la clonación de materiales adultos seleccionados (Huang, 1992; Fraga et al., 2002).
Se ha encontrado que la reactivación de material adulto inducida por el efecto combinado de portainjertos y medios de estimulación no es una respuesta transitoria, sino que continúa expresándose después que las yemas desarrolladas en los microinjertos son individualizadas y establecidas en medios de cultivo. La adaptación y la capacidad proliferativa son manifestaciones evidentes de la recuperación de características juveniles. En Pinus nigra, la revigorización es posible mediante el microinjerto monofásico de braquiblastos y ápices meristemáticos (Fraga et al., 2002; Rodríguez et al. 2005).
Otro de los problemas del cultivo de tejidos in vitro es la contaminación endógena, ocasionada por hongos y bacterias. Estos microorganismos, al encontrarse en el interior del tejido, en vasos conductores o espacios intercelulares, dificultan la esterilización del material vegetal. Muchos investigadores no mencionan en la descripción de sus técnicas los problemas ocasionados por la contaminación bacteriana en el desarrollo de ciertas especies vegetales cultivadas in vitro, a pesar de ser ésta la causa de numerosos fracasos (Surga y Guevara, 1994; Salazar y Romero, 1997; Salazar y Surga, 1998; Chalala et al., 2002; Ramírez et al., 2002).
En el presente trabajo se expone un protocolo y una técnica para el establecimiento in vitro de microinjertos viables, que facilite la reactivación de material vegetal adulto élite de Pinus radiata.
Materiales y Métodos
Como patrón se utilizaron portainjertos francos provenientes de semillas certificadas de Pinus radiata D. Don., almacenadas a 4ºC. Para la obtención de las plántulas, las semillas se germinaron in vitro en condiciones estériles en medio QL (Quoirin y Lepoivre, 1977) libre de reguladores de crecimiento, con los macroelementos diluidos al 25% de la concentración original. Luego de 30 días de cultivo las plántulas fueron extraídas, se eliminó la raíz a nivel del cuello, y las acículas a nivel de inserción.
Obtención de púas
Se utilizaron braquiblastos seleccionados de árboles de P. radiata de clones de seis años de edad pertenecientes al Programa de Mejoramiento Genético de las empresas forestales Fletcher Challenge (Nueva Zelanda) y Forestal Bio-Bio (Chile). Los braquiblastos tuvieron un tamaño variable entre 5 y 10mm, procedentes de la porción basal y apical del árbol donante, al igual que los ápices caulinares. Ambos tipos de púa fueron colectados durante la época de verano y la de otoño.
Las acículas de los braquiblastos fueron cortadas a 3mm de la base y se eliminaron las brácteas evitando desprender la porción caulinar. Posteriormente, en cámara de flujo laminar y con la ayuda de una lupa binocular, se eliminaron las zonas de inserción de las brácteas.
]]> Asepsia superficial de púasSe realizaron dos tratamientos de asepsia consistentes en lavado con agua potable con 200µl·l-1 de Tween 20 por 5min. Bajo cámara de flujo laminar los braquiblastos fueron sumergieron en etanol 20% v/v por 5s, seguido de un lavado con agua destilada estéril; luego se procedió a una inmersión en hipoclorito de sodio 2,5% v/v i.a más 200µl·l-1 de Tween 20 por 15min, seguido por tres lavados con agua destilada estéril por 3, 4 y 5min, respectivamente, constituyendo éste el tratamiento de asepsia A1. El tratamiento de asepsia A2 consistió en un lavado con agua de grifo potable más 200µl·l-1 de Tween 20 por 5min. Bajo cámara de flujo laminar se procedió a una inmersión en etanol diluido al 20% v/v por 10s, seguido de un lavado con agua destilada estéril. Luego se sumergieron en hipoclorito de sodio 2,5% v/v i.a. más 200µl·l-1 Tween 20 por 20min, seguido de tres lavados con agua destilada estéril por 3, 4 y 5min, respectivamente. Finalmente, los explantes fueron mantenidos hasta su utilización en una solución de benomil+cisteina 50mg·l-1 c/u, los cuales actúan como fungicida y antioxidante respectivamente.
Técnica de microinjerto
El microinjerto de braquiblastos se realizó según la técnica descrita por Pacheco (1995). Para ello los portainjertos fueron decapitados por debajo del punto de inserción de las acículas cotiledonares. A estos segmentos caulinares se les realizó un corte longitudinal de 5mm en la parte apical. Los braquiblastos usados como púa fueron escindidos transversalmente por debajo de la inserción de las acículas. En la porción basal del mismo se realizaron dos cortes en "v" de 5mm de longitud, formando una cuña que luego fue insertada dentro de la hendidura del portainjerto. Para mantener el contacto entre la púa y el portainjerto, se utilizaron anillos de silicona estériles producidos por el seccionamiento transversal de una sonda de 5mm de diámetro externo.
Para el microinjerto de ápices, se usó una modificación de la técnica de injerto lateral de yema (Pacheco, 1995). Para ello, los ápices escindidos de los braquiblastos se insertaron en una hendidura apical de 5-10mm de longitud previamente realizada sobre el portainjerto.
Los microinjertos fueron establecidos en tubos de ensayos conteniendo 15ml de medio QL colocadas a 24 ±2ºC, bajo una intensidad lumínica de 80µmol·m-2·s-1 con fotoperíodo de 16h y una humedad relativa de 60%.
Diseño estadístico
Se utilizó un diseño completamente al azar en arreglo factorial con 13 repeticiones. Se realizó un análisis de varianza de tres entradas para probar el efecto y las interacciones entre tipo de púa, tipo de asepsia y estación del año, usando el programa STATISTICA (Version 6, 2001, StatSoft, Tulsa, OK, EEUU). A todas las variables se les comprobó normalidad y homogeneidad de varianza. Las diferencias fueron consideradas estadísticamente significativas a P0,05. Cuando se detectaron diferencias significativas se realizó el test de Fisher (LSD) con =0,05. Se evaluaron los microinjertos establecidos en cultivo (%), la consolidación de la unión púa-patrón (%), y el desarrollo de púas (%).
Resultados y Discusión
Al evaluar el efecto del tipo de asepsia, posición de los braquiblastos y yemas en el ortet sobre el desarrollo del microinjerto, se observó que la estación del año en que fue tomada la púa influye en las respuestas de establecimiento, consolidación y posterior desarrollo de los microinjertos. En verano no hubo respuesta de los microinjertos, mientras que en otoño se lograron respuestas diferenciales dependiendo de la asepsia aplicada y la posición de la púa en el ortet (Tablas I y II).
]]> Aunque empleando braquiblastos se logró el establecimiento de los microinjertos en todos los casos, es en aquellos realizados con púas de origen apical donde se lograron los mayores porcentajes de establecimiento (92,3-100%), en comparación con el 30,8% de establecimiento logrado en aquellos realizados con púas colectadas desde la porción basal del ortet (Tabla I, Figura 1). Sin embargo, la tasa de establecimiento obtenida con los braquiblastos apicales, no es garantía del éxito de los microinjertos, ya que solo se logró entre 30,8 y 46,2% de consolidación de los mismos, mientras que no se obtuvo consolidación en el caso de los braquiblastos basales (Tabla I). Esto es debido a que, a mayores niveles endógenos de auxinas y citoquininas en el ortet al momento de la escisión, estos niveles hormonales hace que exista una mayor proliferación celular, generándose la formación del callo interfásico, y por tanto la unión del microinjerto, sin embargo, la elongación de púa se detiene por lo que se impide su consolidación, resultados que coinciden con lo señalado por Fraga et al. (2002) en P. radiata.
Con respecto al desarrollo de los microinjertos los resultados muestran diferencias entre braquiblastos apicales y basales (Tabla I). En braquiblastos basales no se observa desarrollo de los microinjertos tanto a los 180 como 200 días de cultivo. Cuando se utilizaron braquiblastos apicales, las respuestas mostraron relación con el tipo de asepsia utilizada, obteniéndose el mayor porcentaje de microinjertos desarrollados con los braquiblastos apicales sometidos a la asepsia A2 (Tabla I).
Por otra parte, cuando se usaron yemas como púas (Tabla II) también se observó una marcada diferencia en las respuestas de establecimiento y consolidación según la época del año en la que se tomó el material vegetal, resultando ser otoño la mejor estación. En esta época se logró el establecimiento de microinjertos en todos los tratamientos, a excepción de aquellos realizados con púas colectadas en verano. No obstante, independiente de la topófisis de las yemas, cuando se aplica la asepsia A1, el porcentaje de establecimiento fue menor (61,5-76,9%), en comparación a los valores obtenidos cuando se aplicó la asepsia A2 (92,3-100%).
A diferencia de los braquiblastos, cuando se utilizaron yemas se logró el establecimiento y consolidación de microinjertos durante el otoño en todos los tratamientos, siendo en todo caso las respuestas diferentes entre ellas (Tabla II). A los 180 días de cultivo se tuvieron microinjertos poco desarrollados en todos los tratamientos, no así después de transcurridos 200 días, cuando el mayor porcentaje de microinjertos desarrollados (50%) se obtuvo con las yemas apicales y sometidas a la asepsia A1. En ese mismo tratamiento no se observó desarrollo de microinjertos.
Por otro lado, cuando se usaron yemas apicales sometidas a asepsia A2 (Tabla II, Figura 2), se logró una gama de respuestas en cuanto al grado de desarrollo de los microinjertos, que variaron desde microinjertos no desarrollados (16,7%), microinjertos poco desarrollados (66,7%) hasta microinjertos desarrollados (16,7%).
Las diferencias indicadas se debieron posiblemente a la mayor manipulación de los braquiblastos, dado a que el tiempo de inmersión en la solución de hipoclorito de sodio causa mayor oxidación del tejido, lo que coincide con lo señalado por algunos autores en cuanto a que dosis superiores a 2% de hipoclorito de sodio, tienen un efecto tóxico en los tejidos (Ramírez y Salazar, 1997; Salazar y Romero, 1997; Ramírez et al., 2002).
]]> Ramírez et al. (2002), encontraron que en Annona muricata L. (guanábana) los menores porcentajes de explantes oxidados se obtuvieron con concentraciones de entre 0 y 1% v/v i.a de hipoclorito de sodio, con exposición de 5-10min., siendo más favorable la aplicación de 1% v/v i.a por 10min. Estos resultados son similares a los reportados por Salazar y Romero (1997), quienes señalaron que explantes de ajonjolí (Sesamun indicum L.) tienden a oxidarse por la acción del hipoclorito de sodio. De igual manera, en los experimentos de Ramírez y Salazar (1997) la exposición por >8min a hipoclorito de sodio al 5,25% i.a (v/v) produjo el oscurecimiento de los explantes de guayabo (Psidium guajaba L).En cuanto al porcentaje de establecimiento, existen diferencias estadísticamente significativas entre el tipo de púa, la época de recolección de púas y realización de los microinjertos (Figura 3a). Durante el verano no se estableció ningún microinjerto en todos los tratamientos, mientras que durante el otoño hubo diferencias entre los braquiblastos basales (31%) y el resto de púas (braquiblastos apicales, yemas apicales y basales). Aunque no existen diferencias significativas entre los tres últimos casos (73, 77 y 88%, respectivamente), en términos de valor absoluto la yema apical tiene tendencia a ser la púa con la que se logra el mayor porcentaje de establecimiento de microinjertos (Figura 3a).
Otros factores que condicionan la respuesta en el establecimiento de microinjertos son el tipo de asepsia utilizada y la época del año en que se llevan a cabo los microinjertos. Los mejores resultados se obtuvieron con la asepsia A2 en los microinjertos realizados durante el otoño (79% de establecimiento), en comparación con un 56% de microinjertos establecidos cuando se utiliza la asepsia A1 (Figura 3b). Durante el verano la respuesta es nula para el establecimiento de los microinjertos.
En cuanto a la consolidación de los microinjertos, se hallaron diferencias significativas entre la época del año y el tipo de púa utilizada (Figura 3c). Durante el verano no se observó respuesta en los tratamientos, mientras que durante el otoño el mayor porcentaje de consolidación se obtuvo con las yemas apicales (58%), seguido por los braquiblastos apicales y yemas basales, ambas con 38% de consolidación, mientras que no se obtuvo respuesta con los braquiblastos basales, comportándose este último material igual que el resto de los tratamientos realizados durante el verano.
De acuerdo a los resultados existe influencia del tipo de material vegetal usado como púa y del tipo de asepsia utilizada. Los braquiblastos resultaron ser el material más susceptible a la contaminación, mientras que las yemas resultaron ser las púas adecuadas para el establecimiento, sobre todo cuando se utilizó la asepsia A2. Esta respuesta pudo deberse a la contaminación endógena, ya que a pesar de los tratamientos de asepsia utilizados en el material vegetal, los microorganismos endógenos no pudieron ser eliminados, lo que constituyó un problema en el establecimiento in vitro del material vegetal (Pierik, 1990; Gonzales, 2003).
Los resultados analizados ponen de manifiesto que para el establecimiento y consolidación de microinjertos de material adulto sobre patrones juveniles de P. radiata, la mejor época de recolección de púas y realización de microinjertos es el otoño, siendo las yemas apicales el material vegetal más reactivo cuando son sometidas al tipo de asepsia A2. Los resultados mencionados pueden estar asociados al estado fisiológico del ortet y a los niveles hormonales endógenos al momento de la escisión del material vegetal, tal como ha sido mencionado en trabajos similares realizados en Pinus radiata (Fraga et al., 2002) y Pinus pinea (Cortizo et al., 2004).
Los trabajos que indican la contaminación, viabilidad y oxidación de los explantes durante su establecimiento in vitro son escasos y la mayoría de ellos no especifican el procedimiento de desinfección superficial empleado (Bejoy y Hariharan, 1992; Lemos y Blake, 1996). Sin embargo, se observó un alto nivel de contaminación en braquiblastos, lo que mostró que la desinfección superficial con hipoclorito de sodio del material vegetal adulto cultivado en el campo, no resultó efectiva para el control de microorganismos contaminantes (Ramírez et al., 2002). Por ello, la planta madre debe ser sometida a un pretratamiento de asepsia previo a la introducción in vitro del material vegetal. La respuesta obtenida se asemeja a la de estudios realizados en otras especies, donde se reporta 80-100% de contaminación (Viloria, 1993; Ramírez y Salazar, 1997).
El menor porcentaje de formación de callo en la zona de unión de púa y patrón se obtuvo, en general, con los braquiblastos basales, lo cual puede ser consecuencia de los mayores porcentajes de contaminación endógenos obtenidos en la púa, lo que impidió la formación de callo interfásico (Pacheco, 1995; Gonzáles, 2003). Los problemas de contaminación encontrados en los braquiblastos han sido asociados a la manipulación del material vegetal durante la preparación de los microinjertos (Gonzáles, 2003).
La viabilidad de los microinjertos se evaluó durante todo el período de crecimiento de los mismos, tomándose como criterio de viabilidad aquellos explantes que mantienen un color verde (Ramírez et al., 2002). No obstante, la menor viabilidad obtenida en los microinjertos de braquiblastos sometidos al tipo de asepsia A2 se debió fundamentalmente a la oxidación de las púas, lo que inhibió la división celular no permitiendo la formación de callo interfásico, culminando con la muerte del microinjerto (Pacheco,1995; Fraga et al., 2002).
]]> Tal como señalan Fraga et al. (2002), queda de manifiesto que el éxito de los microinjertos de materiales adultos de P. radiata está fuertemente influenciado por la manipulación de los tejidos, antes, durante y después de los procedimientos de asepsia utilizados.Conclusiones
– El tipo de púa y la época del año en que éstas sean colectadas y se realicen los microinjertos influyen en el éxito del establecimiento y consolidación de microinjertos de Pinus radiata adulto, siendo la yema apical colectada en otoño el material vegetal más reactivo.
– El tipo de asepsia y la época del año en que se colecten las púas y se realicen los microinjertos influyen en el establecimiento de microinjertos de P. radiata, donde las mejores respuestas se obtuvieron cuando los microinjertos fueron llevados a cabo en otoño y se sometieron al tipo de asepsia A2.
– Los braquiblastos basales tienden a ser las púas con mayores problemas de oxidación y contaminación, y la causa de inviabilidad de los microinjertos fue la oxidación del material vegetal.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a la Dirección de Graduados, Universidad de Concepción, Chile, al CONICYT, Chile (Proyecto MECESUP AUS 0103) y a la Universidad Nacional Experimental de Guayana, Venezuela.
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