Surfactantes biológicos en la biorremediación de aguas contaminadas con crudo liviano.

Ismenia Araujo, Antonio Gómez, Magleidy Barrera, Nancy Angulo, Gustavo Morillo, Carmen Cárdenas y Lenín Herrera

Ismenia Araujo. Licenciada en Educación, Mención Ciencias Biológicas, La Universidad del Zulia (LUZ), Venezuela. M.Sc. en Microbiología, University of Georgia, EEUU. Profesora, LUZ, Venezuela y Coordinadora, Laboratorio de Microbiología Industrial, Centro de Investigación del Agua (CIA-LUZ), Venezuela. Dirección: CIA-LUZ, Ciudad Universitaria. Núcleo Agropecuario. Lagunas de Oxidación. Código Postal 4005 - Venezuela. e-mail: ismenia_araujo@hotmail.com

Antonio Gómez. Ingeniero Químico, LUZ, Venezuela. Estudiante de Posgrado, CIA-LUZ, Venezuela.

Magleidy Barrera. Ingeniero Químico, LUZ, Venezuela. Estudiante de Posgrado, CIA-LUZ, Venezuela.

Nancy Angulo. Licenciada en Biología y Maestría en Microbiología, LUZ, Venezuela. Profesora, CIA-LUZ, Venezuela.

Gustavo Morillo. Ingeniero Agrónomo y Maestría en Ingeniería Ambiental, LUZ, Venezuela. Profesor, CIA-LUZ, Venezuela.

Carmen Cárdenas. Ingeniero Químico y Maestría en Ingeniería Ambiental, LUZ, Venezuela. Profesora, CIA-LUZ, Venezuela.

Lenín Herrera. Ingeniero Químico, LUZ, Venezuela. Maestría en Ingeniería Ambiental y Salud, The University of Texas, Austin, EEUU. Profesor, CIA-LUZ, Venezuela.

Se investigó el efecto de los biosurfactantes en la eficiencia de los procesos de recuperación de aguas contaminadas con crudo liviano. El biosurfactante utilizado fue producido a partir de cepas bacterianas (MI9 y MI10) pertenecientes al grupo de cepas del Laboratorio de Microbiología Industrial del Centro de Investigación del Agua, Universidad del Zulia, Venezuela. Para el estudio de tratabilidad, durante tres meses, además del biosurfactante utilizado, se preparó un cultivo mixto con las cepas bacterianas MI5, MI7, MI9, MI10, y MI11. Los tratamientos aplicados fueron: agua del Lago de Maracaibo, hidrocarburo, cultivo mixto y biosurfactante (ANHCB); agua del lago esterilizada, hidrocarburo y cultivo mixto (AEHC); agua del lago, hidrocarburo y cultivo mixto (ANHC); agua del lago, hidrocarburo y biosurfactante (ANHB); y agua del lago e hidrocarburo (ANH). Los análisis físico-químicos y microbiológicos permitieron determinar la eficiencia del biosurfactante y el cultivo mixto en la biorremediación. Los resultados mostraron que el mejor ensayo de tratabilidad fue el ANHCB, con una remoción del 81% de los hidrocarburos totales y la mayor remoción del N y P presentes. La adición del biosurfactante y utilización del cultivo mixto influenciaron positivamente la biodegradación del crudo liviano, lo cual permite inferir que el uso de biosurfactante es una opción que incrementa la eficiencia en los procesos de biorremediación de aguas contaminadas con hidrocarburo.

Biological surfactants in the bioremediation of light oil contaminated water

SUMMARY

The efficiency of biosurfactants in the bioremediation of light crude oil in contaminated waters was studied. The biosurfactant used was produced by selection of bacterial strains (MI9 and MI10) from the laboratory stock of the Industrial Microbiology Laboratory, Centro de Investigación del Agua, Universidad del Zulia, Venezuela. For the study of different treatments, lasting three months, besides the biosurfactant used a mixed culture was prepared with the bacterial strains MI5, MI7, MI9, MI10, and MI11. The applied treatments were: Maracaibo Lake water, hydrocarbon, mixed growth and biosurfactant (ANHCB); sterilized lake water, hydrocarbon and mixed growth (AEHC); lake water, hydrocarbon and mixed growth (ANHC); lake water, hydrocarbon and bisurfactant (ANHB); and lake water and hydrocarbon (ANH). Physico-chemical and microbiological analyses allowed to determine the efficiency of the biosurfactant and mixed cultures in the bioremediation. The best treatment essayed resulted to be the ANHCB, with an 81% removal of total hydrocarbons and the highest removal of N and P. The addition of the biosurfactants and the use of the mixed cultures influenced positively the biodegradation of the light crude oil. This indicates that the use of the surfactants increases the efficiency of bioremediation in hydrocarbon-contaminated waters.

Surfactantes biológicos na biorremediação de águas contaminadas com petróleo leve.

RESUMO

Investigou-se o efeito dos biosurfactantes na eficiência dos processos de recuperação de águas contaminadas com petróleo leve. O biosurfactante utilizado foi produzido a partir de cepas bacterianas (MI9 e MI10) pertencentes ao grupo de cepas do Laboratório de Microbiologia Industrial do Centro de Investigação da Água, Universidade del Zulia, Venezuela. Para o estudo de tratabilidade, durante três meses, além do biosurfactante utilizado, se preparou um cultivo misto com as cepas bacterianas MI5, MI7, MI9, MI10, e MI11. Os tratamentos aplicados foram: água do Lago de Maracaibo, hidrocarboneto, cultivo misto e biosurfactante (ANHCB); água do lago esterilizada, hidrocarboneto e cultivo misto (AEHC); água do lago, hidrocarboneto e cultivo misto (ANHC); água do lago, hidrocarboneto e biosurfactante (ANHB); e água do lago e hidrocarboneto (ANH). As análises físico-químicas e microbiológicas permitiram determinar a eficiência do biosurfactante e o cultivo misto na biorremediação. Os resultados mostraram que o melhor ensaio de tratabilidade foi o ANHCB, com uma remoção de 81% dos hidrocarbonetos totais e a maior remoção de N e P presentes. A adição do biosurfactante e utilização do cultivo misto influenciaram positivamente a biodegradação do petróleo leve, o qual permite inferir que o uso de biosurfactante é uma opção que incrementa a eficiência nos processos de biorremediação de águas contaminadas com hidrocarboneto.

PALABRAS CLAVE / Biorremediación/ Biosurfactante/ Cultivo Mixto/ Hidrocarburo/

Los biosurfactantes son más biocompatibles, más fácilmente biodegradables y por lo tanto menos tóxicos, menos perjudiciales al ambiente y más activos a bajas concentraciones (Rosenberg y Ron, 1999; Lang, 2000). Además, proporcionan un mayor contacto con el contaminante, facilitando su degradación. Los contaminantes hidrofóbicos presentes en los hidrocarburos del petróleo requieren su solubilización para poder ser degradados por las células microbianas; por lo que la presencia de biosurfactantes incrementa la degradación microbiana de los contaminantes. El criterio utilizado para seleccionar los microorganismos productores de surfactantes es, principalmente, su habilidad para reducir la tensión superficial (Bodour y Miller-Maier, 1998; Cooper et al., 1979).

Este estudio persigue optimizar el proceso de biorremediación de un agua contaminada con crudo liviano utilizando surfactantes biológicos y un cultivo mixto de cepas bacterianas. El trabajo fue realizado en dos etapas; la primera etapa consistió en la producción del biosurfactante, mientras que en la segunda etapa se realizó un estudio de tratabilidad para determinar el efecto del biosurfactante sobre la eficiencia del cultivo mixto integrado por cepas bacterianas aisladas de aguas contaminadas con hidrocarburos.

Se seleccionaron seis cepas bacterianas del grupo de cepas aisladas en el Laboratorio de Microbiología Industrial del Centro de Investigación del Agua de la Universidad del Zulia (MI3, MI5, MI7, MI9, MI10, y MI11). Cada una de ellas fue transferida con un asa de platino a un medio fresco de caldo Tripticasa Soya y se incubó a 37ºC durante 24h en una incubadora Memmert B-50 para su activación. Luego, 1ml de cada una de las cepas se transfirió a 9ml de caldo Tripticasa Soya y se incubaron a 37ºC hasta alcanzar un crecimiento superior a 1´10⁸UFC/ml (Gerhardt et al., 1981; Kerr, 1981). Los cultivos se centrifugaron a 2000xg en una centrifuga MSE Med Oil-58199 por 10min para separar las células del medio de cultivo. Se descartó el sobrenadante y el centrifugado fue lavado y resuspendido en solución salina estéril. La nueva suspensión fue centrifugada a 2000xg por 10min, se descartó el sobrenadante y el centrifugado se resuspendió en un medio mínimo mineral, constituyendo así el inóculo (Duvnjak et al., 1982).

Se agregó cada inóculo (3% v/v) en fiolas que contenían un medio mínimo mineral (MMM) (89% v/v) y gasoil (8% v/v) como única fuente de carbono para un volumen total de 1 litro. El MMM usado para la biosíntesis del surfactante estuvo integrado por 1,2g NH₄CL, 2,4g KNO₃, 0,0005g CaCl₂.6H₂O, 2,4g NaSO₄, 1,2g MgSO₄, 0,6g K₂HPO₄ y 0,002g FeSO₄7H₂O por litro de agua destilada. El MMM fue esterilizado a 121ºC y 15lb de presión durante 15min. El gasoil utilizado fue esterilizado por filtración. Seguidamente, la mezcla se colocó en una incubadora Memmert B-50, por 144h a 37ºC. Luego de la incubación, la mezcla fue centrifugada a 2000xg por 15min en una centrífuga MSE Med Oil-58199, para separar las células del sobrenadante (biosurfactante). Se tomó el sobrenadante y se adicionó, en diferentes concentraciones, a una mezcla de gasoil con agua para determinar la tensión interfacial, utilizando el tensiómetro de Lecomte Du noüy (Duvnjak et al., 1982; Roberts et al., 1991). Las cepas, cuyo sobrenadante obtenido a las 144h fue más eficiente en la disminución de la tensión interfacial de la mezcla gasoil-agua (MI9, MI10 y un cultivo mixto de ambas) fueron escogidas para la producción de surfactante en un período de incubación de 192h, siguiendo la metodología descrita inicialmente.

A partir de las cepas MI5, MI7, MI9, MI10, MI11 activadas, se preparó el cultivo mixto para realizar el montaje de los diversos tratamientos del estudio de tratabilidad, como se muestra en la Tabla I. Cada tratamiento se preparó agregando el biosurfactante obtenido de las cepas MI9 y MI10 (20% v/v), cultivo mixto (10% v/v) y el hidrocarburo liviano (1% v/v) en fiolas que contenían agua del lago y fosfato de amonio para un volumen total de 100ml (Atlas, 1984). Los diferentes tratamientos fueron incubados en una incubadora con agitación New Brunswick G25 durante 30, 60, y 90 días. Se realizaron análisis fisicoquímicos y microbiológicos (Tabla II), según la metodología establecida en APHA (1998).

Para el análisis estadístico de los resultados se aplicó análisis de varianza, utilizando un diagrama de bloque al azar y mediante la aplicación de las pruebas de comparación entre pares de medias por el método de Dunnett, que comparó todos los tratamientos con un control (SAS, 2002).

Las características macromorfológicas y micromorfológicas de las colonias de cada una de las cepas bacterianas utilizadas para la producción del biosurfactante y el estudio de tratabilidad fueron registradas según el formato sugerido por Kerr (1981). Las cepas resultaron cocos y bacilos, siendo la mayoría Gram negativas (Tabla III).

La Figura 1 muestra la tensión interfacial de la mezcla gasoil-agua cuando se adicionaron diferentes concentraciones (0, 10 y 20% v/v) del biosurfactante obtenido a las 144h de incubación. Puede observarse que la tensión interfacial de la mezcla gasoil-agua para las seis cepas estudiadas (MI3, MI5, MI7, MI9, MI10, y MI11) a una concentración de 10% v/v estuvo comprendida entre las 19,5 y 21,5dyn·cm^-1, resultando en una disminución de la tensión interfacial (16 y 19dyn·cm^-1) cuando se incrementó la concentración a 20% v/v. Los surfactantes producidos por las cepas MI9 y MI10 fueron los que lograron la mayor reducción de la tensión interfacial, 16 y 16,5dyn·cm^-1, respectivamente, seleccionándose ambas cepas bacterianas para el ensayo de tratabilidad. Estos valores mostraron mayor actividad superficial de las cepas a los reportados por Batista et al. (2006) en un estudio de aislamiento y caracterización de bacterias productoras de biosurfactantes procedentes de sitios contaminados con hidrocarburos, en los cuales los sobrenadantes de dos cepas bacterianas causaron disminuciones en la tensión superficial de 36,2 a 35,8 y de 46,5 a 41,8dyn·cm^-1. Por su parte, Benincasa y Accorsini (2007), en una solución acuosa con hexadecano lograron una mayor disminución de la tensión interfacial, de 29 a 1,3dyn·cm^-1, utilizando una cepa de Pseudomonas aeruginosa.

La Figura 2 muestra la reducción de la tensión interfacial con las cepas MI9, MI10 y el cultivo mixto de ambas (MI9+MI10) a concentraciones diferentes con un período de incubación de 192h. A una concentración del 10% v/v del surfactante, la tensión interfacial fue de 13,5 y 14dyn·cm^-1, mientras que a 20% v/v los valores disminuyeron a 8,5 y 9,5dyn·cm^-1. Al comparar los valores obtenidos en los dos ensayos, la tensión interfacial de la mezcla gasoil-agua con el biosurfactante producido por las cepas MI9 y MI10 a las 192h de incubación fue menor, que la producida por todas las cepas bacterianas a las 144h de incubación. Ello fue debido probablemente a una interacción entre las cepas que les impedía lograr una etapa de máxima actividad o a que no habían llegado a completar su etapa de adaptación y aclimatación. También se puede notar que al adicionar al 20% v/v el biosurfactante producido por cada una de las cepas bacterianas, la tensión interfacial de la mezcla gasoil-agua fue menor a las obtenidas con menor concentración. Es posible inferir que a mayor tiempo de incubación se logra una mayor disminución de la tensión superficial de la mezcla gasoil-agua, lo cual puede deberse a que se produce una mayor cantidad del biosurfactante. Menezes et al. (2005), utilizando el sobrenadante de cultivos de cepas bacterianas aisladas de suelos contaminados con diesel, obtuvieron disminuciones de la tensión superficial de 56,4 y 41,4 a 24 y 7,4dyn·cm^-1 después de 168h de incubación.

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Estudio de tratabilidad

Determinación microbioló­gica. Los valores de densidad poblacional para cada tratamiento durante el ensayo de tratabilidad se muestran en la Figura 3a, donde se aprecia que dichos valores estuvieron entre 129´10⁶ y 1480´10⁶UFC/ml. Todos los tratamientos mostraron un aumento progresivo en la densidad poblacional a excepción del tratamiento ANH, donde la población bacteriana decreció. Los tratamientos con una mayor densidad poblacional al final del ensayo fueron ANHCB, ANHC y AEHC, con 1480, 1318 y 1108´10⁶UFC/ml, respectivamente, y en ellos se encontraban los microorganismos aportados por el cultivo mixto. Al observar el comportamiento de estas curvas se puede inferir que hubo una mayor actividad metabólica en el tratamiento ANHCB, evidenciado por la densidad poblacional, mientras que en el tratamiento ANH ocurrió lo contrario (7UFC/ml); los microorganismos autóctonos del agua del Lago de Maracaibo no lograron adaptarse al crudo liviano como única fuente de carbono. Este resultado sugiere que una gran variedad de microorganismos pueden subsistir en ambientes contaminados con petróleo aunque no todos son capaces de asimilar hidrocarburos y adaptarse a estas condiciones (Cook y Westlake, 1972; Prince, 1993; Levin y Gealt, 1997).

El análisis de varianza mostró que existen diferencias altamente significativas, con un 99% de confiabilidad, en la densidad bacteriana tanto para los diferentes tratamientos, como a lo largo del tiempo. Al aplicar el método de Dunnett se encontró que existen diferencias significativas en la densidad bacteriana de los tratamientos AEHC y ANHB, ambos con respecto al control (ANH) con un 95% de confiabilidad. Se encontró, además, que existen diferencias altamente significativas en la densidad bacteriana de los tratamientos ANHCB y ANHC, ambos con respecto al control (ANH).

Hidrocarburos totales. Las concentraciones de hidrocarburos totales encontrados al inicio del ensayo estuvieron entre 7467 y 8265mg·l^-1, mientras que al final resultaron entre 1394 y 7726mg·l^-1 (Figura 3b). Las mayores concentraciones de hidrocarburos remanentes al final del ensayo pertenecieron al tratamiento ANH (7726mg·l^-1) y los valores de hidrocarburo remanentes más bajos se reflejaron en el tratamiento ANHCB (1394mg·l^-1). Al correlacionar estos resultados con los valores de densidad poblacional se observa que a mayor densidad poblacional menor concentración de hidrocarburos remanentes. Así, el tratamiento ANHCB tuvo los mayores valores de densidad poblacional, mientras que los valores más bajos fueron los del tratamiento ANH. Las concentraciones (mg·l^-1) de hidrocarburos de los tratamientos ANHCB (1394), AEHC (5305), ANHC (4746) y ANHB (3771) estuvieron muy por debajo de los resultados obtenidos en el control ANH (7726). Esta diferencia se debió a la baja actividad metabólica de los organismos presentes en el tratamiento control. De igual manera, se observa que las concentraciones de crudo disminuyeron rápidamente durante los primeros 30 días, período durante el cual los microorganismos degradaron entre un 50 y 60% del hidrocarburo.

El análisis de varianza mostró que existen diferencias altamente significativas en la cantidad de hidrocarburos remanentes, tanto para los diferentes tratamientos, como a lo largo del tiempo, con un 99% de confiabilidad. La aplicación del método de Dunnett reveló que existen diferencias no significativas en las concentraciones de hidrocarburo remanentes del tratamiento AEHC y el control (ANH). Existen diferencias significativas en las concentraciones de hidrocarburo remanentes del tratamiento ANHC y el control, con un 95% de confiabilidad; y, además, existen diferencias altamente significativas en las concentraciones de hidrocarburos remanentes de los tratamientos ANHCB y ANHB con respecto al control, ambos con un 99% de confiabilidad.

La Figura 4 muestra los valores de remoción de crudo liviano. Los valores más altos los presentaron los tratamientos ANHCB y ANHB, con 81 y 50%, respectivamente, seguidos por los tratamientos ANHC y AEHC con 36 y 29%. El menor porcentaje de remoción (7%) fue el del tratamiento control ANH.

Los tratamientos ANHCB y ANHB presentaron remociones superiores a ANHC y AEHC que contenían cultivo mixto, debido a que el biosurfactante adicionado influenció positivamente la emulsión creando una superficie de contacto mayor (Zhaozhe et al., 2003). Whang et al. (2007) en un estudio de degradación de diesel con la utilización de un biosurfactante obtuvieron 100% de degradación de los hidrocarburos totales, mientras que en el tratamiento sin el biosurfactante, se obtuvo el 64% en 200h de tratamiento.

En la Figura 5 se presenta la remoción de las fracciones de hidrocarburos, apreciándose una mayor remoción de hidrocarburos saturados en los tratamientos ANHCB (78%) y ANHB (43%), mientras que en los tratamientos AEHC y ANHC la remoción obtenida fue de 17 y 34%, respectivamente. El tratamiento ANH (1%) permaneció sin cambio significativo en la cantidad de saturados, siendo este tratamiento el que presentó un menor porcentaje de remoción de crudo liviano. Se observó una remoción en las fracciones de resinas en todos los tratamientos; encontrándose en los tratamientos ANHCB (95%), AEHC (87%), ANHC (87%) y ANHB (78%) los cambios más significativos; mientras que el control removió el 30%. Con respecto a los asfaltenos, se observó una mayor remoción en los tratamientos ANHCB (98%) y ANHB (39%); mientras que en los tratamientos AEHC y ANHC fue 14 y 5% respectivamente y el tratamiento ANH (2%) presentó el menor porcentaje de remoción. El tratamiento ANHCB (75%) alcanzó la mayor remoción de hidrocarburos aromáticos, seguido de ANHC (28%) y AEHC (5%). Los tratamientos ANHB y ANH mostraron un incremento en los aromáticos con respecto a los valores iniciales, comportamiento que se debe a la biotransformación de resinas y asfaltenos, que al degradarse parcialmente dan lugar a la acumulación de derivados más sencillos como los saturados y aromáticos, incrementando los valores de estas fracciones (Young y Gerniglia, 1995; Levin y Gealt, 1997).

Las Figuras 6a y b presentan las concentraciones totales de N y P. Se observa una disminución de sus concentraciones durante todo el estudio. Las concentraciones iniciales para el N estuvieron alrededor de 460 y 684mg·l^-1 en los tratamientos y disminuyeron hasta 246 y 329mg·l^-1, mientras que las concentraciones iniciales para el P estuvieron alrededor de 10 y 42mg·l^-1 en los tratamientos y disminuyeron hasta 0,07 y 14mg·l^-1. Los mayores consumos de N y P se observan en el tratamiento ANHBC. El análisis de varianza mostró que existen diferencias altamente significativas en las concentraciones de P, tanto para los diferentes tratamientos, como a lo largo del tiempo, con un 99% de confiabilidad, y diferencias significativas en las concentraciones de N, tanto para los diferentes tratamientos, como a lo largo del tiempo, con un 95% de confiabilidad.

Hubo un mayor consumo del N y P durante los primeros 30 días del ensayo. Esto se debió a que durante este tiempo se degradó la mayor cantidad de crudo y los organismos utilizan los nutrientes para lograr una degradación rápida y completa. Muchos informes demuestran que las escasas concentraciones de N y P en el agua de mar reducen la velocidad de degradación de los hidrocarburos después de los derrames de petróleo (Dibble y Bartyla, 1976; Ward y Brock, 1978; Prince, 1993). También puede observarse que la concentración disminuye en mayor proporción para el N que para el P, lo que pudiera ser atribuido a que en la mayoría de las células bacterianas el N representa ~10-14% de la masa microbiana y el P un 0,5-2%, y al momento de formar nuevos individuos los microorganismos necesitan más de estos constituyentes para la asimilación y la síntesis del nuevo material celular.

Metales pesados

Los metales pesados generalmente presentan un moderado índice de toxicidad en los microorganismos. En la Tabla V se muestran las concentraciones de metales pesados para cada tratamiento al inicio del ensayo. Los resultados determinaron que los niveles de metales analizados estaban por debajo de lo establecido en la norma vigente para límites y rangos máximos permitidos de calidad de vertidos líquidos, que sean o vayan a ser descargados, en forma directa o indirecta a ríos, estuarios, lagos y embalses (Gaceta Oficial, 1998), por lo que no se continuaron realizando los análisis a lo largo del estudio.

La Tabla VI muestra el pH en los tratamientos durante todo el estudio. Los valores de pH en los tratamientos ANHCB, AEHC, ANHC y ANHB estuvieron alrededor de 9 y 9,5, mientras que en el tratamiento control (ANH) se encontró en 7,3 y ~8,8. Los valores de pH en cada uno de los tratamientos fueron bastante cercanos y estables, lo cual favoreció el proceso de degradación en cada tratamiento. El rango óptimo para que muchos microorganismos se establezcan en sistemas de tratamientos biológicos se encuentra entre 7 y 9 (Atlas, 1984), ya que los niveles de pH ligeramente alcalinos favorecen el crecimiento biológico.

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