Efecto de desarrollo y secado de semillas de physalis ixocarpa brot en germinación, vigor y contenido de azúcares

Ignacio Pérez Camacho, Víctor A. González Hernández, Juan C. Molina Moreno, Óscar J. Ayala Garay y Aureliano Peña Lomelí

Ignacio Pérez-Camacho. M.C. en Producción de Semillas, Colegio de Postgraduados (COLPOS), México. Estudiante del Doctorado, COLPOS, Montecillo, México. Dirección: Km. 36.5, carretera México-Texcoco. Texcoco, Edo. de México. 56230. México. e-mail: rcruz@ola.icmyl.unam.mx

Víctor A. González-Hernández. M.C. en Genética, COLPOS, México. Ph.D., University of Nebraska, EEUU. Profesor Investigador, COLPOS, Montecillo, México.

Juan C. Molina-Moreno. M.C. en Genética, COLPOS, México. Investigador, COLPOS, Montecillo, México.

Óscar J. Ayala-Garay. Master en Genética y Doctor en Biología y Agronomía, École National Superieur Agronomique de Rennes, Francia. Profesor Investigador, COLPOS; Montecillo, México.

Aureliano Peña-Lomelí. M.C. y Doctor en Genética, COLPOS, México. (UACh), México. Profesor Investigador, Universidad Autónoma Chapingo, México.

RESUMEN

Durante la formación de la semilla el contenido de humedad se reduce y la germinabilidad aumenta, comportamiento denominado como adquisición de tolerancia al secado. Las particularidades del comportamiento de las semillas de Physalis ixocarpa se desconoce, por lo que se estudió la evolución de la calidad fisiológica (germinación y vigor) y la concentración de azúcares durante el desarrollo de la semilla de P. ixocarpa, variedad Chapingo, y su relación con tres tipos de secado de semillas. Una vez extraídas del fruto se secaron con aire a 25ºC, con aire del ambiente y un testigo en donde se sembraron inmediatamente. Las semillas se cosecharon en seis estados de desarrollo (28, 35, 42, 49, 56 y 63 días después de floración, DDF). En todos los estados de desarrollo, ambos secados con aire elevaron la germinación para superar al testigo hasta en 42% (P£0,05). La velocidad de emergencia, variable que evalúa vigor, aumentó de 7 plántulas por día a los 28 DDF hasta 18 plántulas por día a los 42 DDF, pero sin diferencias entre secados, lo que evidencia que éstos no afectaron el vigor de la semilla sino la germinabilidad. En todos los tratamientos los contenidos de sacarosa y rafinosa aumentaron durante el desarrollo de la semilla, mientras que los monosacáridos (glucosa, fructosa y sorbitol) no presentaron diferencias significativas entre tratamientos de secado.

SUMMARY

During seed development the humidity content decreases while germinability increases, a process known as acquisition of tolerance to desiccation. However, this process is not well known in seeds of Physalis ixocarpa. The effect of three drying methods in the physiological quality (germination and vigor) and sugar content of seeds of P. ixocarpa cv Chapingo was evaluated at different development stages. Seeds were extracted at six fruit development stages (28, 35, 42, 49, 56 and 63 days after flowering, DDF) and exposed to three types of drying: forced air at 25ºC or at room temperature, and a control consisting in planting the seeds inmediately. In all development stages, both drying treatments elevated germination up to 42% (P£0.05) over the control. The emergency rate (seed vigor) increased on average from 7 seedlings per day at 28 DDF to 18 seedlings per day at 42 DDF, independent of the drying method, which means that these drying methods affected germinability instead of seed vigor. In all the treatments, saccharose and rafinose contents increased during seed development, whereas monosaccharides contents (glucose, fructuose and sorbitol) were not related to the drying treatments.

RESUMO

Durante a formação da semente o conteúdo de umidade se reduz e a germinação aumenta, comportamento que denominou-se aquisição de tolerância à seca. Desconhece-se o comportamento fisiológico das sementes de Physalis ixocarpa durante sen desenvolvimento. Nesta investigação estudou-se a evolução da qualidade fisiológica (gerrninação e vigor) e a concentração de açúcares durante o desenvolvimento (28, 35, 42, 49, 56, e 63 dias depois da floração, DDF); uma vez extraidas do fruto, as sementes foram sometidas a três tipos de seca com ar a 25°C, com ar do ambiente e uma testemunha sem seca. Em todos os estados de desenvolvimento, ambas secas elevaram a germinação para superar a testemunha até em 42% (P£0,05). A velocidade de emergência aumenta durante a maduração das sementes dum ponto médio de 7 plântulas·dia aos 42 DDF, mas sem diferenças entre tratamentos de seca, o que evidencia que estes não afetaram o vigor da semente senão germinabilidade. Em todos os tratamentos os conteúdos de sacarose e rafinose aumentaram durante o desenvolvimento da semente, enquanto os monosacáridos (glicose, frutose e sorbitol) não presentaram diferenças significativas entre tratamentos de seca.

PALABRAS CLAVE / Desecación / Semilla / Tolerancia / Tomate de Cáscara / Tomatillo /

En las primeras etapas de su formación, las semillas aún no han alcanzado el desarrollo morfológico y fisiológico que le permita una germinación óptima. La pobre germinación de semillas inmaduras ha sido atribuida a bajos niveles de nutrientes, enzimas y hormonas indispensables para que dicho proceso se lleve a cabo correctamente (Kermode, 1990).

Se ha postulado que los compuestos de reserva, tales como azúcares no reductores, fosfolípidos y proteínas, se acumulan antes de la deshidratación y contribuyen a proteger del deterioro debido a la pérdida de agua. Por ejemplo, en chícharo (Pisum sativum L.) los asimilados como sacarosa y aminoácidos son los que migran hacia el embrión (Déjardin et al., 1997). Entre los mecanismos asociados al proceso de adquisición de tolerancia a la desecación, está la disminución del contenido de almidón plastidial en embriones de Sinapis alba L. (Fisher et al., 1988) y de Brassica campestris L. (Leprince et al., 1990). Tal disminución de almidón se corresponde con el incremento en estaquiosa y sacarosa en las semillas.

Las biomoléculas como proteínas (Kermode, 1997), sacarosa, rafinosa y otros oligosacáridos (Koster y Leopold, 1988; Crowe et al., 1992, Horbowicz y Obendorf, 1994; Obendorf, 1997) se consideran protectoras de las semillas porque ayudan a estabilizar las membranas de organelos durante la desecación. En maíz (Zea mays L.) y otras gramíneas, la sacarosa es el oligosacárido predominante, seguida de la rafinosa y la estaquiosa (Kuo et al., 1998). Estas moléculas son catabolizadas para liberar energía metabólica usada para el reinicio de crecimiento del embrión en la germinación (Cochrane, 2000; Hopkins, 2003).

Dado que el secado natural contribuye a mejorar la germinabilidad, el secado de semillas inmaduras puede incrementar su capacidad germinativa (Kermode, 1995). Modi y White (2004) encontraron que semillas de tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) tipo Cherry, cosechadas inmaduras y secadas con aire seco a 20ºC, mejoraron su capacidad germinativa. Para semillas de tomate de cáscara (Physalis ixocarpa Brot.) no se encontró información que describa sus características metabólicas durante su desarrollo. Por ello, en el presente trabajo se analizó la evolución de germinación, vigor y concentración de azúcares solubles durante el desarrollo de la semilla y su relación con diferentes tipos de secado.

Se utilizó semilla de tomate de cáscara (Physalis ixocarpa Brot, var. Chapingo) producida en Texcoco, Edo. de México, México, a 2250msnm, durante el ciclo primavera-verano de 2005. La semilla se obtuvo de 100 frutos cosechados en diferentes momentos del desarrollo, a 28, 35, 42, 49, 56 y 63 días después de floración (DDF). Al momento de la cosecha se determinó el porcentaje de humedad de la semilla, para lo cual los tratamientos (edades de la semilla) se analizaron mediante un diseño experimental completamente al azar con dos repeticiones de 50 semillas, deshidratadas a 72°C durante 72h en una estufa Thelco 31480 (EEUU), utilizándose la fórmula de Bewley y Black (1994).

Las semillas restantes se dividieron en tres lotes similares y a cada uno se le aplicó un tratamiento de desecación: semilla sin secar (testigo), semilla secada a la sombra a temperatura ambiente (Tratamiento 1) y semilla secada con aire caliente a 25ºC (Tratamiento 2). Las semillas se mantuvieron en ambos tratamientos de secado hasta alcanzar peso constante (8 ±1,2% de humedad). Después de aplicar estos tres tratamientos, las semillas se sometieron a pruebas de germinación y de vigor, y se determinó el tenor de diferentes azúcares.

Para la prueba de germinación se usaron cuatro repeticiones de 25 semillas, en un diseño experimental completamente al azar. Las semillas se depositaron en cajas de Petri sobre papel filtro humedecido y se dejaron germinar con iluminación constante, en una germinadora Seedburo (EEUU) a 25 ±1ºC. El conteo de plántulas normales se hizo en el día 7 de iniciada la prueba (ISTA, 2004).

Como medida del vigor de los lotes de semilla, se utilizó la velocidad de emergencia en arena. Los tratamientos se distribuyeron en un diseño experimental de bloques al azar con cuatro repeticiones de 25 semillas y éstas se sembraron a 1cm de profundidad en un semillero con arena esterilizada y saturada de humedad. Al iniciar la emergencia se hicieron conteos, cada 24h, de las plántulas emergidas; la velocidad de emergencia de plántulas se calculó con la fórmula de Maguire (1962), donde el tratamiento con mayor índice corresponde al más vigoroso. La evaluación final se hizo cuando se obtuvo el máximo número de plántulas emergidas (10 días después de la siembra). Al final de la prueba se secaron 10 plántulas tomadas al azar por repetición, en una estufa a 70ºC durante 48h, y se determinó el peso de la biomasa seca de la parte aérea y la raíz.

La determinación de azúcares se hizo en 1g de semilla previamente liofilizada, de la que 50mg fueron macerados en mortero y homogeneizados en 1ml de etanol 75%. El homogenizado se centrifugó a 3000g por 5min a 18ºC y el sobrenadante se secó a 75ºC, resuspendiendo el residuo en 1ml de agua ultrapura. Para eliminar fenoles y partículas iónicas, el extracto se filtró en una columna empacada con 0,5ml de polivinilpirrolidona, 0,5ml de Amberlita y 1ml de Dowex, y se inyectó en un cromatógrafo de líquidos de alta presión (HPLC, serie 1100 Hewlett Packard, EEUU). La columna utilizada fue de 300mm´7,8μm, con flujo de 0,5μl·mm^-1, a una temperatura de 80ºC. Previo a la inyección de cada muestra, la columna se lavó con 10ml de agua ultrapura y se inyectaron estándares internos de sacarosa, rafinosa, glucosa, fructosa y sorbitol (Sigma, Alemania).

Las semillas inmaduras obtenidas a los 28 días después de floración (DDF) eran mucilaginosas, delgadas y con contenido de humedad >60%. Entre los 35 y los 42 DDF ocurrió una reducción rápida de la humedad de las semillas, hasta de 47% a los 42 DDF. A partir de este muestreo y hasta el último (63 DDF), las semillas dentro del fruto mantuvieron una humedad cercana a 45% (Figura 1). Lo anterior indica que mientras se mantienen en el fruto, las semillas alcanzan un punto de equilibrio de 45% en su contenido de humedad. Al respecto, Modi y White (2004) reportaron en tomate tipo Cherry que durante la madurez de la semilla ocurre un flujo de salida de agua hacia la placenta, flujo que probablemente esté asociado con uno de entrada de azúcares solubles.

Las semillas sin secado (testigo) mostraron una baja capacidad germinativa a los 28 DDF, con un nivel de ~20%. Esta baja germinabilidad se mantuvo durante otra semana, hasta los 35 DDF. Posteriormente la capacidad incrementó hasta un máximo de 73% a los 63 DDF (Figura 2a) momento cuando el fruto se torna amarillo y, tradicionalmente, se considera la fecha óptima para la cosecha de semilla (Martínez et al., 2004). Un comportamiento similar fue observado por Modi y White (2004) en semillas de tomate Cherry, cuya germinación evolucionó en 5, 38, 68 y 72%, a los 14, 28, 42 y 56 DDF, respectivamente.

En las semillas que no recibieron secado previo a la prueba de germinación, es evidente que aquellas que tenían una humedad superior a 60% (28 y 35 DDF) presentaron una germinación <25% (testigo en la Figura 2a), mientras que las semillas que ya tenían una humedad inferior a 50% (42 DDF o más) alcanzaron una germinación ³50%. Por tanto, la baja germinación del testigo se puede atribuir al alto contenido de agua en la semilla, como también observaron Hebblethwaite (1983) en semillas de trigo (Triticum aestivum L.) y Modi y White (2004) en tomate Cherry. Según Kermode (1995), el secado de semillas durante su desarrollo actúa como una señal que activa su capacidad germinativa.

En cambio, cuando la semilla inmadura se sometió a secado, la germinación fue significativamente superior al testigo (Figura 2a). Tal efecto promotor de la desecación sobre la capacidad germinativa fue más contundente en las primeras etapas formativas de las semillas; así, en 35-42 DDF la semilla seca germinó 42% más que la misma sin secar, y en 63 DDF la diferencia fue de solo 26%. Estos cambios indican que la semilla de tomate de cáscara fue adquiriendo tolerancia al secado, la cual alcanzó su máximo a los 42 días de iniciada su formación. Por tanto, a esta edad es cuando puede ser extraída del fruto y expuesta a secado, ya sea con aire caliente o ambiental, y lograr una germinabilidad >90%, que es un nivel aceptable para el comercio de semillas. Esto contrasta con los señalado por Martínez et al. (2004), para quienes el mayor porcentaje de germinación en semillas de tomate de cáscara se alcanza a los 63 DDF. Otras especies que han mostrado tolerancia a la desecación en sus semillas son maíz (Brenac et al., 1997), frijol (Bailly et al., 2001) y tomate tipo Cherry (Modi y White, 2004).

Estas escasas diferencias en la velocidad de emergencia de plántulas en arena muestran que el secado de semillas, aunque puede mejorar notablemente su germinación (Figura 2a), no mejora la tasa de alargamiento de las plántulas, la cual osciló entre 13 y 20 plántulas emergidas por día a partir de los 42 DDF. Es decir, en arena la germinación debió haber tenido igual tasa que en la prueba estándar, pero para que la emergencia ocurra en arena, las plántulas deben crecer y alargarse. En semillas inmaduras de 35 DDF o menos, las bajas tasas de emergencia pudieron deberse a inmadurez de la semilla y al bajo nivel de nutrientes, enzimas y hormonas indispensables para la germinación (Kermode, 1990).

En los indicadores de vigor referentes a la biomasa, peso seco de parte aérea y de la raíz (Figura 2c y 2d) las semillas sin secar crecieron más (P£0,05) al avanzar su desarrollo que las semillas secas, lo que evidencia que el secado reduce el vigor de las semillas del tomate de cáscara, con pérdidas de materia seca de 92% en el vástago y de 66% en la raíz.

El efecto diferencial del secado entre germinación y los indicadores del vigor, sugieren que se favorece la capacidad germinativa del embrión, tal vez porque modifica el balance hormonal de la semilla, pero se perjudica la síntesis o utilización de las reservas almacenadas, ya sea en los cotiledones o en el endospermo, las cuales son necesarias para abastecer al embrión en crecimiento y permitir la formación de plántulas vigorosas.

Los contenidos de sacarosa y rafinosa aumentaron durante el desarrollo de la semilla en todos los tratamientos (Figura 3a y 3b), sobre todo a partir de los 49 DDF, pero sin diferencias significativas entre tratamientos. Esto indica que los mecanismos de síntesis o acumulación de sacarosa y rafinosa se encuentran activos durante la deshidratación de las semillas, sea sin desecar o sometidas a secado. El incremento observado en los contenidos de sacarosa y rafinosa en las semillas de tomate de cáscara parece estar asociado con el desarrollo de la semilla y la adquisición de tolerancia a la desecación, de forma similar a lo observado por Brenac et al. (1997) en semillas de maíz. De hecho, en la mayoría de las semillas ortodoxas, la acumulación inicial de sacarosa y rafinosa coincide con la fase en la cual el embrión adquiere tolerancia a la desecación, razón por la cual Cochrane (2000) postuló que estos azúcares hacen posible que el embrión sea viable a muy bajos potenciales hídricos.

A nivel molecular, la cristalización de sacarosa durante el secado permite la formación de un estado vidrioso que contribuye a proteger la integridad de la membrana, porque los grupos hidroxilos de los azúcares sustituyen al agua y estabilizan los lípidos de la membrana (Koster et al., 1994; Cochrane, 2000). Además, la sacarosa y la rafinosa se hallan en concentraciones altas en los tejidos seminales involucrados en el proceso de germinación, por lo que se considera que contribuyen a la germinación de las semillas como combustibles del metabolismo inicial que induce la respiración y el alargamiento del eje embrionario (Kigel y Galili, 1995; Yordanov et al., 2003). Se puede inferir entonces, que la acumulación paulatina de estos dos azúcares solubles durante el desarrollo de la semilla de tomate de cáscara, estabiliza los lípidos de membrana y mejora el desarrollo del embrión durante la germinación.

La glucosa (Figura 3c) presentó una tendencia a mantenerse en niveles bajos y constantes durante el desarrollo de la semilla (0-2mg·g^-1), excepto a los 49 DDF cuando subió hasta 8,01mg·g^-1 en el tratamiento de secado a temperatura ambiente y a los 63 DDF, cuando subió hasta 6,13mg·g^-1 en el tratamiento de secado con aire caliente. Pero, en general, no se detectaron diferencias consistentes entre tratamientos de secado; además el contenido de glucosa no mostró una relación clara con la calidad fisiológica de la semilla ni con los contenidos de sacarosa y rafinosa. Sin embargo, es posible que el incremento de glucosa observado a los 49 DDF se asocie con el metabolismo de la sacarosa, constituida por una molécula de glucosa y otra de fructusa. Es decir, el rápido incremento en la concentración de sacarosa ocurrido a partir de los 49 DDF podría indicar que la glucosa acumulada hasta ese momento habría sido usada para la síntesis de sacarosa y rafinosa. Al respecto, Cochrane (2000) indica que la presencia de glucosa en los tejidos de la semilla en desarrollo se explica principalmente por su participación en el metabolismo y en la síntesis de compuestos de reserva. En semillas de soya, Locher y Bucheli (1998) observaron que pequeñas diferencias en los contenidos de glucosa y galactosa influyeron en la capacidad de germinación, almacenaje y predisposición al deterioro.

La fructosa en la semilla (Figura 3d) también tendió a mantenerse constante en 0,5 y 2mg·g^-1, excepto en el tratamiento de secado al aire del ambiente, donde aumentó hasta 8,5mg·g^-1 a partir de los 49 DDF. Sin embargo, las diferencias entre tratamientos tampoco fueron significativas, por lo que lo más probable es que la fructosa, al igual que la sacarosa, tenga poco efecto directo en el proceso de adquisición de la tolerancia al desecamiento.

El secado elevó la capacidad germinativa de las semillas, tanto inmaduras como maduras, cualquier fuese su etapa de desarrollo. Por lo tanto, es posible realizar la cosecha de las semillas de tomate de cáscara, a partir de los 42 DDF y con secado alcanzar una germinabilidad >90%. Sin embargo, el secado afectó negativamente el vigor de la semilla. Los contenidos de sacarosa y rafinosa, aumentaron con la edad de la semilla en todos los tratamientos de secado, pero sin diferencias estadísticas por efecto del secado. Los monosacáridos (glucosa, fructosa y sorbitol) tampoco mostraron efecto de los tratamientos de secado, aunque sus contenidos fluctuaron durante el desarrollo de la semilla.

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