CALIDAD MICROBIOLÓGICA DE SEMILLAS GERMINADAS DE Phaseolus vulgaris

Rita Cava. Licenciada en Ciencias Biológicas y Estudiante de Doctorado, Universidad de Murcia, España. M.Sc. en Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Universidad Central de Venezuela (UCV), Venezuela.

Elba Sangronis. Farmacéutica, UCV, Venezuela. M.Sc. en Ciencia de los Alimentos, Universidad Simón Bolívar (USB), Venezuela. Ph.D. en Ciencia de los Alimentos, Washington State University, EEUU. Profesora, USB, Venezuela. Dirección: Departamento de Tecnología de Procesos Biológicos y Bioquímicos. Edif. Aulas. Piso 3. Ofic. 316B. USB. Sartenejas, Baruta. Apartado 89000. Caracas, Venezuela. e-mail: esangron@usb.ve .

Marta Rodríguez. Licenciada en Biología y M.Sc. en Ciencia de los Alimentos, (USB), Venezuela.

Jhoana Colina. Ingeniera Química, Universidad Nacional Experimental Politécnica "Antonio José de Sucre", Venezuela. M.Sc. en Ciencia de los Alimentos, USB, Venezuela. Profesora, USB, Venezuela.

Las semillas germinadas tienen un valor nutricional mejorado pero han sido involucradas en muchos brotes infecciosos ocasionados por productos alimenticios. En este estudio se realizó el recuento de bacterias aerobias, coliformes totales, Escherichia coli, levaduras y mohos en semillas sin germinar y germinadas de dos variedades de Phaseolus vulgaris. Adicionalmente se hizo la enumeración de Bacillus cereus en las semillas germinadas. También se investigó la presencia de Salmonella spp, Listeria monocytogenes y E. coli O157:H7. La población de aerobios mesófilos, coliformes totales, mohos y levaduras incrementó en las semillas germinadas con respecto a las semillas sin germinar en las dos variedades de P. vulgaris. No se detectó la presencia de Salmonella, L. monocytogenes o E. coli O157:H7 en las semillas de Phaseolus sin germinar ni en las germinadas. Se observaron altos recuentos de B. cereus, lo cual representa un riesgo a la salud de los consumidores.

Sprouts have an improved nutritional value but have been involved in many foodborne infectious outbreaks. Aerobic bacteria, coliforms, generic Escherichia coli, yeasts and moulds were counted in dry seeds and in sprouts of two varieties of Phaseolus vulgaris. Bacillus cereus was counted in sprouts. The presence of Salmonella spp, Listeria monocytogenes, and E. coli O157:H7 was investigated. Populations of aerobic mesophiles, coliforms, moulds and yeasts increased in the sprouts with respect to the dry seeds in the two varieties of P. vulgaris. The presence of Salmonella, L. monocytogenes or E. coli O157:H7 was not detected in the dry beans nor in sprouts. However, high counts of B. cereus were obtained, which represents a health risk.

As sementes germinadas têm um valor nutricional melhorado mastem sido envolvidas em muitos surtos infecciosos ocasionados por productos alimentícios. Neste estudo se realizou a contagem de bactérias aeróbias, coliformes totais, Escherichia coli, leveduras e mofos em sementes sem germinar e germinadas de duas variedades de Phaseolus vulgaris. Adicionalmente foi realizada a enumeração de Bacillus cereus nas sementes germinadas. Também foi investigada a presença de Salmonella spp, Listeria monocytogenes e E. coli O157:H7. A população de aeróbios mesófilos, coliformes totais, mofos e leveduras incrementou nas sementes germinadas em relação às sementes sem germinar nas duas variedades de P. vulgaris. Não foi detectada a presença de Salmonella, L. monocytogenes o E. coli O157:H7 nas sementes de Phaseolus sem germinar nem nas germinadas. Observaram-se altas recontagens de B. cereus, o qual representa um risco à saúde dos consumidores.

En los últimos años, la producción y consumo de semillas germinadas se ha incrementado a nivel mundial. Solo en Corea, la producción de guisantes germinados está en el orden de 179 billones ton/año (Lee et al., 2007). La ventaja adicional de una semilla germinada es su calidad nutricional mejorada; se ha observado un incremento en la biodisponibilidad de proteínas, aminoácidos esenciales, vitaminas, carbohidratos y minerales tales como Ca, Fe y Mg (Sangronis y Machado, 2007). A pesar de estas ventajas, la ingesta de germinados puede representar un riesgo para la salud, ya que se han visto involucrados en brotes asociados a enfermedades transmitidas por alimentos. La Administración de Drogas y Alimentos de los EEUU (FDA, por sus siglas en inglés) ha reportado que en el periodo 1999-2005, el 40% del total de las enfermedades transmitidas por alimentos estaban relacionados con semillas germinadas (Powel, 2005). También han sido reportados brotes en Japón, Finlandia, Dinamarca, Suiza y Canadá con alfalfa, rábano y judías germinados (Prokopowich y Blank, 1991; Honish y Nguyen, 2001).

La microbiota característica de los granos germinados puede ocasionalmente contener bacterias patógenas. Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Aeromonas hydrophila y Escherichia coli O157:H7 han sido aislados de semillas germinadas, incluyendo alfalfa, judías, berro, rábano, soya y mostaza (Taormina y Beuchat, 1999; Beuchat, 1996; Aabo y Baggesen, 1997). El origen de la contaminación puede variar. El agua de la irrigación, la manipulación inadecuada de los agricultores que dañan la estructura de la semilla y la hacen más susceptibles a la contaminación son algunas causas de contaminación. Se ha observado que algunos de los microorganismos patógenos pueden sobrevivir dentro de las semillas durante un largo tiempo (Moline y Kulik, 1997). Las condiciones asociadas al proceso de germinación, tales como la alta humedad de la semilla y el ambiente, la temperatura, un pH cercano a la neutralidad, la disponibilidad de carbohidratos y otros nutrientes, favorecen el crecimiento de las bacterias que se encuentran dentro o fuera de la semilla (Buck et al., 2003).

Las buenas prácticas de saneamiento son necesarias como un procedimiento de operación estándar, a fin de proteger contra la contaminación en todas las etapas del proceso de producción de germinados (FDA, 1999). Varios métodos se han recomendado para reducir o eliminar las bacterias patógenas en los germinados. El uso de agua clorada, desinfectantes, radiación, calor y altas presiones son efectivos (Gandhi y Matthews, 2003; Peñas et al., 2008); sin embargo, hasta ahora, no hay procedimiento que sea capaz de eliminar totalmente a los patógenos bajo las condiciones experimentales utilizadas (NACMCF, 1999).

En los países desarrollados, así como en África, Asia y Latinoamérica, las leguminosas son importantes componentes de la dieta del hombre, por ser una valiosa fuente de proteína que complementa la de los cereales (Heiser, 1995), siendo Phaseolus vulgaris la leguminosa más consumida en Latinoamérica y África (Sangronis et al., 2004). En Venezuela se le denomina "caraota negra" al P. vulgaris y es un producto de alto consumo en todos los estratos socioeconómicos (Quintana, 2001), formando parte importante de los hábitos alimenticios de la población, y representan 52-58% de las leguminosas consumidas.

Dado los beneficios de la germinación y la alta aceptabilidad del Phaseolus, resulta interesante explorar otras formas de consumo a fin de diversificar su uso e incentivar su producción, pero sin olvidar que al introducir nuevos procesos, la salud del consumidor pudiera estar comprometida. El objetivo de este estudio fue evaluar la calidad microbiológica de semillas germinadas de dos variedades de P. vulgaris.

Se utilizaron semillas de Phaseolus vulgaris v. Tacarigua, las cuales son de color negro, y P. vulgaris v. Canadian: Matterhorm, de color blanco, suministradas por el Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA), Venezuela. Comúnmente, en Venezuela las semillas del género Phaseolus son conocidas como caraotas. Las seleccionadas fueron consideradas variedades puras.

Las semillas de Phaseolus fueron enjuagadas con agua, desinfectadas por remojo en una solución de hipoclorito de sodio 2% y nuevamente lavadas. Las semillas saneadas se remojaron en agua potable en una relación 1:3 (p/v) durante 6h y luego se extendieron sobre bandejas previamente lavadas y desinfectadas en una capa de ~3cm de espesor y germinadas a 25 ±2°C a la luz del día en un ambiente con humedad relativa de 78 ±4% durante 5 días. Las semillas fueron rociadas diariamente con agua potable. El fondo de las bandejas estaba perforado para permitir que drenara el exceso de agua. En la Figura 1 se muestra el esquema de procesamiento y los análisis realizados a las semillas sin germinar y germinadas. El proceso de germinación fue repetido 5 veces. Con fines comparativos, se analizaron las semillas secas sin germinar.

La muestra (25g) se pesó asépticamente en una bolsa estéril con una cantidad apropiada de agua peptonada tamponada (Difco, Detroit, MI, EEUU) para obtener la dilución 10^-1 y se homogenizó durante 2min en un Stomacher®. Se realizaron diluciones seriadas en agua peptonada tamponada al 0,1%, para hacer el recuento de bacterias aerobias mesófilas totales, coliformes totales, Escherichia coli, mohos y levaduras en semillas sin germinar y germinadas. Se investigó la presencia de Salmonella, Listeria monocytogenes y E. coli O157:H7. Se hizo contaje de Bacillus cereus solo en las semillas germinadas. Los análisis se realizaron por duplicado.

Aerobios mesófilos. Se emplearon placas de recuento rápido Petrifilm^TM 3M^TM (3M, St. Paul, Minn., EEUU) para aerobios mesófilos (APHA, 1998). Las placas fueron incubadas a 37ºC durante 24h. Las unidades formadoras de colonias (UFC) típicas de aerobios mesófilos (color rojo) fueron enumeradas usando un contador de colonias Darkfield Quebec® (American Optical Corporation, Buffalo, NY, EEUU).

Coliformes/Escherichia coli. Se utilizaron placas para el recuento rápido de E. coli/coliformes Petrifilm^TM 3M^TM (3M, St. Paul, Minn., EEUU; APHA, 1998). Para los coliformes, las placas fueron incubadas a 37°C durante 24h y se contaron colonias rojas asociadas a burbujas de gas. Para E. coli se incubaron a 37°C durante 48h y se contaron las colonias azules con producción de gas.

Mohos y levaduras. Se utilizaron placas para recuento rápido de mohos y levaduras Petrifilm^TM 3M^TM (3M, St. Paul, Minn, EEUU; APHA, 1998), y se incubaron a 25ºC por 3 a 5 días. Se enumeraron colonias filamentosas verdes con bordes irregulares típicas de mohos y colonias azules con bordes bien definidos como levaduras.

Listeria monocytogenes. Se utilizó la prueba rápida de antígeno-anticuerpo OXOID Listeria Rapid Test FT0401, con dos pasos de enriquecimiento, seguidos por un inmunoensayo con el formato Clearwiew^TM y resultados visibles en 20min. La muestra de 25g fue mezclada con 225ml de caldo Fraser (FB) CM0895, homogeneizada en un Stomacher® durante 2min e incubada a 30ºC durante 24h. Luego, 0,1ml de este caldo fue transferido a 10ml del caldo BLEB (Buffered Listeria Enrichment Broth, CM0897, Oxoid Ltd, Basingstoke, Hampshire, RU) suplementado (Selective Enrichment Supplement, SR0141) e incubado a 30°C durante 21-24h. Se tomaron 2ml del tope del tubo que contiene el caldo BLEB, se transfirieron a tubos estériles y se calentaron en un baño a 80ºC durante 20min, siendo posteriormente enfriados a temperatura ambiente. Sobre el dispositivo con anticuerpos específicos se colocaron 135µl del caldo BLEB, que contiene el antígeno extraído, sobre la ventana de muestra y se esperaron 20min para así evidenciar la presencia presuntiva de L. monocytogenes por la aparición de una línea azul en el área de la muestra (reacción positiva antígeno-anticuerpo) que subsecuentemente fue confirmada siguiendo el método de Hitchins (1998).

Salmonella. Se utilizó el kit comercial OXOID Salmonella Rapid Test FT0201 diseñado para la detección presuntiva de salmonelas móviles (Andrews y Hammack, 1998). Se hizo un pre-enriquecimiento de 25g de muestra en 225ml de agua peptonada tamponada a 35ºC durante 18h, el cual se inoculó en un envase que contenía dos tubos para pruebas rápidas (A y B) y se incubó a 41ºC durante 24h. Los tubos contienen en el fondo un medio selectivo para Salmonella y en la parte superior un medio indicador, separados entre sí por una membrana porosa. La presencia de Salmonella se evidenció por su migración desde la parte más baja a la parte más alta en uno o en ambos tubos, provocando un cambio de color del medio indicador. Las muestras positivas para Salmonella fueron confirmadas de acuerdo a la metodología estándar (Andrews y Hammack, 1998).

E. coli O157:H7. Una muestra de 25g fue mezclada con 225ml de caldo de enriquecimiento para enterobacterias (EEB; Difco), homogeneizados en un Stomacher® e incubados a 30ºC durante 24h. Posteriormente se realizó una siembra en superficie de 0,1ml de caldo en Agar MacConkey Sorbitol suplementado con cefixima y telurito de potasio (TC SMAC; Difco) y se incubó a 35-37°C durante 18-24h. Las bacterias fermentadoras del sorbitol aparecen como colonias rojas a rosadas en el medio TC SMAC. Las colonias típicas de E. coli O157:H7 son neutras o grises con un punto oscuro en el centro y un diámetro de 1-2mm. Estas colonias se confirmaron empleando la metodología estándar (Feng et al, 1998).

Bacillus cereus. Se utilizó el método de siembra en superficie usando el agar yema de huevo sal polimixina (MYP; APHA, 1998). Las placas fueron incubadas a 37ºC durante 24h y las colonias rosadas, rodeadas de una zona turbia indicativa de la producción de la lecitinasa, se consideraron presuntivas de B. cereus. Cinco de estas colonias fueron transferidas a agar nutritivo inclinado para la confirmación de B. cereus (Rhodehamel y Harmon, 1998).

En la Figura 2 se presentan los resultados de los recuentos de aerobios mesófilos, coliformes totales, E. coli, mohos y levaduras en semillas sin germinar de semillas de Phaseolus negras y blancas. Las poblaciones de coliformes y mohos en los granos sin germinar fueron mayores en los granos negros. Los recuentos de aerobios mesófilos de ambas variedades fueron similares a los de semillas de alfalfa (Prokopowich y Blank, 1991), germinados de judías y granos de arroz (Piernas y Giraud, 1997). Las diferencias entre las dos variedades de Phaseolus para todos los microorganismos estudiados pueden ser atribuidas al origen de las semillas, suelos contaminados, agua de irrigación, manipulación y almacenamiento inadecuado (NACMCF, 1999). La probabilidad de contaminación se reduce con la aplicación sistemática de las buenas prácticas de la agricultura (BPA) en la producción, acondicionamiento, almacenamiento y transporte de los granos. Las discrepancias observadas entre los recuentos de mohos también pueden estar influenciadas por los valores de actividad de agua (a_w), el cual fue 0,494 para las semillas blancas y 0,650 para las negras. Tales valores previenen el crecimiento de bacterias pero no el de mohos, siendo las especies Aspergillus y Eurotium algunas de las que causan problemas en productos alimenticios secos (Barckett, 1992).

En las Figuras 3 y 4 se muestran las poblaciones de aerobios mesófilos, coliformes totales, E. coli, mohos y levaduras en las semillas negras y blancas, sin germinar y germinadas, respectivamente. Las poblaciones de aerobios mesófilos fueron del orden de 2,10´10¹⁰ UFC/g para los germinados de Phaseolus negras y 8,0´10⁸ UFC/g para los de Phaseolus blancas, lo cual representa un incremento de 5 y 6 unidades logarítmicas comparados con los granos sin germinar. Un incremento similar ha sido observado en germinados de alfalfa y judías (Prokopowich y Blank, 1991; Fu et al., 2001).

Altos recuentos de aerobios mesófilos en germinados se deben a que los microorganismos se reproducen rápidamente en la superficie del grano por las condiciones favorables provistas por el proceso de germinación. El remojo de las semillas también favorece el incremento del recuento de microorganismos presentes inicialmente. Según Prokopowich y Blank (1991) se ha observado un incremento de 10 veces en el recuento de aerobios mesófilos como efecto del remojo en agua durante la noche. Recuentos mayores a 10⁷ UFC/g, limite máximo permitido de acuerdo a las directrices para la manufactura higiénica y venta al por menor de semillas germinadas del Reino Unido (Brown y Oscroft, 1989), revelan una deficiente calidad sanitaria de los granos o del proceso de germinación. La desinfección de los granos secos con una solución al 2% de hipoclorito de sodio disminuye la microbiota natural. Es necesario utilizar en la producción de germinados las buenas prácticas de fabricación (BPF; Gabriel et al., 2007). La combinación de tratamiento con dióxido de cloro y atmósferas modificadas es útil para inhibir la contaminación microbiana y mantener la calidad de semillas germinadas durante el almacenamiento (Jin y Lee, 2007).

En las semillas germinadas no se detectó E. coli, lo cual indica la ausencia de contaminación de origen fecal. Altos niveles de la microbiota acompañante puede limitar la detección de E. coli cuando sus recuentos son bajos. De acuerdo a Brown y Oscroft (1989), en cinco muestras de Phaseolus germinadas dos pueden contener un máximo de 10³ UFC/g de E. coli sin que ello represente un riesgo a la salud. En un estudio de la calidad microbiológica de semillas germinadas vendidas al detal se determinó que el 40% de las muestras mostraba una alta incidencia de E. coli (Abadías et al., 2008). En las semillas germinadas del Phaseolus variedad negra, la población de coliformes totales fue de 3,0´10⁷ UFC/g y en la variedad blanca fue de 3,20´10⁶ UFC/g, lo cual representa un incremento de 5 y 6 unidades logarítmicas, respectivamente, comparado con los granos sin germinar. Este incremento en la población de coliformes es similar a lo reportado en estudios previos (Prokopowich y Blank, 1991; Soylemez et al., 2001). Altos recuentos de coliformes totales no representan un riesgo a la salud, pero debido a su naturaleza fermentativa y proteolítica, contribuyen a la putrefacción del producto, alteración de las características organolépticas, producción de olores desagradables y disminución de la vida útil (Jay, 1998). Las semillas germinadas de Phaseolus negras presentaron una población de mohos de 1,3´10⁴ UFC/g y de levaduras de 1,6´10⁴ UFC/g, que corresponde a un incremento de 1 y 2 ciclos logarítmicos, respectivamente, comparado con los granos sin germinar. Los germinados de Phaseolus blancas presentaron poblaciones de mohos y levaduras de 1,5´10⁴ y 1,0´10³ UFC/g, respectivamente, observando un incremento de 3 unidades logarítmicas para ambos microorganismos, comparado con los granos sin germinar. Soylemez et al. (2001) reportan que una de las principales causas de deterioro de los germinados de alfalfa es el crecimiento visible de mohos y su consiguiente olor, modificando sus características sensoriales. Los tratamientos con cloro combinado con empaques perforados son efectivos en la reducción de la población microbiana de mohos y levaduras sobre las semillas y durante la germinación. El recuento de bacterias coliformes totales y fecales, psicrótrofas y mesófilas son comunes en semillas germinadas procesadas mínimamente (Martínez-Villaluenga et al., 2008)

Los recuentos de B. cereus en las semillas germinadas de Phaseolus negras y blancas fueron de 3,5´10⁵ y 1,2´10⁵ UFC/g, respectivamente, excediendo el limite máximo permitido para germinados, de 10² UFC/ml, de acuerdo a las directrices para la manufactura higiénica y venta al por menor de semillas germinadas del Reino Unido (Brown y Oscroft, 1989). La temperatura (25ºC) generada durante el proceso de germinación favorece la activación de las esporas y la multiplicación del microorganismo, lo cual determinó un incremento de B. cereus entre 10³ y 10⁷ UFC/g durante la germinación de judías, alfalfa y semillas de trigo (Harmon et al., 1987).

La presencia de L. monocytogenes fue negativa en las dos variedades estudiadas, sin germinar y germinadas. De acuerdo a las directrices para la manufactura higiénica y venta al por menor de semillas germinadas del Reino Unido, el recuento en germinados debe ser <10² UFC/g (Prokopowich y Blank, 1991). L. monocytogenes es un microorganismo psicrotrófico y ubicuo, capaz de resistir temperaturas entre 50 y 55ºC, y bajos niveles de a_w y pH. Durante la germinación de alfalfa, L. monocytogenes fue capaz de proliferar alcanzando niveles alrededor de 10⁶ UFC/g en 48h y el recuento permaneció constante cuando los germinados fueron subsecuentemente almacenados a 41ºC durante 7 días (Palmai y Buchanan, 2002). En semillas germinadas vendidas al por menor, L. monocytogenes fue encontrada en el 0,7% de las muestras (Abadías et al., 2008).

La presencia de E. coli O157:H7 fue negativa en las dos variedades, sin germinar y germinadas. Se ha observado que E. coli O157:H7 es capaz de sobrevivir en semillas y multiplicarse en germinados. En semillas de alfalfa se ha observado la capacidad de la E. coli O157:H7 de sobrevivir en almacenamiento a 37ºC durante 8 semanas (Charkowski et al., 2002).

La germinación de Phaseolus vulgaris variedades negra y blanca incrementó significativamente la población de aerobios mesófilos, coliformes totales, mohos y levaduras con respecto a las semillas sin germinar. No se detectó la presencia de patógenos como Listeria monocytogenes, Salmonella y Escherichia coli O157:H7 en las semillas germinadas, sin embargo, se observaron altos recuentos de Bacillus cereus, lo que representa un riesgo a la salud de los consumidores. Adicionalmente, si se considera que los germinados se almacenan en refrigeración por varios días antes de su consumo, podría esperarse que la carga microbiológica aumentara y representar un riesgo a la salud.

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