SUMMARY

Sucrose concentration and container gas exchange are factors that influence the characteristics of micropropagated and acclimatized plantlets. Apical buds of the rootstock of the R110 (Vitis rupestris´Vitis berlandieri) grapevine were cultivated in media containing 0, 43.8, 87.6, 131.4, and 175.2mM sucrose, in containers with or without complementary gas exchange. After 13 days of growth, the plantlets were transplanted and placed in a greenhouse, where they remained for nine weeks. Percentage of rooting, number and length of the roots, bud size, weight of fresh material and water content in vitro, all decreased with the increase in the concentration of sucrose, the change being more pronounced in containers with gas exchange. In the acclimatization stage, sucrose concentration and type of container did not influence the number and length of the roots. However, bud size, number of leaves, and water content were lower in the plantlets growing with 175.2mM sucrose in containers with gas exchange. The survival rate was 100% after nine weeks with 43.8mM of sucrose in containers without exchange, and with 43.8 and 87.6mM in containers with gaseous exchange.

RESUMO

A concentração de sacarose e o intercâmbio gasoso do contenedor são fatores que influencíam nas características das plantas micropropagadas e aclimatizadas. Devido ao anterior, se cultivaram in vitro brotes apicais do porta-enxerto de videira R110 (Vitis rupestris×Vitis berlandieri), en medio de cultivo com 0, 43,8; 87,6; 131,4 e 175,2mM de sacarose, em contenedores com ou sem intercâmbio gasoso complementar. Depois de 13 dias de cultivo, as plantas foram transplantadas e colocadas em estufa onde permaneceram por nove semanas. In vitro, a porcentajem de enraizamento, número e tamanho de raízes, tamanho de brotos, peso de materia fresca e conteúdo de água diminuiram com o incremento da concentração de sacarose, de manera más acentuada nos contenedores com intercâmbio gasoso. Na etapa da aclimatização, a concentração de sacarose e o tipo de contenedor não influenciaram no número e tamanho das raízes. Entretanto, o tamanho de brotos, número de folhas e o conteúdo de água foram menores nas plantas que cresceram com 175,2mM de sacarose em contenedores sem intercâmbio gasoso. A sobrevivência foi de 100%, depois de nove semanas, com 43,8mM de sacarose em contenedores sem intercâmbio e com 43,8 ou 87,6mM, em contenedores com intercâmbio gasoso.

PALABRAS CLAVE / Adaptación ex vitro / Contenedor / Fuente de Carbono / Intercambio Gaseoso / Micropropagación / Vitis /

Aún cuando la micropropagación ha sido utilizada extensivamente para la multiplicación de numerosas especies, su uso a escala comercial es restringido debido a la pérdida de plántulas al ser transferidas a invernadero (Pospíšilová et al., 1999), debido a las diferencias que existen entre las condiciones, tales como intensidad luminosa, temperatura, humedad relativa, sustrato sin azúcar y condiciones no estériles, en que se desarrollan las plantas in vitro e in vivo. Además, las plántulas propagadas in vitro poseen características anatómicas y fisiológicas diferentes de las cultivadas convencionalmente: cutícula más delgada en las hojas (Majada et al., 2000), funcionamiento deficiente de los estomas (Shackel et al., 1990), células en empalizada no uniformes (Fabbri et al., 1986; Smith et al., 1986), tejidos hiperhidratados (Majada et al, 2000), y modificación en el sistema vascular (Piccotino et al., 1997), entre otras. Además, la condición fisiológica y las características intrínsecas de las plántulas cultivadas in vitro tienen influencia en la supervivencia en invernadero. Por ello se han utilizado algunas estrategias para que las plántulas producidas in vitro se asemejen a las propagadas convencionalmente; tal es el caso de reducir o eliminar la fuente de azúcar en el medio de cultivo (Zobayed et al., 2000), incrementar la intensidad luminosa en el cuarto de incubación (Wilson et al., 2001) y elevar la concentración de CO₂ dentro de los contenedores (Heo et al., 2001). También se disminuye la humedad relativa dentro de los contenedores para estimular cambios significativos en el crecimiento, anatomía y fisiología de las plántulas (Nguyen et al., 2001). Las respuestas al enraizamiento y crecimiento de las plántulas varían con el genotipo, concentraciones de sacarosa y condiciones de cultivo. Así, el aumento en la concentración de sacarosa influyó de manera negativa en el enraizamiento y número de raíces en Vitis, hybrido ‘Remaily Seedless’ (Chée y Pool, 1988), por lo que se prefiere eliminar (Han et al., 2003), reducir (Blazina et al., 1991) o mantener la concentración de sacarosa utilizada en la etapa de multiplicación (Thomas, 2000). La aclimatización se puede mejorar si se incrementa la concentración de sacarosa en el medio de cultivo, debido a la producción de biomasa durante el crecimiento in vitro, que persiste aún después del transplante (Fila et al., 1998); tras 30 días obtuvieron 100% en la aclimatización del portainjerto de Vitis vinifera ‘Chasselas’´Vitis berlandieri 41B, al emplear en medio con 18,3; 36,4; 73,0 y 109,6mM de sacarosa. Otro aspecto importante a considerar es el potencial osmótico. George (1993) comenta que el azúcar, además de actuar como fuente de carbohidratos, modifica el potencial osmótico del medio. En estas condiciones, el estrés causado por la reducción del potencial osmótico disminuye el crecimiento, debido a señales generadas en las raíces por las hormonas (Munns, 2002).

El uso de contenedores con intercambio gaseoso durante el cultivo in vitro, puede incrementar la tasa de supervivencia ex vitro en Delphinium y Hosta (Murphy et al., 1998) y Rehmannia glutinosa (Cui et al., 2000). Por su parte, Shim et al., (2003) sugieren que el intercambio gaseoso es el factor clave para incrementar la supervivencia durante la aclimatización y permite la reducción del periodo de trasplante para la producción de portainjertos de Vitis. Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto del uso de diferentes concentraciones de sacarosa en contenedores con o sin intercambio gaseoso en el enraizamiento y aclimatización de plántulas del portainjerto de vid R110 enraizadas in vitro.

El estudio se llevó a cabo en el Laboratorio de Cultivo in vitro del Programa de Fruticultura y en el invernadero de las instalaciones del Colegio de Postgraduados en Montecillo, Estado de México, México.

Se utilizaron brotes apicales de ~15mm del portainjerto de vid R110 (Vitis rupestris´V. berlandieri) multiplicados in vitro. Los explantes se establecieron en dos tipos de contenedores de policarbonato de 7,62´7,62´10,16cm (Magenta GA-7, Sigma). El primer tipo consistió de contenedores intactos, sin intercambio gaseoso complementario, y el segundo grupo tenía una perforación de 1,33cm² a un lado del contenedor a 5cm de la base, cubierta con papel filtro Whatman N° 42 con poros de 2,5µm, para el intercambio gaseoso complementario. En los contenedores se depositaron 50ml del medio de cultivo utilizado por Villegas et al (1991), complementado con 0,1µM de ácido indolacético (AIA); 6,5g·l^-1 de agar agar (Merck) y cinco niveles de sacarosa Sigma (0; 43,8; 87,6; 131,4 y 175,2mM), que corresponden a potenciales osmóticos calculados de -0,113; -0,218; -0,323; -0,428 y -0,534MPa, respectivamente. La sacarosa y el agar se incorporaron al medio antes de ajustar el pH a 5,7 y se procedió a la esterilización a 121°C y 20lb durante 15min. En condiciones asépticas, se sembraron nueve explantes por contenedor, que fueron mantenidos en cuarto de incubación con 25 ±2°C, 16h de fotoperiodo con intensidad luminosa de 76µmol·m^-2·s^-1, producida a partir de lámparas fluorescentes blancas frías. Después de 13 días de cultivo in vitro, las plántulas se trasplantaron a vasos de unicel N°6, que contenían mezcla de peat moss y agrolita en proporción 1:1 (v/v), cubiertos con vasos transparentes N° 12, utilizados como domos. Antes del transplante, las raíces de todas las plántulas fueron podadas a 1cm, enjuagadas y posteriormente mantenidas durante 2min en solución de Captán (2g·l^-1). Los vasos con las plántulas fueron mantenidos en invernadero cubierto por malla sombra al 50%. A los siete días del trasplante se retiraron los domos, durante 10min en el primer día, 20min en el segundo, 30min en el tercero, 1h en el cuarto, 2h en el quinto, 4h en el sexto y 8h en el séptimo día. En el día ocho, se retiraron completamente los domos. A partir de esa fecha se encendieron lámparas fluorescentes blancas frías de las 18:00 hasta las 22:00, para que el fotoperiodo fuera de 16h. Después que los domos fueron retirados, las plántulas se regaron cada tres días con agua destilada.

In vitro. Después de 13 días de cultivo, se evaluó el porcentaje de enraizamiento, número y longitud de raíces, tamaño de brotes, peso de materia fresca y seca de la parte aérea, así como contenido de agua en los tejidos.

In vivo. A las tres y nueve semanas del trasplante, se determinaron el número y longitud de raíces, número de hojas, tamaño de brotes, peso de materia fresca y seca, contenido de agua de la parte aérea, y tasa de supervivencia.

Para el experimento in vitro se utilizó un diseño experimental con bloques completamente al azar con arreglo factorial 5'2. Los factores fueron concentración de sacarosa (0; 43,8; 87,6; 131,4 y 175,2mM) y tipo de contenedor (con o sin intercambio gaseoso complementario). Cada tratamiento estuvo compuesto por cuatro repeticiones de un contenedor Magenta con nueve explantes (36 explantes). Para las variables número y tamaño de raíces, se tomaron datos de las 360 plántulas. Para determinar el peso de materia fresca, seca y contenido de agua, se utilizaron tres plántulas de cada contenedor (120 plántulas). Las seis plántulas restantes de cada contenedor (240 en total) se utilizaron para la etapa de aclimatización. La respuesta in vitro fue analizada por regresión para determinar las tendencias, y para la aclimatización mediante análisis de varianza y comparación de medias con la prueba de la diferencia mínima significativa protegida por el procedimiento MIXED (SAS, 1999).

En general, para todas las variables evaluadas in vitro, la respuesta de los explantes que permanecieron en los contenedores sin intercambio complementario fueron mayores que en los contenedores con intercambio. Esta respuesta no coincide con lo encontrada por Smith et al (1992), donde el uso de contenedores con intercambio gaseoso favoreció el enraizamiento de Vitis vinifera.

La sacarosa influyó negativamente en el enraizamiento (R²= 0,95), número y tamaño de raíces (R²= 0,97 y R²= 0,86, respectivamente), así como el tamaño de brotes (R²= 0,85), para las plantas propagadas en contenedores con o sin intercambio gaseoso (Figura 1). Las mejores concentraciones de sacarosa para las variables estudiadas fueron de 0 ó 43,8mM. La reducción del enraizamiento y crecimiento se debe a la disminución del potencial osmótico que dificulta la absorción de agua y nutrientes del medio de cultivo (Aguilar et al., 2000; Cárdenas y Villegas, 2002). El efecto negativo del potencial osmótico en el enraizamiento ha sido comprobado en Vitis (Dami y Hughes, 1995) y Saintpaulia ionantha (Sawwan et al., 1998). Al utilizar contenedores con intercambio gaseoso complementario, la reducción en los valores de las variables estudiadas fue mayor que en los contenedores sin intercambio gaseoso; principalmente con 175,2mM de sacarosa (-0,534MPa), lo que se pudo corroborar con las regresiones (Figura 1). Las respuestas al enraizamiento y crecimiento de las plántulas varían con el genotipo y condiciones de cultivo, tal como se observó en este trabajo y por otros autores (Raya et al., 2009), por lo cual es necesario definir las condiciones de enraizamiento para cada especie y portainjerto.

El peso de la materia fresca de la parte aérea disminuyó con el incremento de la sacarosa, mientras que el peso de materia seca tuvo la tendencia de aumentar, tendencia que fue más clara en contenedores con intercambio gaseoso (Figura 2). Ha sido reportado que el incremento de sacarosa en el medio de cultivo aumenta tanto el peso de materia fresca como el de materia seca (Kubota et al., 2002; Shim et al., 2003); de igual forma, el peso se favorece al utilizar contenedores con intercambio gaseoso (Lucchesini et al., 2001; Nguyen et al., 2001). Lo anterior se debe a que al aumentar el contenido de sacarosa, el potencial osmótico del medio disminuye (Cárdenas y Villegas, 2002) y se limita la absorción de agua, pero se favorece el ingreso de sacarosa y con ello el aumento de materia seca.

Otra alternativa para favorecer el crecimiento de las plántulas in vitro, es promover la fotosíntesis controlando niveles de luz y CO₂, (Zobayed et al., 2000; Heo et al., 2001; Wilson et al., 2001). Se observó que el contenido de agua no varió en ausencia de sacarosa, entre ambos tipos de contenedores. Sin embargo, cuando la concentración se incrementó hasta 175,2mM, esta variable disminuyó 16 y 23%, en contenedores sin y con intercambio gaseoso complementario (Figura 2). Calvete et al. (2002) al propagar plántulas de Fragaria´ananassa ‘Campinas’ durante tres semanas in vitro, observaron disminución en el contenido de agua de 90 a 82%, en la parte aérea, cuando incrementó de 0 a 175,2mM la concentración de sacarosa. En el presente trabajo, tanto la materia fresca como el contenido de agua disminuyeron y el peso de la materia seca aumentó, lo que pone de manifiesto el efecto de esta fuente de carbono como modificador del potencial osmótico del medio de cultivo, además de aportar energía a las plántulas.

La concentración de sacarosa y el tipo de contenedor utilizados durante el cultivo in vitro, no afectaron el número y tamaño de las raíces de las plántulas durante el establecimiento en invernadero. Por otra parte, el tamaño de brotes y el número de hojas disminuyeron al aumentar la concentración de sacarosa (Tabla I). Se observó, de manera general, que durante el período de adaptación de las plántulas a las condiciones ex vitro (tres semanas) prácticamente no hubo crecimiento. A partir de ese momento hasta las nueve semanas, con excepción del número de raíces, incrementaron todas las demás variables estudiadas (Tabla I). Se pudo observar que en las primeras semanas del trasplante a suelo, crecen más las raíces que la parte aérea. En las plantas crecidas en ausencia de sacarosa en contenedores sin intercambio gaseoso, la relación parte aérea/raíz fue de 2,35 a las tres semanas y disminuyó a 0,31 a las nueve semanas. La mayor diferencia se observó al utilizar 175,2mM de sacarosa en contenedores sin intercambio gaseoso complementario, donde la relación fue de 5,69 a las tres semanas y disminuyó a 0,20 a las nueve semanas. Esto demuestra que de las cuatro a las nueve semanas crece más la parte aérea, tendencia que es mayor en las plantas que se desarrollaron en medios con concentraciones de sacarosa <87,6mM. Debido a que en los primeros días las plántulas no tienen actividad fotosintética, las reservas almacenadas en los explantes vienen a ser un factor importante durante la aclimatización. Por ello el trasplante se debe realizar cuando las raíces tengan 1-1,5cm, situación que se logra antes de los 15 días, dependiendo de la especie y nó a los 28 días como en muchos casos sucede (Raya et al., 2009). Estos resultados son contrarios a los de Shim et al. (2003), quienes señalaron que el intercambio gaseoso fue más importante que la concentración de sacarosa para el crecimiento del portainjerto de Vitis ‘5BB’ en condiciones ex vitro. El hecho que el tipo de contenedor no tenga influencia en las variables estudiadas puede ser debido al poco tiempo que las plántulas permanecieron en cultivo in vitro. Se consideró hacer el trasplante a los 13 días porque la mayor parte de las plántulas ya tenían raíces >1cm; además, fue necesario podar las raíces para uniformizar esta variable y facilitar el trasplante. En estudios previos (datos no mostrados) se determinó que plántulas con raíces de 1cm, eran capaces de establecerse fácilmente en el suelo. Este método se implementó tomando en cuenta lo indicado por Thomas y Ravindra (1997), quienes para facilitar el trasplante y economizar tiempo en la etapa de aclimatización, utilizaron plántulas de Vitis vinifera ‘Arka Neelamani’ con raíces podadas.

El peso de materia seca de la parte aérea se incrementó a las tres semanas en invernadero en relación al cultivo in vitro; principalmente en las plántulas crecidas en ausencia de sacarosa y contenedores con intercambio gaseoso, donde aumentó 95% (Tabla II). Por otra parte, el contenido de agua disminuyó, lo cual implica que las plántulas cultivadas in vitro poseen mayor cantidad de agua. Estos resultados concuerdan con los de Fila et al. (1998) quienes comentan que la aclimatización se puede mejorar si se incrementa la concentración de sacarosa en el medio de cultivo, debido a la mayor producción de materia seca in vitro.

A las nueve semanas de cultivo en invernadero, el peso de materia fresca y seca de la parte aérea de las plántulas no fueron influenciados por las condiciones de cultivo in vitro; sin embargo, el contenido de agua fue menor en las plántulas cultivadas en contenedores sin intercambio gaseoso y con 175,2mM de sacarosa (Tabla II). Ello implica que el efecto de los tratamientos in vitro es importante en las primeras semanas.

La supervivencia fue de 100% en contenedores con y sin intercambio gaseoso y 43,8mM de sacarosa y en contendores con intercambio gaseoso y 87,6mM de sacarosa, mientras que los menores porcentajes se obtuvieron en ausencia de sacarosa o en concentraciones ³131,4mM (Tabla II). Por lo tanto, se considera que estos tratamientos afectaron negativamente la supervivencia, aspecto que puede estar relacionado en el primer caso (sin sacarosa) a la falta de energía y en el segundo (niveles altos) al potencial osmótico. En los contenedores con intercambio gaseoso, la supervivencia fue de 100% con 43,8 y 87,6mM de sacarosa. Sin embargo, al utilizase 175,2mM la supervivencia se redujo a 62,5% (Tabla II). Esto significa que las plantas necesitan de una fuente de energía, durante la etapa de crecimiento in vitro, para poder sobrevivir en la etapa de aclimatización. Sin embargo, el exceso de sacarosa, disminuye el potencial osmótico del medio de cultivo y con eso la absorción de agua y nutrientes del medio de cultivo (Calvete et al., 2002). En este trabajo las plantas que tuvieron menor tamaño y reservas almacenadas, murieron en la etapa de aclimatización. Shim et al. (2003), al cultivar plántulas del portainjerto de Vitis ‘5BB’ en medio sin o con 87,6mM de sacarosa en contenedores sin y con intercambio gaseoso, obtuvieron 100% de supervivencia en todos los tratamientos. Eso indica que los genotipos de vid responden de manera diferente a la aclimatización, dependiendo de la concentración de sacarosa y tipo de contenedores en que fueron cultivados.

Las plántulas aclimatizadas en invernadero en las tres primeras semanas desarrollan la raíz y a partir de la cuarta semana la parte aérea. Esta respuesta es mayor en las plantas desarrolladas in vitro en 43,8y 87,6mM de sacarosa.

El intercambio gaseoso del contenedor no afectó el porcentaje de supervivencia, pero sí la concentración de sacarosa, donde niveles superiores a 131,4mm fueron negativos.

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