Susceptibility of Vasconcellea cauliflora to Papaya ringspot virus.

A. Gonzalez¹ y G. Trujillo².

¹Fundación para la Investigación Agrícola Danac, Apdo. 182, San Felipe. Yaracuy.

²Universidad Central de Venezuela, Facultad de Agronomía, Sección de Fitopatología, Apdo. 4579, Maracay 2101. Email: gonzalexda@yahoo.com; gus202@cantv.net

Resumen

Esta investigación demostró la susceptibilidad de Vasconcellea cauliflora, especie que ha sido considerada como resistente al virus de la mancha anillada de la lechosa (PRSV-P). La transmisión de la enfermedad se logró mediante la inoculación mecánica de una cepa severa del PRSV-P en plantas de 60 días de edad. Estas evidenciaron síntomas de necrosis del cogollo en 8,3% bajo condiciones de invernadero a 25,15ºC y 78,68% HR promedio. Bajo condiciones de campo en la Facultad de Agronomía (UCV), Maracay (440 msnm), se contabilizó el 8,6% de plantas inoculadas con síntomas típicos de la enfermedad a los siete días del trasplante. Posteriormente se realizó un ensayo bajo condiciones controladas en cámara de crecimiento. Las plantas inoculadas fueron expuestas a tres tratamientos de temperatura e intensidad lumínica: T1= 29ºC y 6300 lux; T2= 27ºC y 5500 lux y T3= 25ºC y 4200 lux; con fotoperiodo de 16 horas de luz y 75,5% HR promedio. Los resultados demostraron la transmisión del PRSV-P en 82, 86 y 47% respectivamente; la sintomatología viral se corroboró mediante el uso de ELISA. Estos resultados cuestionan el uso de esta especie como fuente de genes de resistencia al PRSV-P en los programas de mejoramiento de lechosa.

Palabras clave: Vasconcellea cauliflora, resistencia viral, PRSV-P, ELISA.

Abstract

This work demonstrated the susceptibility of Vasconcellea cauliflora, a species considered as virus resistant to Papaya ringspot virus (PRSV-P). Disease transmission by mechanical inoculation of PRSV-P severe strain on 60 days old plants was corroborated. Under greenhouse conditions with average values of 25.15ºC and 78.68% RH, 8.3% of plants inoculated with the severe strain showed apical necrosis. At the Facultad de Agronomía (UCV), Maracay (440 msnm) under field conditions, 8.6% of inoculated plants showed typical symptoms of the disease seven days after beings transplanted. Subsequently, an inoculation test was done in three growth chamber conditions: T1=29ºC and 6300 lux; T2= 27ºC and 5500 lux and T3= 25ºC and 4200 lux; the daily time was fixed at 16 h, and the relative humidity was about 75.5% on average. Systemic symptoms were observed in 82, 86 and 47% of plants in treatments T1, T2 y T3 respectively. These results were consistent with the ELISA test. The susceptibility of V. cauliflora to the local severe strain of PRSV-P was influenced by temperature and light intensity conditions. This questions the role of this species in search for PRSV-P resistance genes in papaya breeding programs. ]]> Key words: Vasconcellea cauliflora, virus resistance, PRSV-P, ELISA.

Recibido el 1-12-2003 ● Aceptado 26-5-2004

Introducción

En el ámbito mundial, la enfermedad producida por el virus de la mancha anillada de la lechosa (PRSV-P) constituye la limitante más importante por los efectos destructivos causados en la producción de lechosa (Carica papaya L.). El PRSV-P es un Potyvirus transmitido por áfidos de manera no persistente, el cual produce mosaico, clorosis y distorsión en las hojas, lesiones de manchas grasientas en pecíolos, tallos y manchas características en forma de anillo en los frutos. La enfermedad reduce los rendimientos y por último puede ocasionar la muerte de las plantas (11, 26, 27).

La principal atención ante los problemas del mejoramiento genético de la lechosa está enfocada a la búsqueda de resistencia contra el PRSV-P (11, 20, 21, 28). En el germoplasma de lechosa se han encontrado niveles moderados de resistencia (6), pero estos cultivares tolerantes al virus poseen características hortícolas inferiores a los cultivares comerciales (9). Later en 1937 citado por Jensen (15), encontró que Carica cauliflora Jacq., reclasificada recientemente como Vasconcellea cauliflora por Badillo (2), fue inmune a la enfermedad. Sin embargo, Conover en 1962 (4), informó por primera vez sobre la susceptibilidad de V. cauliflora al PRSV-P. En trabajos sobre la resistencia al PRSV-P en caricáceas, Horovitz y Jiménez en 1967 (14) consideran el comportamiento de V. cauliflora como resistente al virus. Hasta hoy, la mayoría de trabajos realizados en diferentes países apoyan la inmunidad o resistencia de la especie silvestre V. cauliflora al PRSV-P (14, 18, 21, 25), la cual se usa frecuentemente en el mejoramiento genético de la lechosa (20, 21), para la obtención de híbridos interespecíficos o intergenéricos (14, 16, 21, 23) mediante el rescate de óvulos fecundados y embriones híbridos in-vitro (18, 21, 24).

En un estudio previo sobre hospedantes de la cepa severa y cepas atenuadas del virus de la mancha anillada de la lechosa (PRSV-P) se incluyó V. cauliflora, en la cual se observaron síntomas parecidos a una reacción de hipersensitividad en una minoría de plantas inoculadas con el PRSV-P severo (13). Se planificó esta investigación para conocer más la relación de susceptibilidad de V. cauliflora ante la inoculación de la cepa severa del PRSV-P e identificar el origen de la posible relación.

Materiales y métodos

Siembra y mantenimiento de plantas. Frutos maduros provenientes de una población silvestre V. cauliflora, fueron colectados en el Parque Nacional Henry Pittier (Estado Aragua). Las semillas se sembraron directamente en bolsas de polietileno de 1 L de capacidad, conteniendo una mezcla esterilizada de arena, tierra y abono orgánico en proporción 1:1:1 v/v. Las plántas (tres x bolsa) fueron mantenidas en cobertizo a prueba de insectos, hasta los dos meses de edad. Se regaron, fertilizaron y se protegieron con pesticidas cada 15 días como medida preventiva. Los ensayos se realizaron en la Sección de Fitopatología de la Universidad Central de Venezuela en Maracay (10º16`13"N y 67º36`18"O), durante el periodo marzo-noviembre de 1999.

Aislamientos virales. Se usó una cepa severa del PRSV-P local, colectada en Facultad de Agronomía (UCV- Maracay) y caracterizada mediante bioensayos (13), que fue multiplicada sobre lechosa como hospedante natural del virus y conservada a -20ºC en el laboratorio de virología.

Inoculación mecánica. Se inocularon 24 plantas de 60 días de edad (dde) de V. cauliflora más un testigo inoculado con agua destilada. En el proceso de inoculación mecánica se tomó una porción congelada de tejido de C. papaya infectado con la cepa viral, la cual se maceró en un mortero estéril y frío con tampón fosfato de potasio 0,01 M con pH 7, en una proporción 1:10 (p/v). El jugo obtenido fue frotado suavemente con los dedos en cuatro hojas expandidas de la parte apical, previamente espolvoreadas con Carborundum 600. Las hojas inoculadas posteriormente se lavaron con agua para eliminar el exceso de abrasivo. Todo el material fue identificado y mantenido en cobertizo a prueba de insectos, con una temperatura 25,15ºC y 78,68% HR promedios durante un mes. ]]> Siembra en campo. Después de un mes las plantas de V. cauliflora inoculadas con el PRSV-P severo y el testigo inoculado con agua fueron aclimatadas en un umbráculo con una temperatura de 29ºC y 75% HR promedio durante una semana, y posteriormente se trasplantaron en una parcela de 64 m². La distancia de siembra fue de 2 m entre plantas por 3 m entre hileras sobre camellón, a razón de 3 plantas por punto. Se realizaron prácticas agronómicas convencionales como fertilización, riego y control de malezas, hongos e insectos.

Bioensayo con tratamientos de temperatura e intensidad lumínica. Bajo un diseño completo al azar 144 plantas de V. cauliflora inoculadas mecánicamente con la cepa severa del PRSV-P, fueron colocadas en una cámara de crecimiento y expuestas a tres tratamientos de temperatura y luminosidad a razón de 48 plantas por tratamiento: el T1 a 29ºC y una intensidad lumínica de 6300 lux (103 uEm² 1¹), el T2 a 27ºC y una intensidad lumínica de 5500 lux (85 uEm² 1¹) y el T3 a 25ºC y una intensidad lumínica de 4200 lux (62 uEm² 1¹). El T1 se obtuvo combinando dos bombillos fluorescentes (F72T12 / D Alto de 56 W, Philips) con ocho bombillos incandescentes de 100 W), el T2 con dos bombillos fluorescentes y seis incandescentes y el T3 con dos bombillos fluorescentes y cuatro incandescentes, todos colocados a una altura de 60 cms del piso de cada entrepaño. En cada tratamiento de temperatura se incluyó un testigo (12 plantas inoculadas con agua). La humedad relativa fue de 75% HR promedio, el fotoperíodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad. Después de cumplir el mes bajo los diferentes tratamientos las plantas inoculadas se reubicaron en umbráculo durante un mes adicional.

Bioensayo de reinoculación en C. papaya. Después de 30 d de la inoculación del bioensayo con los tratamientos, se cosecharon hojas de V. cauliflora con síntomas producidos por el PRSV-P, 5 g de tejido infectado fue usado para inocular 10 plantas de C. papaya cv. Cartagena Amarilla sanas de 60 dde, mediante un proceso de inoculación mecánica similar al descrito, estas plantas fueron evaluadas durante 60 d en cobertizo a prueba de insectos a 25,15ºC y 78,68% HR promedio durante un mes.

Prueba serológica. Para detectar el virus en V. cauliflora inoculada con el PRSV-P severo, se usó un estuche de ELISA fabricado en Francia (Sanofi-Pasteur), con un anticuerpo policlonal polivalente desarrollado para el PRSV-W. Se modificó la concentración del sustrato 4-nitrofenilfosfatasa debido a la coloración débil observada con la cantidad de cromógeno sugerido en el protocolo; el resto del procedimiento fue el sugerido por la casa comercial. Se tomaron 16 muestra compuesta (3 pl./bolsa ) de cada tratamiento, recolectando las hojas que mostraban los mejores síntomas. El valor del tampón se consideró como blanco, se colocaron las muestras al azar y por duplicado para evitar falsos positivos, así como los controles sanos y enfermos (PRSV-W) pertenecientes al estuche de ELISA comercial. Después de una hora de incubación se midió la reacción en nm (nanómetros de densidad óptica) usando un lector de ELISA (Multiskan EX).

Variables medidas. En condiciones de campo, se contabilizaron porcentajes de plantas con síntomas, a partir de los siete días del transplante de las plantas inoculadas. Para determinar el efecto de los tratamientos de temperatura e intensidad lumínica en las plantas inoculadas con la cepa viral, se evaluaron 48 plantas/tratamiento (16 muestras compuestas para ELISA) más los testigos, a partir de la aparición de síntomas. Los datos tomados fueron de manera cualitativa y cuantitativa, considerándose las siguientes variables: 1) Ausencia de síntomas: plantas asintomáticas, ELISA negativo y 2) Con síntomas: mosaico suave a fuerte, moteado suave a fuerte, clorosis, deformación y ELISA positivo. Se consideró una muestra positiva cuando presentaba una densidad óptica dos veces superior a la media obtenidas con los testigos. Los valores de densidad óptica fueron analizados por el programa Statistix 7.0 (Analytical Software, FL. USA).

Condiciones ambientales. A) Durante las pruebas con V. cauliflora en cobertizo y cámara de crecimiento, la temperatura y la humedad relativa fueron medidos diariamente con termohidrógrafo (Göttingen. Typ. 252) y la intensidad lumínica fueron medidas con cuantómetro (Li-cor mod. Li-185B). B) Para la prueba de campo, se analizaron los datos suministrados por Azkúe (1) del CENIAP, haciendo una comparación en los parámetros de temperatura, precipitación, evapotranspiración y humedad relativa del periodo mayo-julio de 1999, en relación con el mismo periodo en el año 1998 y la década 1987-97, registrados en la estación CENIAP Maracay (10ºLN 67ºLO).

Resultados y discusión

Inoculación mecánica y Siembra en campo. A los 14 días después de la inoculación (ddi), 8,3% de las plantas de V. cauliflora inoculadas con el PRSV-P severo mostraron signos de infección con síntomas de necrosis apical o del cogollo parecida a una reacción de hipersensitividad, persistiendo esta sintomatología por un mes durante la permanencia en cobertizo (25,15ºC y 78,68% HR promedio). El total de las 24 plantas inoculadas con la cepa severa del PRSV-P fueron trasplantadas en campo y siete días después del trasplante (ddt) 8,6% mostraron síntomas, aumentando a un 16,6% a los 15 ddt. A los 30 ddt se registró un 50% manteniéndose este porcentaje hasta los 45 ddt; el 100% de infección se alcanzó a los 55 ddt. Hasta ese momento la sintomatología observada fue de hojas con mosaico de un verde intenso hacia tonalidades verde oliva, arrugamiento, clorosis venal con hinchamiento y deformación de la lámina foliar de manera irregular con aspecto filiforme (figura 1A). El testigo V. Cauliflora, mostró signos de infección a los 58 ddt, observándose plantas con achaparramiento, mosaico, clorosis y deformación de las hojas.

Figura 1. Síntomas inducidos por inoculación mecánica del PRSV-P severo local. A) hoja con arrugamiento, reducción de la lámina y aspecto filiforme en V. cauliflora, 30 ddt en campo. B) hoja de V. cauliflora sin síntomas del testigo inoculado con agua en cámara de crecimiento. C) hoja de V. cauliflora con flacidez, abultamiento y aclareo venal a los 21 ddi, perteneciente al T2 en cámara de crecimiento. D) hoja de C. papaya con arrugamiento, abultamiento de las venas y deformación a los 21 ddi, en la reinoculación del PRSV-P severo a partir de tejido infectado de V. cauliflora.

Bioensayo de reinoculación en C. papaya. De los diferentes tratamientos, se extrajo savia de muestras de tejido de hojas de V. cauliflora infectadas con PRSV-P, el cual fue reinoculado mecánicamente sobre lechosa cv Cartagena amarilla, reproduciendo síntomas de mosaicos suaves hasta severos con deformación de la lámina; también se observaron abultamientos de las venas. La transmisión del virus fue efectiva en el 80% de las plantas inoculadas (8/10), observándose los síntomas a partir de los 12 ddi en condiciones de cobertizo (figura 1D).

El trabajo de Lange en 1961 (17) fue considerado en el estudio de las condiciones de crecimiento. Sus resultados indicaron que el óptimo de temperatura medido en incremento de materia seca estuvo entre 17ºC y 30ºC, mientras que el máximo de elongación de las plantas ocurrió cerca de los 30ºC de temperatura. Esta información se extrapoló y fue confrontada con el registro de la estación climatológica, permitiendo el diseño de los tres tratamientos de temperatura usados en este trabajo. Otra información básica utilizada en este estudio es que la temperatura tiene particularmente un efecto marcado sobre la concentración de virus, el óptimo para la acumulación depende de ambos, de la cantidad de patógeno y del hospedante (10). Cerca del intervalo de temperatura en el cual la planta normalmente crece, un incremento de la temperatura usualmente incrementa la tasa de replicación y movimiento del virus a través de la planta (10,22). Los resultados demostraron que la transmisión del virus fue eficaz por medio de la inoculación mecánica en condiciones de cámara de crecimiento.

Prueba serológica. Las plantas de V. cauliflora inoculadas con la cepa severa del PRSV-P que fueron expuestas a los tratamientos 1 y 2, mostraron síntomas y dieron lecturas positivas en la reacción serológica, mientras que las plantas pertenecientes al T3 evidenciaron síntomas y valores débiles pero con tendencia al positivo. El testigo inoculado con agua no mostró síntomas y junto al control sano dieron lectura negativa mientras que el control enfermo resultó positivo (figura 2). Los valores de densidad óptica obtenidos en la prueba de ELISA fueron analizados usando el método no paramétrico de Kruskal y Wallis, detectándose diferencias significativas entre los tratamientos. En la comparación de medias se diferenciaron tres grupos homogéneos, el control enfermo obtuvo un valor promedio de 0,865 nm constituyendo un grupo. El T1 y T2 formaron un grupo intermedio con valores promedios de 0,227 nm y 0,235 nm respectivamente. El T3 con promedio 0,145 nm se encuentra agrupado junto al control sano que tuvo un valor promedio de 0,096 nm, por lo que no se cumplen los parámetros fijados para considerar la reacción del virus en este tratamiento como positivo.

Figura 2. Reacción de V. cauliflora ante el PRSV-P (ELISA) a los 22 días de inoculadas con relación a los tratamientos de temperatura e intensidad lumínica, en condiciones fijas de 16 horas luz y 75,5% de HR promedio en cámara de crecimiento.

Es importante mencionar el papel de la técnica de diagnóstico inmunoenzimática ELISA desarrollada por Clark y Adams (3) y algunas modificaciones hechas a esta técnica en la detección del PRSV-P (12,13). Mediante su utilización en estos ensayos con V. cauliflora se incrementó la seguridad y confiabilidad en los resultados obtenidos, ya que los primeros síntomas de necrosis del cogollo en condiciones de cobertizo a 25,15ºC y 78,68% HR promedio, se consideraron una reacción de hipersensitividad y las lecturas débiles de ELISA en estas plantas condujo a la observación y seguimiento del desarrollo de la enfermedad en cobertizo y campo.

Condiciones ambientales. En condiciones de cobertizo durante el periodo febrero-marzo de 1999, el factor temperatura se mantuvo más o menos estable. En marzo el pico más alto fue de 25,7ºC, mientras que el pico más bajo se registró en el mismo mes con 24,52ºC indicando poca variación en el potencial térmico diario, o condiciones bastante estables. Con relación a la humedad relativa tuvo un comportamiento parecido, registrándose el pico más alto en febrero de 80,18% y el pico más bajo 77,49% en el mismo mes.

En el análisis comparativo de las condiciones climáticas predominantes en el ensayo de campo durante el periodo 1 de mayo al 30 de julio de 1999, la temperatura máxima fue de 32,1ºC en junio de 1999, mientras que en el año 1998 fue de 31,9ºC en mayo y de 32ºC para el mismo mes en la década 87-97. La temperatura mínima fue de 15,6ºC en mayo de 1999, de 19,6ºC en julio de 1998, mientras que en la década 87-97 fue de 18,1ºC en julio. La distribución de la precipitación total en el periodo en estudio fue de 489,2 mm en 1999, en 1998 de 397 mm y en la década 87-97 de 361,6 mm. La evapotranspiración total en el mismo periodo, fue de 691,8 mm en 1999, en 1998 de 393,6 mm y en la década 87-97 de 411 mm. La humedad relativa fue de 64,4% para 1999 y de 80% tanto en 1998 como en la década 87-97. Según este análisis, podemos deducir que el periodo del año 99 donde se realizaron los experimentos fue atípico en relación con los valores promedios del registro de 10 años para la zona y estas condiciones permitieron observar con claridad la sintomatología inducida por el PRSV-P en V. cauliflora en el campo, hecho no citado con anterioridad.

En condiciones de cámara de crecimiento durante el mes de octubre de 1999, los picos más altos de temperatura se registraron a las 2 pm en 38ºC; 37,5ºC y 33,5ºC en los tratamientos T1, T2 y T3 respectivamente; los picos más bajos se registraron a las 7 am en 24,5ºC; 23ºC y 22ºC en los tratamientos T1, T2 y T3 respectivamente. La temperatura promedio fue de 29ºC, 27ºC y 25ºC en los tratamientos T1, T2 y T3 respectivamente. Durante la noche hubo un descenso pero se mantuvo cerca de los 25ºC la mayor parte de la noche. La humedad relativa estuvo entre 71,4% y 78,5%. El fotoperiodo de 16 h luz suplementario con bombillos contribuyó a mantener estas condiciones. También se debe tomar en cuenta que la concentración de virus varía con el tipo de tejido, edad de la planta, del tejido y estado de desarrollo de la enfermedad. Además, la temperatura juega un papel importante en el crecimiento de la planta; ésta influencia el movimiento del virus, la concentración en cada célula infectada y a menudo el porcentaje de células infectadas, afirmando que no siempre coincide la mejor expresión de los síntomas con la mayor concentración de virus (10, 22). Lo anterior explica, porque se observó un aumento de la proporción de plantas con síntomas al ser estas colocadas en condiciones de cobertizo (29ºC y 75% HR) durante los meses de noviembre a diciembre de 1999. ]]> El hecho de que V. cauliflora sea susceptible a la inoculación con la cepa severa del PRSV-P usada, dependiendo de la temperatura y la luminosidad, redefine el papel de esta especie como resistente a la enfermedad (14, 18, 21, 25). En virtud del comportamiento de V. cauliflora en condiciones de cámara de crecimiento, invernadero y campo, compartimos la tesis que un incremento en la temperatura, por encima de cierto punto entre las condiciones normales de crecimiento de la planta, aumenta la tasa de multiplicación del virus disminuyendo el tiempo de aparición de los primeros síntomas. En consecuencia, cambios en la temperatura en la cual las plantas se desarrollan pueden conducir a la multiplicación selectiva de ciertas cepas adaptadas a condiciones particulares (10, 22, 27). No obstante, queda por dilucidar cual fue el factor crítico entre la temperatura y la luminosidad en condiciones de cámara de crecimiento que influyeron en la mejor transmisión y multiplicación del virus expresados en la sintomatología típica de la infección por el PRSV-P, ya que en los diferentes tratamientos se obtuvieron respuestas positivas, hubiera sido interesante comparar en condiciones fijas las temperaturas críticas encontradas (29, 27 y 25ºC) y variar las condiciones de luminosidad y humedad relativa o viceversa.

Para ayudar a dilucidar la controversia existente en torno a V. cauliflora como especie resistente al PRSV-P es obligatorio mencionar a Conover (4,5), el cual reporta por primera vez sobre la susceptibilidad de V. cauliflora al PRSV-P en Florida (USA). El trabajo más citado sobre el comportamiento de V. cauliflora como resistente al PRSV-P fue publicado por Horovitz y Jiménez en Venezuela en 1967 (14). En el presente trabajo tanto la cepas viral como el material vegetal usado en los diferentes ensayos es originario del Estado Aragua, Venezuela, coincidiendo con el origen de las cepas y el material vegetal utilizado en el trabajo de Horovitz y Jiménez (14) y Malaguti et al. (19), la diferencia en los resultados obtenidos en este trabajo con los citados se debe básicamente a la cepa del PRSV-P severo utilizada, la cual se comportó con mayor virulencia y posiblemente a las condiciones ambientales presentes durante los experimentos, este ultimo aspecto lo consideramos una debilidad de esos trabajos porque no detallan o se describen las condiciones experimentales. Además, en las pruebas de adaptación de algunas especies de caricáceas, los resultados de los cruzamientos de C.(V.) goudotiana x C.(V.) cauliflora; C.(V.) monoica x C.(V.) goudotiana y C.(V.) monoica x C.(V.) cauliflora produjeron semilla viable pero las plantas fueron susceptibles al virus a pesar que se esperaba resistencia, inferida al menos por V. cauliflora debido al carácter dominante, dado que la misma se consideró como la única resistente, para entonces estos investigadores no consiguieron una explicación satisfactoria a este fenómeno (28). Sin embargo, otros autores observaron que sólo V. cauliflora y sus híbridos no exhibieron los síntomas de la enfermedad viral (23). Desde el punto de vista genético los trabajos citados presentan diferentes resultados, los cuales deben confrontarse tomando en cuenta la influencia de los factores ambiente y/o cepas.

Conclusiones

Se concluye que los resultados de esta investigación coinciden con los obtenidos por Conover (4,5), Cook (7) y Cook y Milbrath (8) quienes demostraron que V. cauliflora es susceptible a la cepa severa del virus de la mancha anillada de la lechosa (PRSV-P) y diferimos del resto de los investigadores que consideran a esta especie como resistente al virus (14, 18, 21, 25). Finalmente, V. cauliflora puede mostrar los síntomas típicos de la enfermedad producida por el PRSV-P en condiciones experimentales y campo o comportarse como hospedante asintomático, por lo que se alerta a los fitomejoradores y biotecnólogos de la condición de multiplicación o de latencia del virus en esta especie, para no invertir tiempo ni esfuerzo en su utilización como fuente de resistencia para el virus.

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