Elaboración de yogurt con probióticos (Bifidobacterium spp. y Lactobacillus acidophilus) e inulina

Yogurt making by using probiotics (Bifidobacterium spp. and Lactobacillus acidophilus) and Inulin

J.A. Ruiz Rivera y A.O. Ramírez Matheus

Instituto de Química y Tecnología, Facultad de Agronomía, Universidad Central de Venezuela. Apdo. 4579. Maracay 2101. Aragua. Venezuela.

Autor de correspondencia e-mail: ramirezaucv@hotmail.com; javierruizrivera@hotmail.com

Resumen

El propósito de esta investigación fue la elaboración de yogurt firme con incorporación de cepas probióticas (Bifidobacterium spp. y Lactobacillus acidophilus) e inulina. Se utilizó leche cruda proveniente de la estación experimental "Santa María" UCV y leche en polvo comercial, para obtener leche pasteurizada, inulina (Raftiline^® HP), cultivos lácticos de Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus y Streptococcus salivarus subsp thermophilus y cepas probióticas de Bifidobacterium spp. y Lactobacillus acidophilus. Se hicieron tres formulaciones de yogurt: F₁ = Leche pasteurizada + Cultivo Láctico + Cepas Probióticas, F₂ = Leche pasteurizada + Cultivo Láctico + Cepas Probióticas + Inulina, F₃ = Leche pasteurizada + Cultivo Láctico (Control). La leche cruda cumplió con los requisitos establecidos en la norma COVENIN (903:93). Los yogures cumplieron con los requisitos microbiológicos exigidos en la norma COVENIN (2392:01). La formulación 2 (probióticos e inulina), mostró mayor estabilidad fisicoquímica durante el tiempo de almacenamiento y además no presentó el fenómeno de sinéresis.

Palabras clave: Yogurt, Bifidobacterium spp., Lactobacillus acidophilus, inulina, estabilidad, leche cruda.

Abstract ]]> The purpose of this work was developing a solid yogurt with probiotic strains (Bifidobacterium spp. and Lactobacillus acidophilus) and inulin. Raw milk from the Experimental Station "Santa Maria" - UCV, commercial powdered milk, to obtain pasteurised milk, inulin (Raftiline^® HP), lactic culture of Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus and Streptococcus salivarus subsp thermophilus and probiotic strains used Bifidobacterium spp. and Lactobacillus acidophilus were used. There formulations of yogut were made: F1= pasteurized milk + lactic culture + probiotic strains; F2= pasteurized milk + lactic culture + probiotic strains + inulin; F3= pasteurized milk + lactic culture (control). Raw milk fulfill with the requirements of COVENIN rules (903:93). In the same way, yogurts fulfilled with the microbiological standard COVENIN rules (2392:01). The formulation 2 (probiotics and inulin), showed major physicochemical stability during storage time and did not show the syneresis phenomenon.

Key words: Yogurt, Bifidobacterium spp., Lactobacillus acidophilus, inulin, stability, raw milk.

Recibido el 9-7-2008 Aceptado el 2-3-2009

Introducción

El yogurt es un gel de apariencia viscosa, resultante de la acidificación microbiana de la leche. Intervienen en su fermentación ácido láctica las bacterias Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus y Streptococcus salivarus subsp thermophilus, las cuales deben encontrarse en relación 1:1 para una acción simbiótica efectiva (Salvatierra et al., 2004). El yogurt probiótico puede ser un atractivo para los consumidores, porque la incorporación de ciertas bacterias probióticas incrementan el valor terapéutico del mismo y ayuda a los consumidores a ingerir alimentos nutricionales que tengan beneficios adicionales a la salud (Hekmat y Reid, 2006). Para la elaboración del yogurt se requiere leche y fermentos lácticos, siendo importante que la leche cumpla el requisito de estar en óptimas condiciones sanitarias, lo que se logra al ser sometida a proceso de pasteurización, además no debe poseer antibióticos, para que pueda ocurrir la fermentación láctica de manera adecuada, y obtener un producto alimenticio con características fisicoquímicas y microbiológicas aceptables.

Entre las sustancias utilizadas como fuente de fibra dietética de origen natural, se encuentra la inulina, la cual ha sido usada para enriquecer alimentos de fácil consumo, como productos lácteos y de panificación, ya que promueve el crecimiento de bífidobacterias en el intestino; microorganismos que son muy sensibles a los factores del ambiente, por lo tanto su incorporación a los alimentos, como probióticos o suplemento dietético de origen microbiano, con efecto beneficioso para la salud no es fácil. Por esta razón, se ha propuesto como alternativa la adición del prebiótico inulina a los alimentos, por ser una sustancia capaz de estimular la proliferación de las bacterias endógenas del intestino (Gibson y Roberfroid, 1995).

La inulina es un fructano u oligosacárido, cuya estructura básica consiste de unidades de fructosa unido por un enlaces ß (2,1); una molécula de glucosa puede estar enlazada al final de la cadena por un enlace α (1,2) (Zuleta y Sambucetti, 2001). Debido a la presencia del enlace glucosídico ß (2,1), la inulina es resiste a la hidrólisis por las enzimas digestivas del intestino delgado, siendo rápidamente fermentada por las bacterias del colon, por lo que se considera un carbohidrato no digerible, estando hoy clasificada como fibra alimentaria soluble (Clemens, 2001).

Se ha observado que los probióticos tienen efectos más allá del valor nutritivo del alimento, incluyendo la exclusión, antagonismo e inter ferencia con microorganismos patógenos, la inmunoestimulación e inmunomodulación, actividades anticarcinogénicas y antimutagénicas, alivio de los síntomas de intolerancia a la lactosa, reducción de colesterol sérico, reducción de la presión arterial, disminución en la incidencia y duración de diarrea, prevención de vaginitis y mantenimiento de la integridad de las mucosas entre otras. Otros beneficios incluyen la estimulación de la síntesis de vitaminas y producción de enzimas, estabilización de la microflora, y reducción del riesgo de cáncer de colon (Berrocal et al., 2002; Barrante et al., 2004).

Son muchos los microorganismos utilizados como probióticos tanto en animales como en humanos, incluyendo los géneros Bifidobacterium, Bacillus, Streptococcus, Saccharomyces, Aspergillus, Enterococcus, Pediococcus y, el más utilizado de todos el Lactobacillus. La producción de yogurt está basada en la adición de fermentos de Streptococcus salivarius subsp thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus a la leche. Sin embargo, actualmente se considera que la introducción de microorganismos probióticos ha permitido, no sólo mejorar la producción del yogurt, por disminuir la postacidificación, sino también porque actúan como agente terapéutico, generando efectos beneficiosos en las personas que los ingieren (Barrante et al., 2004; Demirer et al., 2006).

No hay acuerdos generales en cuanto a la concentración mínima necesaria del probiótico para alcanzar ventajas terapéuticas. Algunos investigadores sugieren niveles de concentración mayores a 10^-6ufc/ml, otros estipulan concentraciones mayores a 10^-7ufc/ml y 10^-8ufc/ml como niveles satisfactorios (Kailasapathy y Rybka, 1997; Lourens-Hattingh y Viljeon, 2001, Kurmann y Rasic, 1991). ]]> La formulación del yogurt con prebióticos mejora la viabilidad del Lactobacillus acidophilus y del L. casei, en el yogurt durante su almacenamiento refrigerado, especialmente en presencia de la inulina. Se ha demostrado que este polisacárido es mejor estimulante del crecimiento del probiótico que el almidón de maíz; pues bajas concentraciones de la misma son suficientes para estimular el crecimiento y conservar la viabilidad de los organismos probióticos en el yogurt, además de causar un incremento de la viscosidad a diferencia del almidón de maíz (Donkor et al., 2007).

Staffolo et al. (2004) reportaron que en yogurt con inulina se mantuvo estable el color y la actividad de agua; además no experimentó sinéresis durante el almacenamiento, y señalaron que las cualidades sensoriales en este yogurt, no eran perceptiblemente diferentes de las cualidades sensoriales del yogurt control y de los yogures que contenían otras fibras como trigo o bambú. Igualmente Seydin et al., (2005) encontraron en yogures que contenían inulina un buen sabor y una textura lisa.

En productos lácteos fermentados, se ha encontrado que la disminución del pH es incrementado con la adición de inulina, la proporción de grasas de la leche y el cultivo iniciador (Hardi y Slacanac, 2000). Sin embargo, Guven et al., (2005) señalaron que la inulina no afectó el pH ni la acidez titulable en yogurt sin grasa; de igual forma Staffolo et al. (2004) indicaron que en yogurt con inulina el pH se mantuvo sin cambios.

De Oliveira et al. (2005), comentan que en yogures de soya suplementados con cepas probióticas (Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus) e inulina presentaron mayor viscosidad, cohesividad, adhesividad, y la menor dureza en comparación con los no suplementados. Adicionalmente, el yogurt suplementado presentó una buena aceptación del consumidor, por lo que recomiendan el uso de probióticos e inulina para la formulación de yogures o alimentos en general.

Maragkoudakis et al. (2006), al trabajar con diferentes niveles de inóculos (1 y 2%) de cepas probióticas de Lactobacillus y temperaturas de incubación (37 y 42ºC), en la formulación de yogurt, concluyeron que a mayor temperatura y mayor nivel de inóculo, se presentan las mejores propiedades fisicoquímicas y sensoriales del yogurt probiótico, almacenado por 14 días.

En base a lo anteriormente citado, el objetivo del presente estudio fue elaborar un yogurt firme con cepas probióticas (Bifidobacterium spp. y Lactobacillus acidophilus) e inulina, y su evaluación fisicoquímica y microbiológica durante 21 días de almacenamiento a 4ºC.

Materiales y métodos

Se utilizó leche cruda proveniente de la estación experimental "Santa María", además de leche en polvo completa de marca comercial, para la elaboración de leche pasteurizada. Fermentos lácticos: a) Cultivo láctico: cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus y Streptococcus salivarus subsp thermophilus, y b) cepas probióticas: cepas de Bifidobacterium y Lactobacillus acidophilus, e inulina (Raftiline^® HP) marca ORAFTI. La investigación se realizó en la sección de microbiología del Instituto de Química de la Facultad de Agronomía UCV. Se realizaron por triplicado tres (03) formulaciones, las cuales se detallan a continuación, y aparecen en el cuadro 1:

Cuadro 1. Formulaciones del yogurt firme.

F₁ = Leche pasteurizada + Cultivo Láctico + Cepas Probióticas

F₂ = Leche pasteurizada + Cultivo Láctico + Cepas Probióticas + Inulina

F₃ = Leche pasteurizada + Cultivo Láctico (Control)

F₁ = Leche pasteurizada + Cultivo Láctico + Cepas Probióticas

F₂ = Leche pasteurizada + Cultivo Láctico + Cepas Probióticas + Inulina

F₃ = Leche pasteurizada + Cultivo Láctico (Control)

Análisis químicos:

Acidez titulable: COVENIN (658: 97). ]]> pH: Se llevó a cabo mediante un pHmetro marca Standard modelo PHM 62 con un electrodo de vidrio.

Análisis físicos:

Viscosidad: Se utilizó un viscosímetro rotacional de Brookfield

Modelo LVT aguja 4 y velocidad de rotación 30 rpm.

Sinéresis: Se realizó mediante metodología descrita por Staffolo et al., (2004).

Análisis microbiológicos a la leche cruda:

Recuento de coliformes totales: COVENIN (3339:97).

Recuento de bacterias aerobias mesófilas: COVENIN (902:87).

Recuento de mohos y levaduras: Guía de Interpretación 3M Petrifilm Levaduras y Mohos disponible en: http://multimedia.mmm.com/mws/mediawebserver.dyn?6666660Zjcf6lVs6EVs66SCfsCOrrrrQ-)

Análisis estadístico: ]]> Se realizó un diseño completamente aleatorizado, en el cual se aplicó un análisis de varianza, para establecer si existen diferencias significativas entre las variables químicas determinadas en los lotes de leche cruda utilizados en la elaboración del yogurt, además se realizó una prueba de medias de Tukey (α = 0,05). En el caso de las variables fisicoquímicas del yogurt, también se utilizó un diseño completamente aleatorio, con un arreglo factorial (3 x 4), realizando tres (03) formulaciones con tres repeticiones, en cuatro (4) tiempos de almacenamiento (0, 7, 15 y 21 días), dando un total de 12 tratamientos. Se realizó un análisis descriptivo de las variables fisicoquímicas, y un análisis de varianza, seguido de una prueba de comparación de medias de Tukey (α = 0,05) (SAS, 1989).

Resultados y discusión

Caracterización química y microbiológica de la leche cruda:

En el cuadro 2, se observan los valores de pH y acidez de la leche cruda utilizada en los tres procesos de fabricación de los yogures. Ambas variables están dentro del rango establecido por la Norma COVENIN (903:83), para este tipo de producto.

Cuadro 2. Valores de pH y acidez de la leche usada en la elaboración de yogur firme.

Letras distintas en columnas indican diferencias estadísticamente significativas (P≤0,05).

En el cuadro 3, se muestran los valores promedios de coliformes totales y aerobios mesófilos de la leche cruda usada, se observó que esta leche cumple con los requisitos microbiológicos establecidos en la Norma COVENIN (903:83). ]]> Cuadro 3. Valores promedios de coliformes totales y aerobios mesófilos en la leche utilizada para la elaboración de yogur firme.

Formulación de yogurt firme con cepas prebióticas e inulina:

El proceso se llevó a cabo bajo el esquema tecnológico que se indica en la figura 1. Se estableció un tiempo de incubación de 4 horas, porque los fermentos lácticos utilizados en la formulación de los yogures (cuadro 1), provienen de un cultivo madre. En las formulaciones 1 y 2 se utilizaron cepas probióticas y cultivo láctico bajo la denominación comercial "EZAL MY B102 (1%)", y en la formulación 3 (control), se utilizó cepas de cultivo láctico denominadas "Yo FLEX 380 (3%)". La pasteurización se realizó a nivel de laboratorio, los envases utilizados fueron vasos plásticos de 250 ml, y realizados en ambiente natural.

Caracterización fisicoquí-mica y microbiológica de los yogures elaborados durante el almacenamiento:

En el cuadro 4, se presentan los valores iniciales y durante el almacenamiento de pH, acidez y viscosidad de los diferentes yogures elaborados. Los valores iniciales de pH (4,07- 4,64) para los yogures elaborados son similares a los reportados en este tipo de producto, por otros autores (Xanthopoulos et al., 2001; Briceño et al., 2001; Blanco et al., 2006; Pérez, 2005; De Oliveira et al., 2005; Maragkoudakis et al., 2006; Ramírez, 2007), quienes señalan que el pH característico del yogurt está entre 3,8 y 4,5.

Cuadro 4. Cambios en el pH, acidez (% de ácido láctico) y viscosidad (cps) en los yogures durante 21 días de almacenamiento.

Letras minúsculas distintas en columnas indican diferencias estadísticamente significativas (P≤0,05), en los tratamientos para un mismo tiempo.

Letras mayúsculas distintas en columnas indican diferencias estadísticamente significativas (P≤0,05), en un tratamiento para los diferentes tiempos.

F₁ = Leche pasteurizada + Cultivo Láctico + Cepas Probióticas

F₂ = Leche pasteurizada + Cultivo Láctico + Cepas Probióticas + Inulina

F₃ = Leche pasteurizada + Cultivo Láctico (Control).  

A los 21 días de almacenamiento se observó una disminución del pH en las tres formulaciones (F₁= 4,33; F₂= 4,27; F₃= 3,91), lo cual puede atribuirse a que durante el almacenamiento refrigerado ocurre una actividad microbiana residual tal como lo señalan Lubbers et al. (2004), en yogures almacenados durante 28 días bajo refrigeración, lo que afecta el pH. Los valores de pH para cada tiempo de almacenamiento, no presentan diferencias estadísticamente significativas entre las formulaciones. Se observó que en las formulaciones 1 y 2, los valores de pH siempre fueron mayores que los del yogurt control, lo que pareciera indicar que con las cepas probióticas se obtienen yogures menos ácidos, además las cepas probióticas utilizadas, no contribuyeron con la disminución de la postacidificación del producto durante el almacenamiento refrigerado, lo cual es contrario a los planteando por varios autores (Barrante et al., 2004; Heller, 2001; Lourens-Hatting y Viljeon, 2001; Scherezenmeir y de Vrese, 2001; Shah, 2000). Durante los 21 días de almacenamiento refrigerado, los formulaciones 1 y 3 no presentan diferencias estadísticamente significativas, pero si la formulación 2, esto se pudiera deber a que la adición de inulina en productos lácteos fermentados conlleva a una disminución de pH, como lo han reportado otros autores (Hardi y Slacanac, 2000; Lubbers et al., 2004; De Oliveira et al., 2005; Maragkoudakis et al., 2006; Ramírez, 2007).

Con respecto a la acidez, se observa que durante los 21 días de almacenamiento refrigerado no hubo diferencias estadísticamente significativas en las formulaciones. Sin embargo cabe señalar que a los 7 días si hay diferencias estadísticamente significativas entre las tres formulaciones, esto se puede deber a que las bacterias lácticas se estabilizan entre los 10 y 15 días de incubación (De Penna et al., 2003). Los yogures elaborados presentan valores de acidez de 1,01 a 1,79% de ácido láctico, cumpliendo con el criterio establecido en la norma COVENIN (2393:01). Además son similares a los valores reportados por otros autores (Briceño et al., 2001; Ramírez, 2007). Los valores iniciales de acidez se encuentran entre 1,02 y 1,23% y finalizan entre 1,35 y 1,37%, y aunque este aumento no es significativo, puede ser debido al hecho que aún bajo condiciones de refrigeración continúa la producción de acidez por los cultivos iniciadores que siguen fermentando la lactosa presente (Xanthopoulos et al., 2001). En este sentido Adam y Moss (1997), señalan que el almacenamiento bajo refrigeración detiene el crecimiento de los microorganismos del cultivo iniciador, sin embargo la acidez continúa aumentando lentamente, por la actividad residual de las bacterias acidolácticas.

En los valores de viscosidad de los yogures durante el almacenamiento, se presentan diferencias estadísticamente significativas en las formulaciones 2 y 3, no así en la formulación 1, tendiendo a aumentar en las formulaciones 1 y 2, pero a disminuir en la formulación 3. La variación de la viscosidad en esta última formulación, puede estar asociada a los cambios de pH observados en esta formulación, tal como lo indica Wong (1995), quien plantea que la viscosidad del gel disminuye con los pH ácidos, dado que las proteínas se solubilizan a pH bajos. La formulación 2 presenta el mayor valor promedio de viscosidad durante el almacenamiento, lo cual indica que la incorporación de inulina al yogurt influye de manera positiva en su viscosidad, siendo esto validado por Kip et al. (2006) y Ramírez (2007) quienes reportan que la incorporación de inulina afecta la viscosidad del yogurt, por tener una alta capacidad de retención de agua, actuando así como un espesante que forma complejos vía puentes de hidrógeno con las proteínas del yogurt. Los yogures elaborados presentaron una mayor viscosidad en comparación a la reportada por Staffolo et al. (2004) (940-980 cps) y Lubbers et al. (2004) (670-780 cps); e inferior a la señalada por De Oliveira et al. (2005) (21000 cps), Maragkoudakis et al. (2006) (188500-307500 cps) y Donkor et al. (2007) (30450-82050 cps).

Sinéresis del Yogurt: ]]> No se observaron diferencias estadísticamente significativas, en los valores de sinéresis en las tres formulaciones (cuadro 5). En la formulación 2, no se observó este fenómeno quizás debido a la incorporación de inulina. Kip et al. (2006), plantean que la inulina es un agente con capacidad de absorción de agua, además de actuar como un espesante. Staffolo et al. (2004), notaron este mismo comportamiento en yogures elaborados con diferentes tipos de fibra (manzana, bambú, trigo e inulina) a una concentración de 1,30%. Igualmente Ramírez (2007) señaló que ninguno de los yogures elaborados con distintos niveles de inulina presentó sinéresis durante 21 días de almacenamiento refrigerado, probablemente por la capacidad de retención de agua de este polisacárido. Este fenómeno en el yogurt es de suma importancia, porque la presencia de exudado es un factor de rechazo por parte del consumidor.

Cuadro 5. Valores de sinéresis en los yogures a los 21 días de almacenamiento.

Letras distintas en columnas indican diferencias estadísticamente significativas (P≤0,05)

F₁ = Leche pasteurizada + Cultivo Láctico + Cepas Probióticas

F₂ = Leche pasteurizada + Cultivo Láctico + Cepas Probióticas + Inulina

F₃ = Leche pasteurizada + Cultivo Láctico (Control)

Evaluación Microbiológica del Yogurt:

En el cuadro 6, se observan los resultados de la evaluación microbiológica realizada en los yogures a los 0 y 21 días de almacenamiento refrigerado. Todos los yogures elaborados cumplen con los requisitos microbiológicos establecidos en la norma COVENIN (2393:01), que para el caso de mohos y levaduras debe estar entre 10 y 100 ufc/ml y para coliformes entre 4 y 11 ufc/ml, esto puede atribuirse a la adecuada pasteurización de la leche, el y al uso de fermentos lácticos provenientes de un cultivo madre, lo cual garantiza un producto de buena calidad. Por otra parte las condiciones de almacenamiento garantizaron la estabilidad microbiológica de los yogures elaborados. Los yogures formulados no presentaron coliformes totales lo que indica la adecuada calidad higiénica con que fueron elaborados. Adams y Moss (1997), plantean que los microorganismos coliformes no son acidodúricos por lo que no resisten pH bajos y altos valores de ácido láctico, condiciones que se producen en los yogures durante su almacenamiento, debido a que las bacterias acidolácticas se comportan como inhibidoras de otros microorganismos y este comportamiento es la base de su capacidad para mejorar la calidad y la inocuidad de muchos productos alimenticios, siendo algunos factores que coopera en esto, la producción de ácido láctico que conlleva a una disminución del pH, el agotamiento de nutrientes y bajo potencial redox. Por lo general los productos lácteos fermentados se encuentran libres de patógenos y las cepas prebióticas en el yogurt elaborado parecieran acentuar el efecto inhibitorio de este producto sobre algunas bacterias patógenas (Berrocal et al., 2002; Aryana y McGrew, 2007). Igualmente De Oliveira et al., (2005), señalaron que no hubo presencia de mohos y levaduras, coliformes totales y fecales en yogures durante 28 días de almacenamiento, debido a que la viabilidad de las bacterias lácticas protegen al producto de los microorganismos patógenos.

Cuadro 6. Caracterización microbiológica del Yogurt.

F₁ = Leche pasteurizada + Cultivo Láctico + Cepas Probióticas

F₃ = Leche pasteurizada + Cultivo Láctico (Control).

Conclusiones

Se pudo elaborar un yogurt firme con cepas de microorganismos probióticos e inulina, mediante un procedimiento sencillo y repetible; el cual aunque presentó un pH mayor al control, no difirió estadísticamente de éste en cuanto a la acidez y la viscosidad. Durante el almacenamiento refrigerado, se observó una disminución en el pH y un aumento en la viscosidad de este yogurt, lo que pareciera indicar que la inulina afecta significativamente estas variables; específicamente la adición de inulina en el yogurt mejoró la viscosidad del producto, además no se apreció sinéresis durante el almacenamiento refrigerado del mismo; en cuanto a la acidez no se apreciaron diferencias estadísticamente significativas respecto al control. Microbiológicamente el yogurt con cepas probióticos e inulina, cumplió con los requisitos establecidos en la Norma COVENIN (2393:01), al igual que el control. Por lo tanto se recomienda la elaboración de yogurt firme con cepas probióticas e inulina, porque no solo se mejorarían los efectos beneficiosos del yogurt en las personas que los ingieren, sino además algunas de sus propiedades reológicas como la viscosidad, sin presencia de sinéresis.

Agradecimiento

Los autores expresan su reconocimiento a FUNDACITE ARAGUA, por la colaboración prestada en el desarrollo de esta investigación.

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