Efecto del tratamiento intralesional con clorhidrato de emetina sobre Leishmania (Viannia) braziliensis en hámsteres.

Dalmiro Cazorla¹, José Yépez¹, Néstor Añez³ y Auristela Sánchez de Mirt².

¹Unidad de Parasitología y Medicina Tropical

²Unidad de Microscopía Electrónica, Centro de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Experimental “Francisco de Miranda”, Coro, Estado Falcón, Venezuela

³ Investigaciones Parasitológicas “J. F. Torrealba”, Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela. Correo electrónico: lutzomyia@hotmail.com

Resumen.  

    Se compara el efecto terapéutico del alcaloide clorhidrato de emetina administrado dentro de la lesión (IL) con el del tratamiento sistémico convencional con Glucantime^® sobre lesiones de hámsteres machos, heterocigotos, experimentalmente infectados con 4 x 10³ amastigotes de Leishmania (Viannia) braziliensis. Se demuestra que la aplicación de ambos agentes quimioterapéuticos reduce significativamente (P < 0,01) los tamaños promedio de las lesiones cuando se comparan con los animales control no tratados. Se halló que los resultados clínicos obtenidos con la aplicación del alcaloide, son similares a los observados con el Glucantime^®, ambos redujeron el tamaño de las lesiones leishmánicas (P > 0,05). Los efectos ultraestructurales en los parásitos leishmánicos expuestos a la acción quimioterapéutica de la emetina, se evidenciaron principalmente en el interior del citoplasma de los amastigotes, que se mostró intensamente vacuolizado, desordenado e indefinido; sin embargo, no fue posible relacionar directamente las observaciones ultraestructurales con los mecanismos de acción conocidos de la emetina. La presencia de parásitos viables fue demostrada en lesiones activas y/o cicatrices, en todos los hámsteres evaluados después de 75 a 230 días post-tratamiento, mediante los métodos de frotis directo, histopatología convencional, medios de cultivo (NNN) y la técnica de la inmunoperoxidasa; esta última tiene una sensibilidad del 100%. Estos hallazgos sugieren que además de la medición del tamaño de las lesiones cutáneas, debe realizarse la búsqueda de parásitos leishmánicos remanentes como método válido para evaluar la eficacia de la quimioterapia en la LT experimental. La detección de amastigotes en lesiones curadas clínicamente, apoya la hipótesis de considerar al hombre como un posible reservorio intradomiciliar.

Effect of the intralesional treatment with emetine hydrochloride on Leishmania (Viannia) braziliensis in hamsters.

Abstract.

     The therapeutic effect of the emetine hydrochloride alkaloid administered intralesionaly was compared with that of standard parenteral treatment with Glucantime^® in outbred male hamsters experimentally infected with 4 x 10³ amastigotes of Leishmania (Viannia) braziliensis. Both chemotherapeutic agents reduced significantly (P < 0.01) the average lesion sizes in experimental animals in comparison with those untreated. The alkaloid infiltration was found to be as effective as the antimonial injection for clinical resolution. The ultrastructural effects on the Leishmania parasites exposed to emetine were observed mainly in the inner cytoplasm, which appeared disorganized, pycnotic and with loss of morphological definition; however, any known emetine hydrochloride action mechanism factor could not be directly related with ultrastructure effects detected on leishmanial parasites. Smears, conventional histopathology, culture in NNN medium and indirect inmunoperoxidase method showed viable amastigotes in nodules and/or scars of all the evaluated hamsters 75 to 230 days after the end of treatment. These findings suggest that measurement of the size of cutaneous leishmanial lesions does not appear to be a valid criterion for evaluating the efficiency of chemotherapy in experimental LT. Detection of leishmanial parasites in the lesion scars, supports the hypothesis that man could be considered as an intradomiciliar reservoir.

Key words: Chemotherapy, Leishmania (Viannia) braziliensis, hamster, electron microscopy.

Recibido: 03-09-2000. Aceptado: 30-11-2000.

INTRODUCCIÓN

    Las leishmaniasis tegumentarias (LT) son entidades nosológicas prevalentes en prácticamente la totalidad de las entidades federales de Venezuela, donde se registra un promedio de 2.095 casos por año, siendo por lo tanto un problema de salud pública en el país.^{1, 2, 3}  En Venezuela la aparición de complicaciones mucosas, que incluyen perforación del septum nasal, desaparición del lóbulo nasal y deformación del labio superior, puede presentarse entre el 10 y 20% de los casos, especialmente en aquellas infecciones producidas por Leishmania (Viannia) braziliensis, donde puede ocurrir precozmente el ataque a la mucosa o después de 5 a 8 años de haberse curado la lesión cutánea, aunque también se registran casos hasta después de 30 años.⁴

    Los tratamientos inmunoterapéuticos e inmunoprofilácticos en uso, han demostrado limitada efectividad, y, hasta el presente, la quimioterapia es el medio más efectivo y práctico para la terapia contra las LT.^{5, 6} Sin embargo, no existe acuerdo general, ni criterio uniforme y definido para el tratamiento ideal de las LT. En Venezuela, la droga de elección ha sido el antimoniato de N-metil glucamina (Glucantime^®), administrado por vía intramuscular (IM).¹ Este antimonial pentavalente (Sb^v) puede producir efectos colaterales de consideración sobre el funcionalismo hepático, cardíaco, pancreático y renal,^{6, 7, 8} y a pesar de ello su uso es extensivo. Cuando se prescribe, debe tomarse en cuenta el alto costo de un tratamiento promedio con esta droga,¹ su dificultad de aplicación durante largos periodos,⁶ y la posibilidad de que los pacientes desarrollen resistencia clínica hacia el Sb^v.^{.9, 10} En los casos de resistencia se han administrado otros compuestos, que incluyen, entre otros, pentamidina,¹¹ anfotericina B,¹² ketoconazol¹³ y rifampicina;¹⁴ sin embargo estos tratamientos son poco efectivos, muy prolongados, relativamente costosos y a veces se requiere la hospitalización del individuo. Como alternativa terapéutica a los indicados arriba, recientemente en nuestro país se ha ensayado con éxito, la administración de fármacos intra lesión (IL), especialmente Glucantime^®, lidocaina y la mezcla de ambos, con la subsecuente reducción en la administración de grandes cantidades de los antimoniales, y, por ende, de la toxicidad y los costos.^{15, 16}

    A la luz de lo anteriormente expuesto, y en la búsqueda de nuevos y eficientes esquemas terapéuticos alternativos, en el presente trabajo nos propusimos ensayar acciones quimioterapéuticas, por vía IL, del clorhidrato de emetina y comparar los resultados con los del tratamiento convencional por vía IM, del antimonial pentavalente Glucantime^®.

MATERIALES Y MÉTODOS

Parásitos

    L. (V.) braziliensis, cepa MHOM/VE/82/ZC, aislada de una paciente de 14 años de edad, procedente de Trujillo, Estado Trujillo, Venezuela. La cepa ha sido mantenida mediante repiques sucesivos en hámsteres machos.

Animales e infecciones experimentales

    Se utilizaron hámsteres machos heterocigotos de 2 a 3 meses de edad, con pesos comprendidos entre 100 y 120 g. Los animales fueron inoculados por vía subcutánea en la base de la cola con 0,1 mL de solución salina estéril al 0,85% que contenía 4 x 10³ amastigotes, los cuales se obtuvieron de lesiones tarsales de hámsteres machos.

Fármacos

    Antimoniato de N-metil-glucamina (Glucantime®, Specia) manufacturado por Laboratorio Rhone Pulenc, y clorhidrato de emetina de Laboratorios Berens y Pulmbronk.

Protocolo para la aplicación de las drogas

Evaluación de los tratamientos

    Después de la primera infiltración de las drogas, la evaluación clínica de los tratamientos se realizó semanalmente, durante 24 semanas, mediante la medición de los diámetros de las lesiones dérmicas con un calibrador (Vernier) con precisión para 0,1 mm. En ensayos previos, se observó que la administración por vía IL del clorhidrato de emetina fue extremadamente irritante para los animales, aun a la dosis de 1 mg/Kg, debido a la hipertrofia del sitio de aplicación y su posterior ulceración, con formación de abscesos y/o escamocostras. Debido a esto, la evaluación clínica del tratamiento resultaba complicada, por lo que se decidió complementarla con una evaluación de tipo histopatológico, para determinar la abundancia parasitaria presente durante la infiltración del fármaco. Para ello, se sacrificaron, por sobreanestesia con vapores de éter, dos hámsteres por cada grupo experimental (tratamiento con emetina y control), de los cuales se extrajo por disección un fragmento de lesión granulomatosa. Estos se fijaron en formaldehído al 10% y se incluyeron en parafina, para hacer cortes con microtomo, los cuales se colorearon con hematoxilina-eosina (H & E). La cantidad de parásitos (amastigotes) se estimó según el recuento de los mismos por campo de 400 X.

    Setenta y cinco a 230 días después de concluidos los periodos experimentales de tratamiento con los fármacos, se seleccionaron al azar entre 1 y 4 hámsteres curados o no, por cada grupo de tratamiento, para evaluar la cura parasitológica mediante frotis directo, histopatología convencional, cultivo y el método de la inmunoperoxidasa. Se sembraron muestras de sangre periférica y biopsias de lesiones dérmicas, hígado y bazo en medio de cultivo de Novy, McNeal y Nicolle (NNN). Al mismo tiempo, se extrajeron muestras adicionales de biopsias, y se hicieron improntas que se fijaron con metanol y colorearon con Giemsa. Para la realización de las pruebas de histopatología convencional y la coloración por la inmunoperoxidasa, las muestras de tejidos se fijaron en formaldehído al 10%, se incluyeron en parafina y se tiñeron siguiendo el método de Giemsa-colofonio propuesto por Bray & Garhnam²² y la metodología descrita por Sells & Burton,²³ respectivamente. Además, también se evaluó el efecto de los fármacos sobre la ultraestructura de los parásitos leishmánicos, tal como se describe abajo.

Microscopía Electrónica de Transmisión (MET)

    La toma de muestra de las lesiones granulomatosas se hizo de la misma forma que para el estudio histopatológico descrito arriba. Al igual que aquél, el estudio ultraestructural sólo se realizó con el grupo de hámsteres tratados con la emetina IL, y sus respectivos controles no tratados, debido a que el efecto del Glucantime^® sobre la ultraestructura de L. (V) braziliensis ya fue reseñado en un trabajo previo.²⁴ Una vez tomadas las biopsias, se cortaron en segmentos de aproximadamente 1 mm³, se procesaron y evaluaron de acuerdo a procedimiento descrito en un artículo anterior.²⁴

Análisis estadístico

    La significancia estadística de las diferencias entre las medias de los diámetros lesionales después de los diferentes tratamientos, se calculó mediante las pruebas de variancia no paramétrica de Kruskal-Wallis y de comparación múltiple de Student-Newman-Keusl.

RESULTADOS

Desarrollo de lesiones por Leishmania (V) braziliensis en hámsteres machos

Efecto de la quimioterapia sobre el tamaño de las lesiones

    Glucantime^® IM (tratamiento convencional): Los hámsteres tratados por vía IM con este antimonial, mostraron medias de los diámetros semanales relativamente bajas y constantes durante los periodos de administración de la droga (X_máx. = 6,7 ± 2,9) mm Al suspenderse la inyección de la misma, se reveló un incremento sustancial del tamaño promedio de las lesiones, aunque este último se mantuvo entre 7,8 ± 1,4 mm, al comienzo del régimen, y 8,8 + 7,6 mm, al término de las mediciones (Fig. 1). A pesar de que no se logró la cicatrización de todas las lesiones, 3 hámsteres resultaron clínicamente curados hasta los 6 meses de observación, y varios alcanzaron cicatrizar sus lesiones durante varios meses, hasta que finalmente recayeron, y presentaron recidivas.

Fig. 1. Efecto del tratamiento con emetina IL y Glucantime ® IM, sobre el desarrollo de lesiones en la base de la cola de hámsteres machos inoculados con 4 x 10³ amastigotes de Leishmania (Viannia) braziliensis. Las flechas claras muestran los periodos de tratamiento con el alcaloide, y las oscuras con el antimonial.

    Las diferencias encontradas en la reducción de los diámetros promedio de las lesiones entre los animales tratados con el antimonial y los controles sin tratamiento, resultaron estadísticamente significativas (P < 0,01). Mediante el estudio parasitológico post-tratamiento, se detectaron amastigotes viables en las cicatrices de dos hámsteres curados clínicamente, 75 días después de haberse finalizado el tratamiento quimioterapéutico (Tablas I y II).

    Clorhidrato de emetina IL: Como ya fue indicado en Materiales y Métodos, debido a la irritación que ocasiona el alcaloide a los animales, las medidas durante las primeras semanas de las observaciones correspondieron a los diámetros de las úlceras, abscesos y/o escamocostras. No obstante este efecto traumático o tóxico, el clorhidrato de emetina IL redujo significativamente los diámetros promedio de las lesiones, cuando se compararon con los de los animales que no recibieron tratamiento (P < 0,01), se mantuvieron en 12 mm al concluir las 24 semanas de observaciones, y 15 hámsteres permanecieron clínicamente curados (Fig. 1). En lo que respecta a la abundancia parasitaria, los hámsteres controles incrementaron la misma desde 200/400x, en aproximadamente las 8 primeras semanas después de la infección, hasta 2000 amastigotes/campo durante el resto del periodo de observación (Tabla III). Por el contrario, en el grupo tratado IL con el alcaloide, la abundancia de parásitos disminuyó notablemente después de la primera infiltración del fármaco, manteniéndose entre 5 y 10 amastigotes/campo de 400x en las dos primeras semanas después de la primera infiltración, hasta no ser detectables en la cuarta semana de estudio (Tabla III). Al compararse la acción de la emetina sobre el tamaño de las lesiones por L. (V) braziliensis, se observa que el alcaloide es tan eficaz como el antimonial administrado por vía sistémica (P > 0,05) (Fig. 1). La evaluación parasitológica reveló la presencia de amastigotes viables en 4 hámsteres 174 (N= 2), 180 (N=1) y 230 (N=1) días, respectivamente, después de finalizados los tratamientos (Tablas I y II).

TABLA I

DETECCIÓN POST-TRATAMIENTO DE Leishmania (v) braziliensis EN LESIONES Y / O CICATRICES DE LA BASE DE LA COLA DE HÁMSTERES MACHOS TRATADOS CON EMETINA IL Y GLUCANTIME IM, MEDIANTE LOS MÉTODOS DE FROTIS DIRECTO, HISTOPATOLÓGICO E INMUNOPEROXIDASA

* Hámsteres clínicamente curados

TABLA II

DETECCIÓN DE Leishmania (v) braziliensis MEDIANTE EL CULTIVO EN MEDIO NNN DE BIOPSIAS DE CICATRICES Y / O LESIONES (BASE DE LA COLA), HIGADO, BAZO Y HEMOCULTIVO DE HÁMSTERES MACHOS DESPUÉS DEL TRATAMIENTO CON EMETINA IL Y GLUCANTIME IM

*  Hámsteres clínicamente curados

Efectos del clorhidrato de emetina sobre la ultraestructura de amastigotes de Leishmania (V) braziliensis

    Es importante acotar que para los efectos del presente trabajo y con el fin de evitar falsos positivos, se descartaron los amastigotes detectados en el interior de las células fagocíticas, por lo que se estudiaron exclusivamente los parásitos extracelulares. Esto permitió un mayor acercamiento a la realidad de la causa-efecto de la quimioterapia sobre la ultraestructura de los parásitos.

TABLA III 

*En la semana 3 se aplicó el 2^do tratamiento. ** El periodo después de la 3^ra infiltración no se evaluó.

   Control sin tratamiento: Los amastigotes presentes en las lesiones granulomatosas de hámsteres que no recibieron quimioterapia, exhibieron la ultraestructura característica del género Leishmania, tal como es señalada por Molyneux y Killick-Kendrick²⁵ y Chang y col.²⁶ En la Fig. 2 se muestra la ultraestructura típica del parásito, con los amastigotes intactos, bien definidos y conspicuos.

    Tratamiento con clorhidrato de emetina IL: En los parásitos expuestos a la acción de este alcaloide, el citoplasma aparece desordenado, con gran cantidad de vacuolas pinocíticas (Figs. 3, 4, 5). Núcleos con discontinuidad en su periferia (Fig. 3), o con sus dobles membranas inusualmente distendidas (Fig. 4); el complejo kinetoplasto-mitocondrión se presenta abultado (Fig. 4), o su membrana con pérdida de definición morfológica y/o fragmentada, y con disminución apreciable de su electrondensidad interna (Fig. 5). La bolsa flagelar cuando se observa, exhibe su membrana colapsada, vacuolizada y con pérdida aparente del flagelo (Fig. 5).

Fig. 2. Amastigotes de L. (V.) braziliensis en tejido granulomatoso de lesiones de la base de la cola de hámsteres que no recibieron tratamiento (control sin tratamiento). En la electrongrafía A se observa un parásito leishmánico con sus componentes ultraestructurales típicos y conspicuos, sin mostrar irregularidades. En los recuadros se detallan a mayor aumento las membranas nuclear y plasmática (a) y el flagelo, bolsa flagelar y el complejo Kinetoplasto-mitocondrión (b). Abreviaturas: (MC) membrana plasmática; (N) núcleo; (Mn) membrana nuclear; (m) mitocondria; (K) Kinetoplasto; (G) aparato de Golgi; (BF) bolsa flagelar; (F) flagelo; vacuola; (L) gránulo lipídico.

DISCUSIÓN

    Después de los brotes epidémicos de leishmaniasis visceral (LV) en el Sur sudanés, y de la resistencia secundaria al Sb^v que se detecta ahora con mayor frecuencia en pacientes con LV y leishmaniasis muco-cutánea (LMC), la Organización Mundial de la Salud (OMS) exhortó a la búsqueda de medicamentos anti-Leishmania que posean un menor costo de adquisición, una menor toxicidad y una mayor eficacia, considerándose que ninguna de las drogas empleadas en la actualidad, tiene potencialmente la etiqueta de “ideal” o de “completamente satisfactoria”.^{27, 28}

Fig. 3. Electrongrafía de amastigote de L. (V.) braziliensis en tejido granuolomatoso de lesiones de la base de la cola de hámsteres, después del tratamiento IL con clorhidrato de emetina. El parásito se observa ostensiblemente colapsado, con membranas nuclear y citoplasmática discontinuas, no se detectan otras organelas. Abreviaturas: como en la Fig. 2. 

    Los resultados exhibidos aquí son los primeros estudios hechos sobre la acción de la emetina en el modelo hámster infectado con especies de Leishmania del subgénero Viannia. Los estudios demuestran que 3 dosis de 1 mg/Kg por vía IL, con un periodo de reposo de 3 semanas entre las mismas, son suficientes para provocar una reducción significativa del tamaño de las lesiones y del número de amastigotes presentes, además de daños irreversibles a nivel ultraestructural, y cura clínica completa en 15 de 17 hámsteres estudiados. Estas observaciones demuestran que la aplicación de la emetina por vía IL es tan o más eficaz que el tratamiento convencional con Glucantime^® IM para producir la cura clínica de los animales. Estos resultados contrastan con los obtenidos por Neal²¹ en ratones infectados con L. (L) tropica, y tratados por vía subcutánea con el alcaloide natural, la dehidroemetina y varios de sus enantiómeros. Este autor encuentra la respuesta clínica más efectiva con el clorhidrato de emetina, aun cuando la misma resulta tóxica e irritante para los animales tratados con dosis de 12 mg/Kg durante 5 días continuos. Al respecto, Neal²¹ concluye que como en amibiasis, el problema básico en el caso de la emetina está en ponderar la toxicidad de la droga sobre el parásito y la que ella ocasiona al hospedador. En el presente trabajo pareciera que con la implementación del régimen terapéutico estudiado, se podrían separar en gran medida ambas toxicidades, al dosificar con periodos de reposo más prolongados, menor cantidad del fármaco directamente dentro de la lesión. Lo anterior pareciera estar apoyado por los resultados de Cohen y Livshin,²⁰ quienes obtuvieron un 100% de efectividad con la emetina administrada en dosis de 13 a 160 mg una vez cada 15 días, sin que detectaran efectos secundarios. Estas observaciones contrastan con las de Abd-Rabbo¹⁸ y Salem¹⁹ quienes registraron una eficacia alta, pero con marcados efectos secundarios, cuando trataron LT del Oriente Medio, con altas dosis (840 mg a 7 g) de dehidroemetina per os, en un periodo de 3 a 12 semanas. Obviamente, el efecto secundario observado en estos casos pudo deberse a la gran cantidad del alcaloide suministrada.

Fig. 4. Efecto del clorhidrato de emetina IL sobre la ultraestructura de amastigote de L. (V.) braziliensis, se muestra un parásito con citoplasma intensamente vacuolizado; la membrana nuclear y el complejo kinetoplasto-mitocondrión parecieran estar inusualmente distendida y abultado, respectivamente. Abreviaturas: como en Fig. 2.

    Está bien documentado que la emetina y la dehidroemetina actúan en casi todos los tejidos de mamíferos, células de cultivos celulares y en E. histolytica. Estas drogas bloquean de forma irreversible la síntesis de proteínas, inhibiendo el desplazamiento del ribosoma a lo largo del RNA mensajero y bloqueando secundariamente la síntesis del ADN,^{33, 34, 35, 36} así como también la fosforilación oxidativa mitocondrial.³⁷ Neal,²¹ registró la acción de la emetina y la dehidroemetina sobre una gran variedad de células, entre ellas L. (L.) tropica y E. histolytica. Aún cuando no existe información precisa al respecto, es posible sugerir que la efectividad y toxicidad de estas drogas pueda tener un mecanismo de acción en Leishmania, parecido al que opera en E. histolytica. Es difícil relacionar directamente los mecanismos de acción descritos arriba, con las alteraciones ultraestructurales del alcaloide sobre L. (V) braziliensis observadas en el presente trabajo. Sin embargo, la inhibición de la síntesis de muchas proteínas, incluyendo enzimas, y de la fosforilación oxidativa, deben generarle al parásito un colapso o desorden interno en cascada, con su subsecuente deceso al quedar desactivadas o disminuidas funcionalmente sus rutas metabólicas vitales. Lo anterior, aunque es una consideración teórica, podría ser útil en la búsqueda de la interpretación del fenómeno que de respuesta a la intensa vacuolización, desorden citoplasmático, e irregularidades de las organelas, detectados en los parásitos expuestos a la acción del alcaloide.

Fig. 5. Electrongrafia de amastigote de L. (V.) braziliensis después del tratamiento IL con clorhidrato de emetina, donde se muestra el núcleo al que no se le detecta su doble membrana; bolsa flagelar con su membrana discontinua, y con vacuolas pinocíticas (flechas) y estructura oval que pareciera ser resto del flagelo. Así mismo se observa el complejo kinetoplasto-mitocondrión con disminución de su electrondensidad, y su membrana y ovillo de ADN fibrilar sin unidad morfológica. Abreviaturas: como en Fig. 2.

    La detección de amastigotes viables en los animales experimentales 230 días post-tratamiento, apoya previas observaciones de los autores de este trabajo²⁴ y la de otros investigadores,^{38, 39} sobre la necesidad de buscar parásitos en tejidos en vez de medir exclusivamente el tamaño de las lesiones, como método para estimar la efectividad de la quimioterapia en LT experimental.

    Como comentario final, es importante señalar que los autores de este trabajo ya ha comenzado a implementar el uso de infiltraciones locales de emetina en pacientes con LT provenientes de varias localidades del Occidente de Venezuela (resultados no publicados), obteniéndose la cura clínica de los mismos en 2- 3 semanas, con la administración, para nuestra sorpresa, de tan sólo una dosis (0,5 mg/Kg) del alcaloide.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece el apoyo técnico de P. Salas, A. Trasmonte, V. Medina y J. Yánez. Al Decanato de Investigaciones, UNEFM, Coro, Estado Falcón (Proyecto CTI-96-007), por apoyo financiero.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. CONVIT J., CASTELLANOS P., RONDON A., PINARDI M., URLICH M., CASTES M., BLOOM B., GARCIA L.: Inmunotherapy versus chemotherapy in localised cutaneous leishmaniasis. The Lancet 1987; 21:401–404.        [ Links ]

2. BONFANTE-GARRIDO R., MELÉNDEZ E., BARROETA S., MEJIA DE ALEJOS M., MOMEN H., CUPOLILLO E., MC MAHON –PRATT D., GRIMALDI G.: Cutaneous leishmaniasis in western Venezuela caused by infection with Leishmania venezuelensis and L. braziliensis variants. Trans R Soc Trop Med & Hyg 1992; 86:141–148.         [ Links ]

3. D´SUZE C., GARCIA C.: Epidemiología de la leishmaniasis. Dermat Venez 1993; 31 (Suppl 2): 4–11.         [ Links ]

4. SCORZA J., MEDINA R., PEREZ H., HERNÁNDEZ A.: Leishmaniasis in Venezuela. En: Chang K., Bray R. Eds.. Human parasitic disease. Leishmaniasis. Amsterdan: Elsevier., 1985. Vol. 1. p. 283– 296.         [ Links ]

5. KINNAMON K., STECK E., LOIZEAUX P., CHAPMAN W., WITS V., HANSON W.: Leishmaniasis: in search of new chemotherapeutic agents. Am J Vet Res 1980; 41:405–407.         [ Links ]

6. ORGANIZACION MUNIDIAL DE LA SALUD.: Control of the leishmaniases. Geneva. Suiza: Technical report series Nº 793; 1990.         [ Links ]

7. CHULAY J., SPENCER H., MUGAMBI M.: Electrocardiographic changes during treatment of leishmaniasis with pentavalent antimony (sodium stibogluconate). Am J Trop Med Hyg 1985; 34:702–709.        [ Links ]

8. BRYCESON A.: Therapy in man. En: Peters W., Killick-Kendrick R. Eds. The leishmaniasis in biology and medicine. London: Academic Press., 1987. Vol. II. p. 847 – 907.         [ Links ]

9. GROGL M., THOMASON T., FRANKE E.: Drug resistance in leishmaniasis: it´s implication in systemic chemotherapy of cutaneous and mucocutaneous disease. Am J Trop Med Hyg 1992; 47:117–126.         [ Links ]

10. OUELLETTE M., PAPADOPOULOU B.: Mechanisms of drug resistance in Leishmania. Parasitology Today 1993; 9: 150–153.         [ Links ]

11. MARSDEN P., JONES T.: Clinical manifestations, diagnosis and treatment of leishmaniasis. En: Chang K., Bray R. Eds. Human parasitic disease. Leishmaniasis. Amsterdan: Elsevier., 1985. Vol. 1. p. 183 – 198.         [ Links ]

12. MARSDEN P.: Personal experience with diagnostic and therapeutic aspects of human Leishmania (Viannia) braziliensis in Tres Braços. Mem Inst Oswaldo Cruz 1994; 89:485–487.         [ Links ]

13. JOUIFEE D.: Cutaneous leishmaniasis from Belize- treatment with ketoconale. Clin Exp Dermatol 1986; 11:62–68.         [ Links ]

14. PAREEK S.: Combination therapy of sodium stibogluconate and rifampicin in cutaneous leishmaniasis. Int J. Dermatol 1983; 23:70–71.         [ Links ]

15. YÉPEZ J., SCORZA J.: Intralesional chemotherapy with meglumine plus lidocaine of localized cutaneous leishmaniasis in Trujillo state, Venezuela. Bol Dir Malariol & San Amb 1995; 35:71–75.        [ Links ]

16. TORRES R., BARROETA S.: Tratamiento de la leishmaniasis cutánea localizada con infiltraciones perilesionales de Glucantime y lidocaina. Kasmera 1999; 27: 129 – 160.        [ Links ]

17. IWU M., JACKSON J., SHUSTER B.: Medicinal plants in the fight against leishmaniasis. Parasitology Today 1994; 10: 65–68.         [ Links ]

18. ABD-RABBO H.: Dehydrometine in leishmaniasis (oriental sore). J Trop Med Hyg 1966; 69:171–174.         [ Links ]

19. SALEM H.: The treatment of cutaneous leishmaniasis with oral dehydroemetine. Trans R Soc Trop Med 1967; 61:776–780.         [ Links ]

20. COHEN H., LIVSHIN R.: Treatment of leishmaniasis nodosa (oriental sore) with intralesionally injected emetine hydrochloride. J Amer Acad Dermatol 1987; 17: 595–599.        [ Links ]

21. NEAL R.: Effect of emetine and related compounds on experimental cutaneous leishmaniasis. Ann Trop Med Parasitol 1970; 64:159–165.         [ Links ]

22. BRAY R., GARHNAM P.: The Giemsa-colophonium method for staining protozoa in tissue sections. Indian J Malar 1962; 16:153.         [ Links ]

23. SELLS P., BURTON M.: Identification of Leishmania amastigotes and their antigens in formalin tissue by inmunoperoxidase staining. Trans R Soc Trop Med Hyg 1981; 75: 461–468.        [ Links ]

24. YEPEZ J., CAZORLA D., SÁNCHEZ DE MIRT A., AÑEZ N., LUGO DE YARBUH A.: Effect of intralesional treatment with lidocaine and Glucantime^® in hamsters infected with Leishmania (Viannia) braziliensis. Bol Dir Malariol & San Amb 1999; 39:10–20.         [ Links ]

25. MOLYNEUX D., KILLICK-KENDRICK R.: Morphology, ultrastructure and life cycle. En: Peters W., Killick-Kendrick R. Eds. The leishmaniasis in biology and medicine. London: Academic Press., 1987. Vol. I. p. 121 – 176.         [ Links ]

26. CHANG K., FONG D., BRAY R.: Biology of Leishmania and leishmaniasis. En: Chang K., Bray R. Eds. Human parasitic disease. Leishmaniasis. Amsterdan: Elsevier., 1985. Vol. 1. p. 1 – 30.         [ Links ]

27. UNDP/WORLD BANK/WHO.: TDR News. Nº 34. Geneva. Suiza; 1990.         [ Links ]

28. OLLIARO P., BRYCESON A.: Practical progress and new drugs for changing patterns of leishmaniasis. Parasitology Today 1993; 9:323–328.        [ Links ]

29. FOURNET A., BARRIOS A., MUÑOZ V., HOCQUEMILLER R., CAVE A., BRUNETON J.: 2- sustituded quinoline alkaloids as potential antileishmanial drugs. Antimicrob Agents Chemother 1993; 37:859–863.         [ Links ]

30. NEAL R.: Experimental chemotherapy. En: Peters W., Killick-Kendrick R. Eds. The leishmaniasis in biology and medicine. London: Academic Press., 1987. Vol. II. p. 793 – 845.         [ Links ]

31. SINDERSON H.: Emetine hydrochloride in the treatment of oriental sore. Trans R Soc Trop Med Hyg 1924; 18:108–110.         [ Links ]

32. NEAL R.: Chemotherapy of cutaneous leishmaniasis: Leishmania tropica infection in mice. Ann Trop Med Parasitol 1964; 58:420–430.         [ Links ]

33. HUANG T., GROLLMAN A.: Novel inhibitors of protein synthesis animal cells. Fed Proc 1970; 29:609.         [ Links ]

34. JOHNSON R., KWAN S., DONAHUE J., JONDORF W.: Effects of (-) emetine on protein synthesis in regerating rat liver. Fed Proc 1970; 29:609.        [ Links ]

35. ENTNER N.: Emetine binding to ribosomes of Entamoeba histolytica- inhibition of protein synthesis and amebicidal action. J Protozool 1979; 26: 324–328.        [ Links ]

36. GOLDSMITH R.: Tratamiento de la amibiasis. En: Katzung B. Ed. Farmacología Básica y Clínica. D.F. México: Editorial El Manual Moderno S.A., 1987. p. 649 – 660.         [ Links ]

37. DUBICK M., YANG W.: Effects of chronic emetine treatment on mitochondrial function. J Pharm Sci 1981; 70:343–345.         [ Links ]

38. DE ROSSELL R., ROSSELL O., DE JESUS R., RODRIGUEZ A.: Thermotherapy v. antimonials: what happens after the healing of cutaneous leishmaniasis lesions? Ann Trop Med Parasitol 1993; 87:23–30.        [ Links ]

39. TRAVI B., MARTINEZ J., ZEA A.: Antimonial treatment of hamsters infected with Leishmania (Viannia) panamensis: assessment of parasitological cure with different therapeutic schedules. Trans R Soc Trop Med Hyg 1993; 85:567–569.         [ Links ]

40. AEBISHER T.: Recurrent cutaneous leishmaniasis: a role for persistent parasites? Parasitology Today 1994; 10:25–28.         [ Links ]

41. ALVAR J.: Leishmaniasis and AIDS co-infection: the Spanish example. Parasitology Today 1994; 10:160–163.         [ Links ]

42. SARAVIA N., WEIGLE K., SEGURA I., HOLMES S., PACHECO R., LABRADA L., GONCALVES A.: recurrent lesions in human Leishmania braziliensis infection- reactivation o reinfection? The Lancet 1990; 336:398–402.         [ Links ]

43. SCORZA J.: Protocolo para investigación epidemiológica de leishmaniasis tegumentaria en Venezuela. Bol Dir Malariol & San Amb 1988; 25:83–90.         [ Links ]

44. ROJAS E., SCORZA J.: Xenodiagnóstico con Lutzomyia youngi en casos venezolanos de leishmaniasis cutánea por Leishmania braziliensis. Mem Inst Oswaldo Cruz 1989; 84:29–34.        [ Links ] ]]> 1 1987 21 401-404 2 1992 86 141-148 3 1993 31 ^s2 ^s2 2 4-11 4 1985 1 283- 296 5 1980 41 405-407 6 ORGANIZACION MUNIDIAL DE LA SALUD 1990 793 7 1985 34 702-709 1987 II 847 - 907 9 1992 47 117-126 10 1993 9 150-153 11 1985 1 183 - 198 12 1994 89 485-487 13 1986 11 62-68 14 1983 23 70-71 15 1995 35 71-75 16 1999 27 129 - 160 17 1994 10 65-68 18 1966 69 171-174 19 1967 61 776-780 20 1987 17 595-599 21 1970 64 159-165 22 1962 16 153 23 1981 75 461-468 24 1999 39 10-20 25 1987 I 121 - 176 26 1985 1 1 - 30 27 UNDP^dWORLD BANK 1990 34 28 1993 9 323-328 29 1993 37 859-863 30 1987 II 793 - 845 31 1924 18 108-110 32 1964 58 420-430 33 1970 29 609 34 1970 29 609 35 1979 26 324-328 36 1987 649 - 660 37 1981 70 343-345 38 1993 87 23-30 39 1993 85 567-569 40 1994 10 25-2 41 1994 10 160-163 42 1990 336 398-402 43 1988 25 83-90 44 1989 84 29-34