Microdiálisis subcutánea: una técnica simple para monitorizar el ambiente bioquímico extracelular. Combinación con electroforesis capilar y detección mediante fluorescencia inducida por láser.
Ximena Páez1, Carmen Amalia Mazzei-Dávila2 y Luis Hernández1
1Laboratorio de Fisiología de la Conducta. 2Departamento de Pediatría, Facultad de Medicina, Universidad de Los Andes. Mérida, Venezuela.
Resumen. La microdiálisis es una técnica que permite seguir los cambios de sustancias endógenas o exógenas presentes en cualquier compartimento extracelular. Actualmente tiene muchas aplicaciones tanto experimentales como clínicas. El muestreo en el fluido extracelular subcutáneo es especialmente útil para la evaluación del metabolismo en pacientes en condiciones críticas, estudios farmacocinéticos y monitoreo de glucosa. Presentamos algunos ejemplos de estas aplicaciones, usando una cánula fabricada manualmente con un segmento de tubo de celulosa (200 µm de diámetro externo y poros de 13.000 daltons de peso molecular) ensamblado entre tubos de acero inoxidable (26 ga. de diámetro externo) para ser insertada en el tejido subcutáneo, en pacientes en condiciones críticas o en ratones anestesiados, para analizar patrones de aminoácidos por electroforesis capilar con detección mediante fluorescencia inducida por láser (EC-DFIL). También fue usada ambulatoriamente para medir glucosa en voluntarios. Los resultados muestran que la microdiálisis subcutánea es un método muy simple, no costoso ni agresivo, con ventajas sobre la obtención de muestras de sangre por punción venosa repetida e inclusive sobre microdiálisis endovenosa. Este método, combinado con una técnica analítica apropiada, puede usarse exitosamente en la vigilancia del ambiente químico extracelular en condiciones clínicas o preclínicas muy diferentes.
Subcutaneous microdialysis: simple technique to monitor biochemical extracellular environment. Coupling with capillary electrophoresis and laser-induced fluorescence detection. ]]>
Abstract. Microdialysis is a simple technique that allows monitoring endogenous or exogenous substances in any extracellular compartment. It has many useful experimental and clinical applications. The sampling of the extracellular fluid of the subcutaneous compartment is especially useful for metabolic evaluation in critically ill patients, pharmacokinetic studies and blood glucose monitoring. We built a subcutaneous microdialysis probe, with a cellulose hollow fiber (13,000 molecular weight cut off, 200 µm outside diameter) glued to stainless steel tubing (26 ga. outside diameter). It was implanted in the subcutaneous tissue of a critically ill child or anesthetized mice to obtain amino acids patterns by means of capillary electrophoresis with laser induced fluorescence detection (CE-LIFD). The probe was also implanted in ambulatory volunteers to monitor glucose. The results confirmed that subcutaneous microdialysis is a very simple, inexpensive and not aggressive method with advantages over repeated venipuncture sampling and endovenous microdialysis sampling. The present report shows that subcutaneous microdialysis with the proper analytical technique can be used to monitor the chemical composition of the interstitial compartment in very different preclinical or clinical conditions.
La microdiálisis consiste en el intercambio de moléculas a través de una membrana porosa, siguiendo gradientes de concentración, lo que permite extraer o introducir sustancias en matrices químicas complejas. Esta técnica ha sido de gran utilidad en el control o vigilancia de compuestos libres, de bajo peso molecular, presentes en el medio extracelular. Se puede realizar prácticamente en cualquier tejido o fluido biológico. Actualmente la microdiálisis tiene una gran aplicación tanto en investigación básica en animales de experimentación así como en investigación, diagnóstico y terapéutica en humanos (1-5). Esto se evidencia en el gran número de publicaciones sobre sus aplicaciones en los últimos años (5). La microdiálisis inicialmente se empleó en estudios neuroquímicos en el cerebro de animales (6). Posteriormente, su aplicación en farmacocinética ha sido de gran utilidad. Se ha analizado drogas de muy diferente naturaleza con el muestreo simultáneo de uno o más compartimientos extracelulares: músculo, sangre, hígado, o tejido subcutáneo, tanto en animales como en humanos (7-13). La microdiálisis también ha sido usada en el hígado para monitorear el metabolismo después de transplante hepático (14), en mama para estudiar cambios metabólicos durante el ciclo menstrual (15), o en el tejido adiposo subcutáneo para vigilar cambios metabólicos durante la anestesia (16).
El uso de la microdiálisis en la clínica ha aumentado en los últimos años, especialmente en pacientes en estado crítico, por ser una técnica prácticamente inocua. La microdiálisis cerebral se ha empleado para evaluar el metabolismo y los neurotransmisores en el medio extracelular cerebral, en pacientes que padecen trauma encefálico, durante la neurocirugía, en la enfermedad cerebro vascular y en otras patologías neurológicas. Los cambios encontrados en estas diversas condiciones han permitido identificar marcadores del estado energético de las células, o de excitotoxicidad, así como identificar cambios regionales en neurotransmisores (1, 4, 17-21).
En los pacientes gravemente enfermos, interesa conocer los cambios químicos rápidos que pueden ocurrir en el medio extracelular en diferentes tejidos y que son causados por drogas o por determinada condición fisiopatológica, a fin de tomar medidas terapeúticas precoces y apropiadas. El monitoreo o vigilancia continuos con microdiálisis permitiría detectar por ejemplo, sustancias endógenas que podrían ser indicadores del curso de una enfermedad o condición particular, o los niveles tóxicos de sustancias endógenas o drogas. Esto se puede hacer con microdiálisis endovenosa in vivo (10, 22, 23), pero se necesita tomar y mantener una vía venosa, o si se hace microdiálisis in vitro en muestras de plasma, se necesita hacer extracciones repetidas de sangre por punción de una vena o de un catéter endovenoso y luego dializar el plasma (10).
Una forma más sencilla y más precisa de analizar el medio ambiente extracelular con microdiálisis es sondear los tejidos periféricos como el tejido celular subcutáneo (11). Este compartimento es de fácil acceso y las complicaciones o riesgos para el paciente son menores. La microdiálisis subcutánea desde sus inicios se ha aplicado al estudio de los cambios metabólicos en el intersticio como la evaluación del metabolismo de la glucosa y de los lípidos (24, 25). Ha sido muy útil en estudios metabólicos de glucosa, lactato y glutamato en pacientes neurológicos en estado crítico, y ha proporcionado datos que pueden contribuir a la interpretación de lo que está ocurriendo en el cerebro (26). También se ha usado para monitorizar el metabolismo en los bordes de piel para dar información sobre el futuro de la viabilidad de un injerto (27), el metabolismo subcutáneo en pacientes con citopatía mitocondrial (28), durante la anestesia (16), y el metabolismo de aminoácidos en recién nacidos (29). La información del metabolismo del medio intersticial puede mostrar cambios en algunos indicadores aun antes que en la sangre, o de que ocurran manifestaciones clínicas lo que da ventaja para una rápida intervención terapéutica (30). Otra de las importantes aplicaciones de la microdiálisis cutánea es en estudios farmacocinéticos, en los que se puede medir directamente las concentraciones de la droga en el tejido. Estos estudios antes estaban limitados a las medidas de concentración de la droga en el plasma o en la sangre. Se han estudiado diversas drogas como por ejemplo, antibióticos, antiepilépticos (11) antiinflamatorios (31) y antineoplásicos como el 5-fluoracilo (32). En pacientes en estado crítico conocer la farmacocinética de antibióticos u otros medicamentos puede dar información mejor que la del plasma, ya que el intersticio es el sitio donde la mayoría de los medicamentos actúa (11, 33). Los datos de concentraciones de drogas en plasma pueden hacer que el médico use erróneamente una dosis potencialmente inferior a la necesaria.
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El desarrollo de esta técnica ha significado el progreso en una de sus aplicaciones más exitosas: el monitoreo continuo de glucosa en pacientes graves y ambulantes, sin tener que hacer extracción repetida de sangre. La microdiálisis subcutánea permite tener una mejor evaluación de cambios extremos en la glucosa, que pueden ir desde detección de hipoglicemia hasta decidir administrar insulina (34). Es especialmente útil si se trata de monitoreo de glucosa a largo plazo (días) en recién nacidos, pues se evita la pérdida de sangre y el estrés de la extracción de sangre en estos pequeños pacientes (35). Actualmente, la combinación de microdiálisis subcutánea ultralenta con nanosensores de glucosa se usa en la terapia intensiva de diabéticos (36). La microdiálisis subcutánea también ha sido usada en estudios del óxido nítrico y de su papel en la vasodilatación e inflamación del tejido subcutáneo (37, 38) así como en la evaluación de la administración tópica o sistémica de drogas (39).
Las muestras de microdiálisis en general, son de muy pequeño volumen y con analitos en bajas concentraciones, lo que hace necesario disponer de técnicas analíticas muy sensibles tales como la electroforesis capilar (EC). Esta es una técnica analítica que permite separar, identificar y cuantificar sustancias en pequeños volúmenes y esto permite aumentar la resolución temporal de la microdiálisis (32, 40-43). De modo que, la combinación de microdiálisis subcutánea y EC-DFIL resulta muy conveniente para el análisis en volúmenes de muy pocos microlitros y aun nanolitros lo cual no es posible con otras técnicas analíticas como la cromatografía líquida de alta presión (44).
En el presente trabajo mostramos algunos ejemplos de las aplicaciones de una cánula de microdiálisis subcutánea de muy simple diseño y fácil fabricación que puede usarse tanto en roedores y como en humanos. Usamos microdiálisis subcutánea en una vigilancia continua y simultánea de varios aminoácidos en un paciente pediátrico en coma, y en ratones anestesiados. El análisis de las muestras se hizo con EC-DFIL. También empleamos nuestra cánula en jóvenes voluntarios sanos durante una prueba de carga oral de glucosa y comparamos los datos de diálisis con los de sangre en los mismos individuos. Los resultados confirmaron que la microdiálisis subcutánea es una técnica muy sencilla, sin riesgos para el paciente, más conveniente que la microdiálisis en sangre in vivo o in vitro. La combinación con EC-DFIL también demostró ser muy conveniente especialmente cuando se trata de estudios en pacientes pediátricos o en animales muy pequeños donde es ventajoso el uso de pequeños volúmenes de muestra.
MATERIAL Y MÉTODOS
Cánula de microdiálisis subcutánea
En la Fig. 1 se muestra el diagrama de la cánula para microdiálisis subcutánea. Estas cánulas fueron fabricadas manualmente con un segmento de 15 mm de fibra hueca de celulosa con poros permeables a moléculas de PM inferior a 13.000 daltons insertado entre 2 trozos de tubo de acero inoxidable 26 ga de 2 cm de largo. Para la adhesión de las uniones se usó cemento epoxy. El extremo libre en bisel de uno de los segmentos de acero inoxidable sirvió para punzar la piel e introducir la cánula.
Fig. 1. Microdiálisis subcutánea. A. Diseño e implantación de la cánula. B. Diálisis a través del tubo de celulosa colocado en el tejido subcutáneo. La bomba de infusión se conecta a la entrada de la cánula y del extremo de salida se recoge el dializado.
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Sujetos y diálisis
1. En un niño politraumatizado en coma, hospitalizado en la unidad de cuidados intensivos pediátricos del Hospital Universitario de los Andes, luego de obtener la autorización de los médicos tratantes y el representante legal del paciente, previa información del procedimiento, bajo asepsia y antisepsia se insertó una cánula en la piel periumbilical, de tal forma que el segmento de diálisis quedó implantado en el tejido subcutáneo como se muestra en la Fig. 1. La cánula fue conectada a una bomba de perfusión y se perfundió con NaCl 0,9% a 1 mL/min. Se hizo una diálisis continua recogiendo muestras de 60 mL/60 min en 49 horas (49 muestras en total) durante las cuales el estado de conciencia del paciente cambió hacia la mejoría (de 6 a 10 en la escala de Glasgow). Las muestras se guardaron a –80°C hasta ser procesadas. El proceso de diálisis no interfirió con el cuidado médico del paciente.
2. A 4 ratones albinos machos adultos, de la línea NMRI, de peso entre 20 a 22 g anestesiados con clorhidrato de ketamina (100 mg/kg) se les implantó una cánula de microdiálisis cutánea en el hemiabdomen izquierdo de modo que el segmento funcional quedó inmerso en el tejido subcutáneo y luego se procedió a perfundir la cánula de la manera descrita en 1. Se tomaron muestras cada 30 minutos durante 2 horas (12 muestras en total). Durante todo el procedimiento de diálisis los animales estuvieron anestesiados. Las muestras se guardaron a –80°C hasta su procesamiento.
3. En 10 voluntarios sanos en ayunas, de sexo masculino entre 18 y 24 años de edad, luego de explicar el procedimiento y obtener el consentimiento informado por escrito de cada voluntario, bajo condiciones de asepsia y antisepsia se les implantó en la cara anterior del antebrazo derecho una cánula de diálisis subcutánea que se conectó y que fue perfundida de la manera descrita anteriormente. Se tomaron muestras cada 30 minutos. Después de tomar la primera muestra de diálisis se administró por vía oral 75 g glucosa y se tomó una muestra de sangre por venopunción en el brazo izquierdo. Luego cada 30 min. se recogió un dializado y una muestra de sangre heparinizada hasta los 120 min. Las muestras se mantuvieron en hielo hasta ser procesadas el mismo día.
4. Para realizar diálisis in vitro de plasma humano obtenido de sujetos sanos voluntarios, se separó el plasma por centrifugación de muestras heparinizadas de sangre tomada por punción de venas del codo. Se colocó una cánula de diálisis concéntrica (45) con 15 mm de área funcional (celulosa) dentro de un tubo con 500 ml de plasma. La celulosa empleada y las condiciones de diálisis son las mismas que las descritas anteriormente.
Análisis de las muestras
1. Los dializados subcutáneos de niño y de ratón fueron procesados para analizar aminoácidos por EC-DFIL (45, 46). En breve, la técnica analítica consistió en derivatizar las muestras con isotiocianato de fluoresceína para hacerlas fluorescentes. Luego de 18 horas de incubación las muestras fueron analizadas en un equipo de EC con un láser de argón (Meridialysis CZE system) (47). Este sistema permite el análisis en mínimos volúmenes de muestras que se cargan por presión negativa en uno de los extremos del capilar. A las soluciones de corrida usadas se les añadió detergente (lauril sulfato de sodio) para formar micelas a fin de separar aminoácidos neutros que no se resolverían con la EC convencional. Este proceso se conoce como cromatografía electrocinética micelar, y es una variante de la electroforesis capilar (46). Los valores de fluorescencia de cada aminoácido (alturas de picos) obtenidos con EC-DFIL en las muestras del niño fueron convertidos a concentración expresada en micromoles por litro por comparación con los valores de fluorescencia de soluciones de concentración conocida (patrón) para cada aminoácido.
2. Los dializados subcutáneos y las muestras de sangre de los voluntarios fueron analizados automáticamente con un analizador de glucosa por el método enzimático convencional. Se calcularon los valores promedios de glucosa en mg% para cada punto de las curvas de glucosa en dializados y de glucosa en plasma. Se hizo el análisis estadístico de las curvas con ANOVA one way y el test pos hoc de Tukey.
RESULTADOS
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La implantación de cánula de diálisis no ocasionó riesgos ni molestias a los sujetos durante ni después de la diálisis. Fue posible dializar continuamente por el tiempo deseado, mientras que existiera aporte continuo de la solución de perfusión. El niño en cuidados intensivos se dializó durante 49 horas continuas sin interferir con los cuidados médicos del paciente. En la Fig. 2 se muestra un patrón típico de separación de los aminoácidos: isoleucina (Ile), valina (Val), fenilalanina (Phe), treonina (Thr), Gaba, alanina (Ala) y serina (Ser). Todos aminoácidos neutros o apolares, excepto la serina (Ser) y presentes en un dializado subcutáneo. Este monitoreo permitió además obtener simultáneamente el curso temporal de cambios en los aminoácidos analizados (Fig. 3). En la Fig. 4 se muestran relaciones entre algunos de los aminoácidos analizados. Por ejemplo, la relación Val/Phe se elevó a partir de las 18 horas, incremento que coincidió con la mejoría neurológica del paciente (de 6 a 10 según la escala de Glasgow), mientras la relación Ser/ Ala se mantuvo sin cambios. Por otra parte, la diálisis subcutánea en los ratones (Fig. 5 arriba) mostró en los electroferogramas de los mismos aminoácidos, un patrón muy semejante al obtenido en el niño. Además se encontró similitud en estos patrones de dializados subcutáneos con los de dializados de plasmahumano obtenidos in vitro (Fig. 5 abajo).
La diálisis subcutánea en voluntarios sanos se realizó sin ninguna molestia para el sujeto y al final, luego de retirar la cánula, fue prácticamente imperceptible el sitio de la diálisis. Fue menos molesta que la diálisis endovenosa, la cual requiere punzar y canular una vena y luego mantener la permeabilidad del catéter endovenoso (guía para la implantación de cánula de diálisis endovenosa), y de la vena (10). En la Fig. 6 se muestran las curvas de respuesta a la carga oral de glucosa en los dializados y en la sangre venosa periférica. En ambas curvas se observó la elevación significativa de glucosa [F=4,3 (4,45) p < 0,05] en dializados y [F=10,6 (4,45) p < 0,001] en plasma. El aumento no fue simultáneo. En la sangre ocurrió a los 30 min y en los dializados a los 60 min, lo que indica las diferencias de distribución en los distintos compartimientos, pues la glucosa una vez absorbida va primero a la sangre y luego pasa a los tejidos (48). Además existe una variación sustancial interindividual de recuperación de glucosa que hace difícil precisar exactamente el desfase temporal fisiológico entre ambos compartimentos (49). La recuperación de glucosa en el dializado subcutáneo, con las cánulas y flujo empleados, fue aproximadamente de un 30% de lo obtenido en sangre. Los datos de glucosa en dializados se presentaron corregidos por el porcentaje de recuperación.
Fig. 2. Patrón de3 aminoácidos en un dializado subcutáneo humano. Análisis mediante EC-DFIL con una solución buffer con detergente que permite separar aminoácidos neutros o apolares.Arriba: Electroferograma completo. Abajo: Magnificación de un segmento de un minuto del electroferograma que muestra el patrón típico de separación de 7 aminoácidos: isoleucina (Ile), valina (Val), fenilalanina (Phe), treonina (Thr), Gaba, serina (Ser) y alanina (Ala).
Fig 3. Control simultáneo de la concentración de cuatro aminoácidos en dializados subcutáneos obtenidos en cada hora durante 49 horas de un niño politraumatizado hospitalizado en una unidad de cuidados intensivos.
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Fig. 4. Razones entre aminoácidos medidos con EC-DFIL en muestras obtenidas durante 49 horas de microdiálisis subcutánea
Fig. 5. Patrón de aminoácidos en microdializados analizados con EC-DFIL. Arriba. Dializado subcutáneo de ratón anestesiado. Abajo.Dializado in vitro de plasma humano.
Fig. 6. Glucosa en voluntarios sanos (n=10) a los 0,30,60,90 y 120 min luego de una carga oral de 75g de glucosa A. Curva de glucosa plasmática. B. Curva de glucosa en dializados subcutáneos. **p<0,001 *p<0,05.
DISCUSIÓN
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La evaluación del ambiente bioquímico extracelular es de gran interés no sólo en la investigación básica sino en la clínica, lo que se evidencia en el creciente número de publicaciones sobre aplicaciones clínicas de la microdiálisis. Müller menciona que hay más de siete mil artículos sobre microdiálisis y más de mil artículos en humanos (5). Nosotros encontramos alrededor de 100 artículos en los últimos 4 años sólo en microdiálisis subcutánea en humanos. El uso de diálisis simultánea en tejidos periféricos ha tenido gran aplicación en estudios farmacocinéticos pues la concentración de las drogas en estos compartimientos periféricos es lo que determina la efectividad de la terapéutica, más que la concentración en el plasma. Antes de la introducción de la microdiálisis, los estudios farmacocinéticos estaban limitados a mediciones de drogas en plasma por ser éste el único compartimento dónde se podían medir fácilmente las drogas (11). Pero con la microdiálisis esto ha cambiado. La microdiálisis endovenosa se ha usado con frecuencia especialmente en los pacientes críticamente enfermos para monitorizar cambios en sustancias exógenas y endógenas, y tomar medidas correctivas rápidas durante el monitoreo (50). Esta microdiálisis requiere canular una vena y mantener la permeabilidad de la vía. En algunos casos ésto no es fácil, porque son niños muy pequeños recién nacidos o prematuros en los cuales colocar una cánula más, puede ser excesivamente traumático. Técnicamente es más difícil hacer coincidir los tamaños adecuados de catéteres endovenosos (guías) y la cánula de diálisis que tiene que ir adentro, aunado a que puede haber más riesgo de infección cuando se usa la vía venosa. Además, como mencionamos antes, las mediciones en plasma no son necesariamente las mejores para indicar las concentraciones efectivas de una droga en los tejidos.
Por otra parte tenemos que el sondeo subcutáneo por microdiálisis es más simple, las cánulas fáciles de fabricar e implantar, el procedimiento poco o nada agresivo sin riesgos secundarios, fácil de mantener continuamente por horas o días, y como en cualquier otra microdiálisis, se puede analizar cualquier sustancia presente en el dializado dependiendo del tamaño de los poros de la membrana de diálisis y de la técnica analítica que se disponga. Hacer microdiálisis subcutánea es más conveniente que tomar muestras repetidas de sangre, especialmente si el individuo tiene un volumen de sangre bajo como en un prematuro. Más aún, la microdiálisis subcutánea causa pocas molestias al paciente y permite examinar las concentraciones de los analitos de interés, drogas o compuestos endógenos en el intersticio, que es dónde actúan y dónde interesa evaluarlos. Cuando se acopla la microdiálisis a una técnica analítica de alta resolución como la EC-DFIL se puede hacer los análisis bioquímicos de diversas sustancias simultáneamente en volúmenes pequeños de muestras mejorando así la resolución temporal de la microdiálisis.
El análisis con EC-DFIL de los dializados subcutáneos, permitió separar, identificar y medir continuamente: Ile, Val, Phe, Thr, Gaba, Ser, Ala, los cuales se presentaron en un patrón similar al encontrado en dializados de plasma obtenidos in vitro. En el niño en estado crítico hubo cambios en los analitos que coincidieron con cambios en su estado clínico (mejoría neurológica de 6 a 10 en la escala de Glasgow). Aunque no se puede dar una explicación precisa para estos hallazgos, se trata justamente de descubrir, mediante este tipo de monitoreo, indicadores pronósticos en el curso de una enfermedad o condición determinada, para tomar medidas terapéuticas precoces si fuera necesario. En un estudio en niños con trauma encefálico, Tolias y col. (51), reportan cambios en las proporciones de aminoácidos neuroactivos en dializados cerebrales, algunos de los cuales se asocian unos con aumento de morbilidad y otros con mejoría clínica; mientras que en aminoácidos estructurales no reportan cambios. Se encontró, además, una gran similitud en los patrones electroferográficos de los dializados del tejido celular subcutáneo del niño y de los dializados de plasma humanos obtenidos in vitro. Esto indicaría que el arreglo bioquímico extracelular del tejido subcutáneo es semejante al del plasma al menos en estos aminoácidos analizados, por lo que el muestreo extracelular del tejido subcutáneo podría ser otra opción para el estudio del ambiente bioquímico intravascular, especialmente cuando no es posible o conveniente el uso del plasma. El análisis de glucosa en voluntarios también mostró que tanto en pacientes críticamente enfermos como ambulatoriamente este método es fácil de realizar sin riesgos para los sujetos.
En conclusión, la microdiálisis subcutánea pudo usarse en un paciente críticamente enfermo o en voluntarios ambulatorios sin riesgos y sin molestias. Así mismo, permitió el reconocimiento de patrones de aminoácidos con EC-DFIL, los cuales resultaron ser similares en diferentes compartimientos y especies. Esta semejanza de los dializados subcutáneos con los dializados de plasma, al menos en cuanto a aminoácidos, indica que podría usarse el control bioquímico subcutáneo en sustitución del control bioquímico del plasma. La microdiálisis subcutánea combinada con EC-DFIL es pues una alternativa efectiva y conveniente para el control bioquímico del medio interno.
Para el futuro muy cercano se anticipa mayor uso de microdiálisis en tejidos periféricos a flujos muy lentos, para aumentar la recuperación de los analitos hasta prácticamente el 100%, combinada con sensibles técnicas analíticas en línea, es decir, hacer el análisis químico a medida que se va obteniendo la muestra, permitiendo una rápida recolección de datos con alta resolución temporal al lado de la cama del paciente (52-53).
AGRADECIMIENTO
Este trabajo se ejecutó con financiamiento otorgado por el CONICIT proyecto # G 97000820. Agradecemos al personal médico y de enfermería de la Unidad de Cuidados Intensivos Pediátricos del Hospital Universitario de los Andes (HULA) Mérida, Venezuela, por su colaboración para realizar microdiálisis en sus pacientes.
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