Evaluación de las mutaciones del oncogen K-ras 12 en pacientes venezolanos infectados con Helicobacter pylori. 

Patrizzia Mastromatteo¹, María Correnti^{1, 3}, María Eugenia Cavazza², Marianella Perrone³, Claudio Tombazzi⁴ y Víctor Lecuna⁴. 

¹Instituto de Oncología y Hematología. ²Instituto de Biomedicina. Ministerio de Salud y Desarrollo Social, Universidad Central de Venezuela. ³Instituto de Investigaciones Odontológicas “Raúl Vincentelli”, Facultad de Odontología. ⁴Hospital Clínico Universitario. Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela. Correo electrónico: patrizia_mast@hotmail.com 

Resumen. En el presente trabajo se evaluó la presencia de mutaciones del gen K-ras 12 en pacientes infectados con H. pylori y su asociación con distintas patologías de las vías gastroduodenales superiores. Se estudiaron 62 pacientes a quienes se les practicó endoscopia digestiva superior, tomando 3 biopsias utilizadas para el estudio histológico, pruebas de biología molecular y la determinación de mutaciones puntuales del gen K-ras 12. Los resultados mostraron una alta incidencia de la infección por H. pylori en pacientes con gastritis crónica activa (GCAc) (90%), gastritis crónica atrófica (GCAt) (70%), metaplasia intestinal (MI) (67%), cambios displásicos (CD) (83%), disminuyendo en cáncer gástrico (CG) (33%). En la evaluación de las mutaciones del oncogen K-ras 12 se observó que 68% de los pacientes presentaron mutaciones en los diferentes aminoácidos analizados. En el codon 12 del gen K-ras, se detectaron mutaciones puntuales simples y combinadas en la misma muestra proveniente de diferentes patologías gástricas, registrándose en los casos de gastritis crónica activa (GCAc) el mayor número de mutaciones, disminuyendo a medida que progresan las etapas de diferenciación histológica hacia cáncer gástrico. Los resultados indicarían que existen mutaciones específicas que pudieran emplearse como marcadores moleculares de malignidad y el eventual desarrollo de cáncer gástrico. 

Palabras clave: H. pilory, RCP, hibridación molecular selectiva, oncogen, K-ras 12 

Evaluation of K-ras 12 oncogene mutations in Venezuelan patients with Helicobacter pylori infection.

Abstract. This work evaluated the infection of H. pylori in the different gastric pathologies and its association with the oncogen K-ras 12. Endoscopy was performed in 62 patients and 3 biopsies from the antral region were taked and used for the histological diagnostic, PCR, and point mutations determination. The results showed a high incidence of H. pylori infection in patients with active chronic gastritis (AcCG) 90%, chronic atrophic gastritis (AtCG) 70%, intestinal metaplasia (IM) 67%, dysplasia (D) 83%, and decrease in in gastric cancer (GC) 33%. Evaluation of the oncogen K-ras 12 showed that 68% of the patients presented mutations in the different analyzed amino acids. In the 12 codon of the K-ras gene, we observed simple point mutations and combination in the same sample in different gastric pathologies. In AcCG samples were detected the greater number of mutations. A decrease of the point mutations were observed in the progression stages to gastric cancer. The presence of these specific mutations would be tumor markers and it determine the possible development of gastric tumors. 

Key words: H. pylori, PCR, selective molecular hybridization, oncogene, K-ras 12. 

Recibido: 11-03-2005. Aceptado: 14-07-2005. 

En 1.994 la Agencia Internacional para la investigación del cáncer de la Organización Mundial de la Salud ubicó a H. pylori en el grupo de carcinógenos gástricos de clase I para los humanos (1-3), concluyendo que la misma posiblemente juega un papel causal en la cadena de eventos que conducen al desarrollo de un carcinoma gástrico (1, 3, 4). Recientemente se ha sugerido a H. pylori como un factor de riesgo para la carcinogénesis gástrica (4-7), este proceso se inicia con una gastritis crónica activa, y prosigue a las distintas fases como son: la gastritis atrófica crónica, metaplasia intestinal y cambios displasicos, las cuales presumiblemente dependen de la presencia de otros cofactores para el desarrollo del cáncer gástrico (8-10). Diferentes estudios han demostrado que la infección crónica de H. pylori puede causar o inducir alteraciones genéticas definidas por mutaciones puntuales en distintos oncogenes, uno de los más estudiados en distintas patologías gástricas es el oncogen K-ras; en algunos casos se ha observado que la erradicación de este microorganismo puede reducir no solo el proceso inflamatorio asociado a la atrofia, sino también alteraciones genéticas como es la inestabilidad genómica (11,12), siendo esto motivo de estudio para muchos investigadores, algunos de los cuales han demostrado la presencia de dichas mutaciones en gastritis crónica asociada a H. pylori así mismo, también en cáncer gástrico (11). Sin embargo, otros estudios demostraron que las mutaciones en el codon 12 del gen K-ras es un evento infrecuente en cáncer gástrico (13). 

Poco se conoce acerca de las causas genéticas específicas que determinan el desarrollo de un adenocarcinoma gástrico por lo tanto, es importante evaluar los posibles cambios que se producen en dicho oncogen en las diferentes lesiones de las vías digestivas superiores. 

Así mismo, la identificación de estas alteraciones, pueden ser importantes para el diagnóstico y pronóstico de algunos tipos de tumores además de ser utilizadas como marcadores tumorales para evaluar el grado de respuesta a determinados tratamientos. 

PACIENTES Y MÉTODOS 

Pacientes 

Se estudiaron 62 pacientes que acudieron a la consulta en el Servicio de Gastroenterología del Hospital Universitario de Caracas, Universidad Central de Venezuela. Los pacientes fueron incluidos en el protocolo de investigación previa participación del objeto de estudio y la obtención de su consentimiento informado. 

Endoscopia 

A cada paciente se le tomaron 3 biopsias de mucosa gástrica, específicamente de la cara anterior de antro, una biopsia fue destinada para detectar la presencia del microorganismo H. pylori mediante la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) como métodos de diagnóstico. Una biopsia se empleó para determinar mutaciones puntuales del oncogen K-ras 12 a través de técnicas de biología molecular y otra muestra para el estudio histológico. 

Detección de H. pylori mediante RCP 

Determinación de la mutación en el codón 12 del gen K-ras 

El ADN genómico extraído fue amplificado mediante RCP empleando iniciadores específicos para el codon 12 del gen K-ras utilizando los siguientes iniciadores específicos: 5’ GACTG AGTAC AAACT GGTGG y 3’ CTCTA TGGTG GGATC ATATT. Posteriormente, las mutaciones puntuales en el oncogen K-ras 12, fueron detectadas mediante hibridación molecular selectiva utilizando sondas de oligonucleótidos altamente específicos para los aminoácidos glicina, arginina, cisteína, serina, alanina, aspártico y valina (14-16). 

Análisis estadístico 

Para este análisis se utilizó la prueba de Fisher’s de dos variables empleando Odds Ratios (OR) con 95% de intervalo de confianza. 

RESULTADOS 

Las muestras seleccionadas para este estudio fueron clasificadas y agrupadas de acuerdo a 5 entidades clínicas basado en el diagnóstico histológico obteniéndose la siguiente distribución: 31 pacientes con gastritis crónica activa (GCAc), 10 con gastritis crónica atrófica (GCAt), 9 con metaplasia intestinal (MI), 6 con cambios displásicos (CD) de bajo grado y 6 con cáncer gástrico (CG): 3 pacientes con diagnóstico histopatológico pobremente diferenciado y 3 pacientes moderadamente diferenciado. 

De acuerdo a la detección de pacientes positivos para la infección de H. pylori determinado mediante la reacción en cadena de la polimerasa, se obtuvo un 77% (48/62) de pacientes infectados y un 23% (14/62) resultaron negativos. 

Al evaluar la distribución de la infección por H. pylori con relación a cada una de las patologías gástricas se encontró que un 90% (28/31) de los pacientes infectados fueron asociados a gastritis crónica activa, 70% (7/10) con gastritis crónica atrófica, seguido por metaplasia intestinal con un 67% (6/9), 83% (5/6) con cambios displásicos y un 33% (2/6) con cáncer gástrico (Tabla I). No se observó una diferencia estadísticamente significativa entre gastritis crónica activa en relación a cada una de las patologías gástricas ni cuando se analizaron los paciente infectados agrupados con lesiones preneoplásicas y cáncer gástrico 64% (20/31) y pacientes con GCAc.

TABLA I

   GCAc: gastritis crónica activa.    GCAt: gastritis crónica atrófica.    MI: metaplasia intestinal.    CD: cambios displásicos.    CG: cáncer gástrico. 

En la evaluación de las mutaciones para el codon 12 del oncogen K-ras, se observó que un 68% (42/62) de los pacientes presentaron mutaciones en los diferentes aminoácidos estudiados, mientras que no se detectaron en el 32% (20/62). 

El aminoácido que se encontró con mayor frecuencia mutado fue Asp lo cual representó un 37% (23/62), seguido de Val con 27% (17/62), Ala con 21% (13/62), Ser con 15% (9/62), Cys 10% (6/62) y por último Arg con un 3% (2/62). 

Se pudo observar que existe una combinación variada de mutaciones entre muestras del mismo grupo de patologías y en un mismo paciente, determinándose mutaciones en forma simple y combinadas, el 37% (23/62) de los pacientes presentaron mutaciones simples siendo los aminoácidos más frecuente el Asp (7/23) seguido por el aminoácido Val (6/23). Así mismo, la presencia de mutaciones dobles fue representada por un 21% (13/62) siendo las combinaciones más frecuentes Ser-Asp (3/13) y Asp-Val (3/13) por último, los pacientes con mutaciones en tres y cuatro aminoácidos correspondieron a un 10% (6/62). 

Al evaluar la frecuencia de las mutaciones del oncogen K-ras 12 con relación a las diferentes patologías gástrica, se encontró que el 65% (20/31) corresponde a las lesiones de GCAc, 80% (8/10) con lesiones GCAt, 55% (5/9) con MI, 83% (5/6) con CD y 66% (4/6) con cáncer gástrico. En ningún caso se observó diferencia estadisticamente significativa. 

En el análisis de las mutaciones en el oncogen K-ras 12 en relación a las patologías gástricas y la presencia de H. pylori se observó que no existe asociación entre la infección por este microorganismo y la generación de las distintas mutaciones en el oncogen K- ras 12 (Tabla II).

TABLA II

PRESENCIA DE LAS MUTACIONES EN EL ONCOGEN K-ras 12 EN RELACIÓN CON LAS PATOLOGÍAS GÁSTRICAS EN PACIENTES INFECTADOS CON H. pylori 

DISCUSIÓN 

En la presente investigación, se pudo observar que la presencia de H. pylori es mayor en las lesiones con gastritis crónica activa en comparación con las lesiones preneoplásicas y cáncer gástrico (4, 17) indicando que la infección por H. pylori pudiera ser el factor causante más importante de la gastritis crónica activa en el mundo (18, 19), así mismo, se propone que H. pylori podría ser un iniciador de las etapas de la carcinogénesis gástrica. La bacteria es capaz de degradar la barrera gástrica alterando su función dada su migración hacia zonas intercelulares (2, 20, 21) y estimulando la proliferación de las células epiteliales en comparación con individuos sanos, lo cual condiciona la producción de metabolitos tóxicos así como la activación de la respuesta inflamatoria por parte del hospedador (2, 22-26). El incremento de la replicación celular puede potenciar la acción de carcinógenos y aumentar la tasa de mutaciones endógenas y exógenas (8, 10, 27). Todos estos eventos generan daños ultraestructurales en el tejido gástrico y en consecuencia al ADN (28, 29), pasando a ser un microambiente desfavorable para el propio organismo y limitando así su crecimiento y proliferación, lo cual podría explicar una menor prevalencia de la infección en etapas como GCAt, MI, CD y cáncer gástrico (7, 18, 19). 

Es importante estudiar la naturaleza de los cambios producidos por este microorganismo en el genoma del hospedador, que pudieran promover la progresión hacia lesiones neoplásicas y además establecer si los agentes que ocasionan estas alteraciones pueden ser o no atribuibles únicamente a la infección, debido a que algunas poblaciones con alta prevalencia de H. pylori sólo una minoría de los pacientes desarrollan cáncer gástrico (3). Otro estudio demostró similares porcentajes de infección tanto en pacientes con cáncer gástrico como en controles representado por el 70% y 69% respectivamente, sugiriendo que la infección por H. pylori puede ser un posible factor de riesgo no solo en cáncer gástrico sino también en GCAc y en úlcera peptídica (10). Kato y col. (30) realizaron investigaciones en diferentes regiones del Japón, observando que la prevalencia de la infección en pacientes con cáncer gástrico fue marcadamente alta, y la misma fue mayor en la etapa temprana que en el estado avanzado de la enfermedad. 

Las alteraciones genéticas en cáncer gástrico se producen debido a fallas durante el proceso de reparación del ADN y subsecuentemente la “fijación” de estas alteraciones por división celular (28). El daño al ADN conduce a la activación de oncogenes, deleciones, mutaciones a genes supresores de tumor (2, 28, 31), alteraciones en factores de crecimiento y moléculas de adhesión (28, 12).En tal sentido, el concepto de oncogenes ha revolucionado la comprensión del cáncer lo cual tiene un valor clínico aplicable (32). 

Se ha determinado que cerca del 90% de los cánceres pancreáticos contienen mutaciones puntuales en K-ras (33, 34), 50% se ha observado en cáncer de colon (35, 36) y 50% en cáncer de tiroides (37), siendo infrecuentes o no existentes en cáncer de ovario y de mama (38). En cáncer de pulmón las mutaciones puntuales fueron determinadas en K-ras pero no en H-ras o N-ras lo cual, puede reflejar una relativa alta expresión de K-ras en este tejido (39). Diferentes estudios han determinado una baja frecuencia de mutaciones puntuales en el oncogen K-ras en tumores del tracto gastrointestinal superior, dichos resultados indicaron que mutaciones puntuales en el codon 12 del oncogen K-ras no ocurre o es un evento poco común (14, 40-44), sin embargo, aun cuando dichas mutaciones son poco frecuentes en pacientes norteamericanos, el porcentaje es alto en otras poblaciones tales como Japón (45, 46) y Colombia (47). En la población venezolana estudiada se observó que las patologías gástricas evaluadas presentaron mutaciones en el oncogen K-ras. Por otra parte, si bien dicho oncogen en algunos casos no ha sido encontrado mutado éste puede ser observado amplificado o sobreeexpresado (48, 49). Es interesante que el patrón de mutaciones en el codon 12 del oncogen K-ras difiera en un gran número de adenocarcinomas de diferentes orígenes (32). Por otra parte, el análisis retrospectivo en un número de pacientes podría indicar la manera en que las mutaciones puntuales en un oncogen en particular como K-ras puede establecer un tiempo de sobrevida del paciente constituyendo un factor de pronóstico (32). 

El conocimiento de las mutaciones puntuales en K-ras no solo están orientadas a establecer un posible marcador de pronostico; recientes reportes han sugerido que las células tumorales que presentan mutaciones puntuales en los oncogenes ras in vitro, pueden favorecer la resistencia a radiaciones, y algunas drogas (50). 

Un enfoque importante del estudio fue determinar la frecuencia en que se presentan las mutaciones puntuales en el codon 12 del oncogen K-ras en las diferentes patologías gástricas, así mismo establecer un sistema de seguimiento que pudiera explicar la fijación de estas mutaciones. La distribución de los cambios con respecto a dicho oncogen reflejó la presencia de mutaciones puntuales simples y combinadas en el mismo tejido en relación a las diferentes patologías gástricas, posiblemente producto de la heterogeneidad de las muestras estudiadas. Además, en la primera etapa de la carcinogénesis gástrica representada por la GCAc se observó el mayor número de mutaciones tanto en forma simple como en forma combinada correspondiente a la mayoría de los aminoácidos analizados. Esta variabilidad pudiera deberse a una alta tasa de proliferación celular debido a factores etiológicos y a la activación de los mecanismos inflamatorios por parte del hospedador, lo cual es característico en esta primera etapa involucrada en el proceso carcinogénico. Al progresar las etapas hacia cáncer gástrico se fijan ciertas mutaciones específicas que originan una clonalidad celular. Al analizar las mutaciones en cada una de las patologías se observaron cambios que producen la aparición de los aminoácidos asp-val-ala en el oncogen K-ras en los pacientes con: GCAc, GCAt, MI y CD, lo que conllevó a proponer un diagrama secuencial que ilustraría los marcadores importantes que podrían influenciar la aparición de la lesión (Fig. 1). 

AGRADECIMIENTO 

La Investigación fue subvencionada por el Proyecto FONACIT S1-96001408 y el Proyecto Iniciativa MILLENIUM 4572-B. 

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Autor de correspondencia: Patrizzia Mastromatteo. Calle Sucre, Edif. Obelisco B, Piso 3, Apt. 6, Chacao. Caracas, Venezuela. Correo electrónico: patrizia_mast@hotmail.com