Efecto protector de la melatonina y el tiosulfato de sodio sobre la histopatología y la ultraestructura del riñón en ratas con intoxicación aguda por Paraquat.

Elizabeth Ramírez-Zambrano¹, Eulogia Zambrano², Gloria Rojas¹, Miguel Zambrano¹ y Luis Teneud³.

¹Cátedra de Histología, ²Departamento de Farmacología y Toxicología, ³Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina, Universidad de Los Andes. Mérida, Venezuela. Correo electrónico:anaer@ula.ve

Resumen. La intoxicación aguda con paraquat (PQ) produce daños severos en muchos órganos, entre ellos el riñón, donde se desarrolla insuficiencia renal. Se han utilizado varios antídotos en el tratamiento de la intoxicación por PQ sin resultados satisfactorios. En este estudio se determinó el efecto protector de la melatonina (MLT) y el tiosulfato de sodio (TSS) sobre el riñón, en ratas con intoxicación aguda por paraquat. Se utilizaron 40 ratas Wistar, machos, divididas en 4 grupos de 10 ratas cada uno. Al grupo I, control, se le inyectó 1 ml de solución fisiológica, vía intraperitoneal (ip); el grupo II, recibió DL₅₀ de PQ, ip; los grupos III y IV recibieron DL₅₀ de PQ, y simultáneamente la primera dosis de MLT (15 mg/kg) o TSS (1,5 g/kg), respectivamente (ip). Treinta minutos después, los grupos III y IV recibieron otra dosis igual de MLT y TSS. A las 24 horas de tratadas las ratas fueron sacrificadas con pentobarbital, extrayéndose el riñón para su estudio morfológico. Con la microscopía de luz y electrónica, en el grupo II se evidenciaron cambios morfológicos de necrosis tubular aguda en el túbulo proximal; observándose hallazgos similares de menor intensidad en los animales tratados con los antídotos, sugiriendo una protección parcial. En conclusión, el uso individual de la MLT y TSS, en las dosis y plazo empleados, revierte parcialmente el daño que causa el paraquat a la célula. En consecuencia, son necesarias más evaluaciones de estas drogas para su uso clínico en el tratamiento de la intoxicación por paraquat.

Palabras clave: Paraquat, melatonina, tiosulfato, renal.

Protective effect of melatonin and sodium thiosulphate on histopathology and ultrastructure of the kidney in rats with acute intoxication for Paraquat.

Abstract. Paraquat (PQ) toxicity produces severe injures in many major organs systems, including kidney, developing renal failure with fatal evolution in most of the cases. Several antidotes have been used in the treatment of paraquat intoxication without satisfactory results. The antioxidative effect of melatonin (MLT) and sodium thiosulphate (STS) on kidney in rats with acute intoxication by PQ was studied. Forty male Wistar rats were used, divided in 4 groups of 10 rats each. Group I, control, was injected intraperitoneally (ip) with 1 ml of saline solution; group II, received DL₅₀ of PQ, ip; groups III and IV, DL₅₀ of PQ, and simultaneously the first dose of MLT (15 mg/kg, ip) or STS (1,5 g/kg, ip) respectively. Thirty minutes later, groups III and IV received a second similar dose of MLT and TSS. After 24 hours, rats were sacrificed with pentobarbital, and kidneys were extracted for morphological study. Light and electronic microscopy observations showed in group II morphological changes of acute tubular necrosis in proximal tubule in group II, similar findings, with lesser magnitude, were observed in the animals treated with the antidotes, suggesting a partial protection. In conclusion, individual use of MLT and STS at the doses and time used partially prevent damage caused by paraquat to the cell. In consequence, more experiments with these drugs are necessary to considere them as specific treatments in cases of poisoning by paraquat.

Key words: Paraquat, melatonin, sodium sulphate, renal.

Recibido: 26-01-2006. Aceptado: 08-06-2006.

El paraquat (PQ) es un herbicida ampliamente utilizado como desecativo de las plantas, para preservar las cosechas. Se expide en forma líquida, es de color rojo parduzco, parecido al ron o a la “coca-cola”, insípido, de aquí que ocurran envenenamientos accidentales; aunque también se ha usado con fines suicidas (1). Su acción bioquímica está dada por su forma reducida, ésta interfiere la reacción de transferencia de electrones inhibiendo la reducción del NADP a NADPH y de la xantino-oxidasa, iniciando las reacciones que llevan a mayor producción de especies oxígeno reactivas (anión superóxido, peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilos) con la subsecuente peroxidación de lípidos (1-4). Este proceso de peroxidación produce alteraciones notables de la estructura y función de las membranas, especialmente de las mitocondrias y del retículo endoplásmico. En las mitocondrias, el PQ afecta el transporte de electrones en la membrana interna lo que conlleva a una disminución de la capacidad fosforilativa/oxidativa, pérdida de enzimas y nucleótidos (5, 6). 

Los efectos del PQ en el humano usualmente son muy similares a los ocasionados en ratas y en otros animales experimentales. La intoxicación por PQ produce principalmente daño en el pulmón, caracterizado por insuficiencia respiratoria, constituyéndose en la primera causa de muerte de estos pacientes. Así, la investigación en el tratamiento de la intoxicación por PQ se ha enfocado en las lesiones pulmonares (2). Sin embargo, existen complicaciones en otros órganos. Por ejemplo, en el riñón es muy frecuente la insuficiencia renal por necrosis tubular aguda nefrotóxica; debido a que el PQ es concentrado por la célula tubular proximal, ejerciendo su efecto tóxico en ese sitio (7-12). 

Hasta el momento no se ha conseguido un antídoto efectivo en el tratamiento de intoxicación con PQ. Se han utilizado diversas sustancias, entre otras la catalasa, superóxido dismutasa, deferoxomina, vitamina E, vitamina C, N-Acetilcisteína, glutatión; además de procedimientos como la hemodiálisis precoz (3, 13-19). También se han empleado la Melatonina (MLT) y el Tiosulfato de Sodio (TSS), para determinar el efecto de estos dos antioxidantes sobre los daños inducidos por PQ en pulmón e hígado; encontrándose protección contra la toxicidad oxidativa inducida por el PQ (20-25). Sin embargo, los estudios toxicológicos y farmacológicos no son suficientes para considerar aún su uso clínico. 

El objetivo de éste trabajo fue determinar, histológicamente, si el uso individual de la MLT y el TSS protege contra el daño que ocasiona el PQ a las células renales del túbulo proximal en ratas; y comparar si hay diferencias del efecto protector de ambos medicamentos, que pudieran brindar utilidad en la intoxicación por PQ en humanos. 

MATERIAL Y MÉTODOS 

Se utilizaron 40 ratas Wistar machos con peso entre 250 y 270 g, divididos en 4 grupos de 10 ratas cada uno. Las drogas empleadas, Paraquat (Gramoxone^®, Imperial Chemical Industries), Melatonina (Biosigma) y Tiosulfato de Sodio (Biosigma) se administraron por vía intraperitoneal (IP). El grupo I (control) recibió 1 ml/Kg de solución fisiológica. El grupo II, sólo recibió PQ a una dosis de 27,5 mg/Kg (DL₅₀). Al grupo III, se le administró la DL₅₀ de PQ y, simultáneamente, la primera dosis de MLT (15 mg/Kg). El grupo IV, recibió la DL₅₀ de PQ y, simultáneamente, la primera dosis de TSS (1,5 g/Kg). Treinta minutos más tarde, los grupos III y IV recibieron una segunda dosis, de MLT Y TSS, respectivamente. A las 24 horas de tratados los animales, fueron anestesiados con pentobarbital sódico (50 mg/Kg, IP). Mediante laparotomía mediana se extrajeron los riñones. Las muestras, para ser estudiadas mediante microscopía de luz, se fijaron en Bouin por 72 horas, siendo procesadas por método convencional para ser incluída en parafina, realizándose cortes de 3 micras de espesor que fueron coloreadas con hematoxilina y eosina de Mayer al 0,1% (26), observándose en un microscopio de luz Medilux-12. Los fragmentos para microscopía electrónica se fijaron en una mezcla de glutaraldehido al 3% y formaldehido al 3%, luego postfijados en tetróxido de osmio al 1% y procesados para microscopía electrónica según el método descrito (27). El material se examinó en un microscopio electrónico Hitachi H-500. 

Los criterios morfológicos de necrosis tubular aguda nefrotóxica fueron los referidos por Meadows y Robbins (28, 29). Al analizar los cortes al microscopio de luz a 400x, los túbulos fueron clasificados como: sin daño, daño leve, daño moderado o daño severo. Se calculó el porcentaje de túbulos afectados por campo, y se promediaron los resultados de 6 campos. Se aplicó un ANOVA de una vía, seguido de un test de Tukey para el análisis de los datos. 

RESULTADOS 

En la Tabla I se muestran los resultados obtenidos con el empleo de la microscopía de luz. En el grupo I (control) se observaron los túbulos proximales conservados (Fig. 1). En el grupo II (PQ) se encontraron grados variables de lesión tubular, con predominio de daño severo [F(3,23) = 12,76; p < 0,0001], caracterizados por pérdida del borde en cepillo, desorganización celular, pérdida del borde apical y células epiteliales con citoplasma vacuolado y núcleos condensados (Fig. 2). Algunos túbulos mostraron dilatación y detritus celular en la luz. En los grupos III (PQ + MLT) y IV (PQ + TSS), se apreciaron cambios morfológicos similares a los descritos en el grupo II pero, a diferencia de éste último, la mayoría de los túbulos presentaba daño moderado, [para el grupo II, F(3,23) = 18,32; p < 0,0001; para el grupo III, F(3,23) = 0,94; no significativo] (Fig. 3). Al comparar la presencia de daño tubular severo en los 3 grupos, ambos antídotos mejoraron significativamente las alteraciones provocadas por el PQ [F(2,17) = 17,45; p < 0,0001].

DAÑO TUBULAR RENAL. PORCENTAJES DE TÚBULOS LESIONADOS EN DIFERENTES GRADOS DE ACUERDO AL TRATAMIENTO RECIBIDO (EXPRESADO EN PROMEDIO ± ERROR ESTÁNDAR)

* p < 0,0001.

Microscopía electrónica: en el grupo I, se observaron los túbulos proximales con características normales en la organización de las microvellosidades y el contenido de sus organelas (Fig. 4). Las células epiteliales proximales de los animales del grupo II, mostraron daños severos, como ruptura del polo apical, alteración de la arquitectura de las microvellosidades, mitocondrias edematizadas con pérdida de las crestas, grandes lisosomas, dilatación de las cisternas del retículo endoplásmico rugoso con degranulación, y lisis del citoplasma (Fig. 5). En los grupos III y IV se encontraron células epiteliales proximales con los mismos daños antes descritos y en otras células sólo edema en citoplasma y mitocondrias (Fig. 6). Todos los grupos mostraron integridad en la membrana basal tubular.

Los cambios descritos son similares a los observados por otros autores sobre el daño epitelial renal causado por paraquat (7, 9-12, 30, 31) y han sido descritos en la necrosis tubular aguda nefrotóxica (28, 29). Al comparar el daño estructural del tejido renal en las ratas intoxicadas con PQ y los grupos tratados con MLT y TSS, se observó que los daños en las células del túbulo proximal fueron similares, aunque en los animales tratados con los antídotos el porcentaje de túbulos afectados con daño severo era significativamente menor. 

  In vivo e in vitro, la MLT Y TSS han mostrado un importante efecto antioxidante contra la toxicidad del paraquat (20-25). En el presente experimento, estas drogas no interfirieron o compitieron con el PQ para evitar el efecto de éste sobre el sistema de oxidorreducción y así evitar el daño celular tubular renal. Sin embargo, el hecho de encontrar cambios leves en las células de los túbulos proximales a la ultraestructura, en los grupos tratados con los antídotos, sugiere una protección parcial. 

En otros trabajos, se han obtenido resultados favorables sobre el tejido pulmonar y hepático luego de la administración de MLT o TSS durante 3 a 7 días consecutivos (20, 24), lo que podría explicar la poca efectividad de estos antídotos en el presente estudio. Además, se ha demostrado con el uso combinado del MLT y TSS que la extensión del daño en el parénquima pulmonar es menor, considerándose un efecto sinérgico de ambos medicamentos como restauradores de los depósitos de glutatión (datos no publicados). 

Como se mencionó anteriormente, el mecanismo citotóxico del PQ es fundamentalmente la producción de radicales superóxido, conduciendo a la peroxidación lipídica en las membranas. Se ha determinado en el hígado de rata que la quinona-NADH oxidoreductasa de la membrana externa mitocondrial productora de especies oxígeno reactivas, es un nuevo sistema de oxidorreducción participante en la toxicidad del PQ (32), lo que explica el daño selectivo del PQ a la mitocondria in vivo e in vitro. En el riñón, estos efectos del PQ se han estudiado en el túbulo proximal, donde se desacopla la fosforilación oxidativa que induce la peroxidación lipídica, inhibición de la cadena redox y la actividad ATP sintetasa; además en este segmento tubular se ha demostrado un mecanismo de transporte activo para el PQ que no se ha encontrado en el túbulo distal (9-12). Esto explica el daño celular por la mayor concentración de PQ en el túbulo proximal. También se ha comprobado una elevación de las enzimas antioxidantes en las células glomerulares, que protegen las funciones renales contra el daño inducido por los radicales superóxido, sugiriendo que estas enzimas juegan un papel importante en los desórdenes funcionales inducidos por los radicales. Esta modulación constituye uno de los mecanismos de resistencia al daño renal agudo (33). 

En conclusión, en el presente trabajo el uso individual de la MLT y TSS, en las dosis empleadas, a corto plazo no evitaron el daño estructural que causa el PQ a las células del tubulo proximal del riñón de ratas, por lo que aún no pueden ser considerados como tratamiento específico en los pacientes intoxicados con PQ. Por esto, son necesarios nuevos ensayos utilizando estos dos antídotos, de forma individual o combinada, por tiempo más prolongado, para determinar si hay un verdadero efecto protector sobre el tejido renal y así poder ser recomendados en la terapia clínica. 

AGRADECIMIENTOS 

A la Unidad de Investigación en Ultraestructura, Facultad de Medicina, de la Universidad Centro-Occidental Lisandro Alvarado. Al Consejo de Desarrollo Científico, Humanístico y Tecnológico de la Universidad de Los Andes (CDCHT-ULA) por la ayuda financiera para la realización de este trabajo, mediante el proyecto M-586-96-03-C. 

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Autor de correspondencia: Elizabeth Ramírez-Zambrano. Cátedra de Histología, Facultad de Medicina, Universidad de Los Andes. Av. Tulio Febres, Mérida, 5101, Venezuela. Correo electrónico: anaer@ula.ve