Variaciones fenotípicas de susceptibilidad en cepas de Klebsiella pneumoniae de origen nosocomial y su asociación con la formación de biopelículas.

Silvio Barreto¹, María Zambrano² y María Araque¹.

¹Laboratorio de Microbiología Molecular, Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia y Bioanálisis, Universidad de Los Andes, Mérida 5101, Venezuela y

²Grupo de Genética Molecular, Corporación CorpoGen, Bogotá, DC, Colombia.

Resumen. Klebsiella pneumoniae constituye uno de los principales patógenos oportunistas asociado con infecciones nosocomiales. La morbi-mortalidad producida por este microorganismo está relacionado en gran parte con la resistencia antimicrobiana y la capacidad de formar biopelículas. En este estudio se analizaron las variaciones fenotípicas de susceptibilidad de 50 cepas de K. pneumoniae (26, productoras de bLEE y 24, no productoras de bLEE) aisladas de pacientes pediátricos con septicemia nosocomial, recluidos en la Unidad de Alto Riesgo Neonatal del Instituto Autónomo Hospital Universitario de Los Andes, Mérida, Venezuela y su asociación con la formación de biopelículas. Las cepas fueron identificadas según los métodos microbiológicos estandarizados, los patrones de susceptibilidad se determinaron por concentración inhibitoria mínima, y la formación de biopelícula por técnicas espectrofotométricas. La mayoría de las cepas productoras de bLEE se asociaron con frecuencia a otros marcadores de resistencia, tales como: tobramicina, kanamicina, tetraciclina, cloranfenicol (38%, cada uno), estreptomicina (36%), y netilmicina (34%). El fenotipo multirresistente predominante fue el constituido por bLEE⁺-AMG-TET-CLF (30%). El 18% de las cepas de K. pneumoniae fue sensible a los antibióticos probados. La formación de biopelículas se observó en el 77,8% de las cepas sensibles y en el 96,2% de las resistentes. No hubo relación estadística entre las variaciones fenotípicas de susceptibilidad y la formación de biopelículas (p= >0,05). Sin embargo, ambas características en K. pneumoniae deben ser consideradas en el momento de decidir una conducta terapéutica para el tratamiento de pacientes con infección nosocomial.

Palabras clave:  Klebsiella pneumoniae, nosocomial, susceptibilidad antimicrobiana, biopelícula.

Phenotipic variations of susceptibility in Klebsiella pneumoniae strains of nosocomial origin and their association with biofilms formation.

Abstract. Klebsiella pneumoniae is the principal opportunist pathogen associated with nosocomial infections. The morbidity and mortality produced by this microorganism is related mostly to antimicrobial resistance and its capacity to form biofilms. In this study, the phenotypic variations of susceptibility in 50 Klebsiella pneumoniae strains (26 bLEE-producer and 24 no bLEE-producer) isolated from pediatric patients with nosocomial septicemia at the High-risk Neonatal Unit of the Instituto Autónomo Hospital Universitario de Los Andes, Mérida, Venezuela and their associations with biofilm formation were analyzed. These strains were biochemically identified by standard microbiology methods. Antimicrobial susceptibility was determined by minimal inhibitory concentration and biofilm formation was detected by spectrophotometric techniques. Most of bLEE strains were frequently associated with resistance markers such as tobramycin, kanamycin, tetracycline, chloramphenicol (38% each), streptomycin (36%) and netilmicin (34%). The predominant multiresistent phenotype was composed of bLEE⁺-AMG-TET-CLF (30%). 18% of K. pneumoniae strains were sensible to the antibiotics tested. Formation of biofilm was observed in 77.8% and 96.2% of sensible and resistent strains, respectively. There was no statistic relation between phenotipic variations of susceptibility and biofilm formation (p= >0.05). However, both characteristics of K. pneumoniae should be evaluated to determine the therapeutic conduct to treat patients with nosocomial infection.

Recibido: 25-03-2008. Aceptado: 20-11-2008.

INTRODUCCIÓN

K. pneumoniae es uno de los principales patógenos nosocomiales que con frecuencia produce infecciones graves, especialmente en la población pediátrica recluida en las unidades de cuidado intensivo neonatal (1, 2). Varios brotes o epidemias nosocomiales han estado asociados con cepas de K. pneumoniae resistentes a cefalosporinas de tercera generación, debido a la producción de b-lactamasas de espectro expandido (bLEE). Los genes TEM y SHV que codifican para las bLEE están mediados por plásmidos conjugativos que, a menudo, portan otros determinantes de resistencia, como el de la resistencia a los aminoglucósidos y quinolonas (3).

K. pneumoniae incrementa su virulencia no solo por presentar diversos marcadores de resistencia, sino por expresar en su superficie diversos factores de adherencia (fimbrias, pili, exopolisacáridos, entre otros) que le permiten además de colonizar los tejidos del hospedero, adherirse a superficies abióticas donde se organiza en comunidades bacterianas llamadas biopelículas (4, 5).

La biopelícula es un depósito no estructurado de células y de glucocáliz acumulado, compuesto por exopolisacáridos y una compleja comunidad de bacterias, donde se observa un ensamblado de microorganismos dentro de una matriz con la capacidad de adherirse a biomateriales o tejidos dañados del hospedero (6).

La cronicidad o persistencia de algunos procesos infecciosos causados por K. pneumoniae están asociados a la formación de biopelículas en dispositivos o implantes médicos (sondas, catéteres, prótesis, etc.) (4). Las infecciones donde las biopelículas están involucradas son difíciles de tratar con antibióticos, debido a que estos no logran penetrar en su estructura (7). La naturaleza aniónica del exopolisacárido retarda la difusión de los antibióticos catiónicos como los aminoglucósidos. Este fenómeno químico retarda la muerte celular al conferirle mayor tiempo a la bacteria para que implemente una respuesta adaptativa. En el caso, de microorganismos productores de b-lactamasas como K. pneumoniae, aumentan la producción enzimática en respuesta a la exposición del antibiótico b-lactámico; las b-lactamasas se acumulan en el exopolisacárido como resultado de su secreción o por lisis celular, producciéndo de esta manera la inactivación del b-lactámico en las capas superficiales de la biopelícula y evitando que el antibiótico se difunda hacia el interior de la misma (6, 8, 9).

Por otra parte, en la biopelícula las bacterias cohabitan en microcolonias, que favorecen la transferencia de plásmidos por conjugación y promueven de esta manera la acumulación de determinantes de resistencia (7).

El objetivo de este estudio fue determinar las variaciones fenotípicas de susceptibilidad en cepas de K. pneumoniae de origen nosocomial y su asociación con la formación de biopelículas en placas de policloruro de vinilo.

MATERIALES Y MÉTODOS 

El aislamiento y la identificación bioquímica de K. pneumoniae se realizó de acuerdo a la metodología clásica descrita por Koneman y col. (10).

Los fenotipos de susceptibilidad fueron determinados por concentración inhibitoria mínima (CIM) siguiendo el método de dilución en agar de acuerdo a la técnica estandarizada por Woods y Washington (11). Los resultados de la CIM fueron interpretados de acuerdo a lo descrito por el Clinical and Laboratory Standards Institute (12). Los antimicrobianos utilizados en estos ensayos fueron: piperacilina-tazobactam (Wyeth-Lederle), meropenem (AstraZeneca), tobramicina (Valmorca), netilmicina (Schering-Plough), kanamicina (Bristol-Myers), estreptomicina (Sigma), gentamicina (Farmachem), amikacina (Renochem-AG), tetraciclina (Sigma), cloranfenicol (Sigma) y ciprofloxacina (Proula) Se consideró como fenotipo multirresistente toda cepa con producción de bLEE asociada a otros marcadores de resistencia. Se utilizó Escherichia coli ATCC 25922 como cepa control de estos ensayos.

Para la determinación de la formación de biopelículas en las cepas de K. pneumoniae, fue necesario establecer previamente el tiempo de ocurrencia de la fase estacionaria del crecimiento en dos cepas del grupo de estudio seleccionadas al azar y las cepas control Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, K. pneumoniae MZ2098 y K. pneumoniae ATCC 23357. Se realizó una curva de crecimiento mediante el cultivo de las cepas en caldo Luria Bertani (LB) en aerobiosis a 37 ⁰C, y se verificó cada hora la concentración de células por densidad óptica (DO). Los resultados determinaron que la fase estacionaria ocurrió durante el lapso de 10 a 18 horas. Teniendo en cuenta este resultado y lo reportado en la literatura (13, 14), se establecieron 18 horas de incubación como el tiempo suficiente para que las cepas bacterianas en fase estacionaria formaran biopelículas. Posteriormente, se estandarizó el inóculo bacteriano para los ensayos de determinación de la biopelícula, a partir de cultivos frescos de 18 horas en caldo BHI suplementado con MOPS 2 mM (3-[N-morfolino] ácido propanosulfónico (Sigma), se tomaron 100 µL de cultivo de cada cepa y se colocaron en los pozos de una placa de policloruro de vinilo (PVC) (BD, Falcon), se leyó en un espectrofotómetro (Genios Tecan) a una longitud de onda de 595 nm. Las densidades ópticas alcanzadas en las 50 cepas de K. pneumoniae oscilaron entre 0,19 y 0,52. Con base en estos resultados, todas las cepas fueron ajustadas a un inóculo correspondiente a una DO de 0,19 en caldo BHI-MOPS.

La formación de biopelícula se realizó de acuerdo al procedimiento descrito por O’Toole y col. (14) modificado por Suescún y col. (15). Se colocaron 150 µL del inóculo estandarizado de cada cepa en un pozo de una placa de PVC, a 37°C por 18 horas. Se verificó el crecimiento bacteriano en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 595 nm.

Para visualizar la formación de la biopelícula se removieron las células planctónicas (bacterias libres), y se descartó el medio de cultivo por inmersión de la placa de PVC en un bandeja con agua destilada y se dejó secar a temperatura ambiente por 20 minutos. Posteriormente, las células sésiles (adheridas a las paredes del pozo) fueron teñidas con 200 µL del colorante cristal violeta al 1%, por 20 minutos a temperatura ambiente. El exceso de colorante fue eliminado lavando los pozos 3 veces con agua destilada. La formación firme de un anillo violeta adherido a la superficie interna del pozo acompañada de una DO>0,23 se consideró como una prueba positiva para la producción de biopelícula.

Para el procesamiento estadístico de los datos se utilizaron el Statistical Product and Service Solutions (SPSS) versión 11.0, el Statistical Analysis System (SAS) versión 8.02 y el Origin 5.0. Los resultados fueron analizados mediante la aplicación de la prueba Chi cuadrado y el test exacto de Fisher. Una p < 0,05 se consideró con significancia estadística.

RESULTADOS 

En la Tabla I, se muestra que las cepas de K. pneumoniae bLEE+ se asociaron con mayor frecuencia a la presencia de otros marcadores de resistencia, con porcentajes superiores al 30% para la resistencia a tobramicina, kanamicina, tetraciclina, cloranfenicol, estreptomicina y netilmicina, 20% para gentamicina y 18% para piperacilina-tazobactam y amikacina. Aunque en el grupo de cepas bLEE- el porcentaje de resistencia a los antibióticos no superó el 22%, los marcadores de resistencia más frecuentes fueron: en primer lugar, estreptomicina (22%), seguida por tobramicina y netilmicina (14%, respectivamente). Todas las cepas fueron sensibles al meropenem y ciprofloxacina, independientemente de la producción o no de bLEE. De igual forma, se observó que el grupo de K. pneumoniae bLEE+, mostró rangos inhibitorios para la mayoría de los antibióticos iguales o superiores a una dilución en comparación con los valores mostrados por las cepas bLEE-. 

La formación de biopelícula se observó en la mayoría de las cepas estudiadas (45/50; 90%) a una DO>0,23. De este grupo de cepas, el 75,6% (34/45) produjo biopelículas a una DO>0,8. Sólo 5 cepas (0,1%) registraron DO £ 0,23, lo cual se correspondió con la no formación de biopelícula (Fig. 1). Los resultados de la asociación de los patrones de susceptibilidad a los antibióticos con la formación de biopelículas se muestran en la Tabla II. El 18% de las cepas de K. pneumoniae no presentaron marcadores de resistencia. De este grupo, el 77,8% formó biopelícula, mientras que más del 90% de las cepas resistentes produjo biopelículas. El fenotipo multirresistente más frecuente (30%) fue el constituido por bLEE⁺-aminoglucósidos-tetraciclina- cloranfenicol (bLEE⁺-AMG-TET-CLF). Casi todas las cepas que conformaron este fenotipo formaron biopelículas (93,3%). No se observó significancia estadística entre los diferentes patrones de susceptibilidad y la producción de biopelícula (p >0,05).

DISCUSIÓN

K. pneumoniae ha sido reconocida como una de las especies en las que se han detectado con mayor frecuencia diversos mecanismos de resistencia, especialmente la producción de b-lactamasas y de enzimas modificadoras de aminoglucósidos (1-3).

En este estudio, se demostró que más del 30% de las cepas de K. pneumoniae bLEE+ se asoció con frecuencia a otros marcadores de resistencia tales como: tobramicina (38%), kanamicina (38%), tetraciclina (38%), cloranfenicol (38%), estreptomicina (36%), netilmicina (34%) y piperacilina-tazobactam (18%). Estos resultados avalan las afirmaciones de Kizirgil y col. (16), quienes sustentan que cepas de K. pneumoniae productoras de bLEE aisladas en Unidades de Cuidado Intensivo, son frecuentemente más resistentes a los aminoglucósidos que aquellas que no producen esta enzima. De hecho, los patrones bLEE⁺- AMG-TET-CLF y bLEE⁺-AMG-TET-CLF- Pip/ Taz fueron los fenotipos multirresistentes predominantes (30 y 18% respectivamente).

Donlan y Costerton (6) señalaron que las bacterias que forman biopelículas disminuyen considerablemente su susceptibilidad a los agentes antimicrobianos. Esto es debido, por una parte, a que el transporte o difusión de los antibióticos a través de la matriz de una biopelícula es lento o limitado y requiere concentraciones de antibióticos cien o mil veces más elevadas que las bacterias en fase planctónica (células libres) y, por la otra, la acción final de los antibióticos está impedida al encontrarse bacterias que en condición de biopelícula que reducen su tasa de crecimiento y disminuyen su actividad metabólica (22).

Otro de los fenómenos que la formación de biopelículas favorece en la población bacteriana, es el del intercambio de información genética (4, 22). Ehlers y Bouwer (23), demostraron la transferencia conjugativa de un plásmido entre diferentes bacterias gramnegativas que formaban una biopelícula. La tasa de transferencia horizontal del plásmido fue superior en varios órdenes de magnitud en la biopelícula a la de los cultivos líquidos de estas mismas bacterias. En un estudio genético previo, a 26 de las cepas estudiadas en este trabajo se les detectó un plásmido de 87 kb que mediaba además, de la producción bLEE tipo SHV-5, otros determinantes de resistencia (3). Es posible que estas cepas bajo la condición de biopelícula in vivo hayan facilitado la transferencia de marcadores de resistencia entre ellas, permitiendo de esta manera demostrar la presencia de una gran variedad de patrones de susceptibilidad que se extendieron desde bacterias totalmente sensibles a cepas con fenotipos multirresistentes complejos.

Los resultados de este estudio permiten afirmar que la resistencia antimicrobiana y la capacidad para formar biopelículas, fueron características independientes en las cepas estudiadas, pero que constituyeron las bases para el establecimiento de K. pneumoniae como un patógeno nosocomial. Por lo tanto, estás dos condiciones en K. pneumoniae deben ser evaluadas en el momento de decidir una conducta terapéutica para el tratamiento de los pacientes con infección nosocomial.

AGRADECIMIENTOS 

Este trabajo fue financiado parcialmente por el Consejo de Desarrollo Científico, Humanístico y Tecnológico (CDCHT) código: ADG FA-02-97 de la Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela.

REFERENCIAS

1. Marra AR, Wey SB, Castelo A, Gales AC, Cal RGR, do Carmo Filho JR, Edmond MB, Pereira CAP. Nosocomial bloodstream infections caused by Klebsiella pneumoniae: impact of extended-spectrum b-lactamase (ESBL) production on clinical outcome in a hospital with high ESBL prevalence. BMC Infect Dis 2006; 6:24.          [ Links ]

2. Araque M, Nieves B, Lauretti L, Rossolini GM. Molecular basis of extended-spectrum b-lactamase production in nosocomial isolates of Klebsiella pneumoniae from Mérida, Venezuela. Int J Antimicrob Agents 2000; 15:37-42.          [ Links ]

3. Araque M, Rivera I. Simultaneous presence of bla_TEM and bla_SHV genes on large conjugative plasmid carried by extended-spectrum b-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae. Am J Med Sci 2004; 327(3): 118-122.          [ Links ]

4. Parsek M, Singh P. Bacterial biofilms: an emerging link to disease pathogenesis. Annu Rev Microbiol 2003; 57:667-701.          [ Links ]

5. Yu V, Hansen D, Chien W, Sagnimeni A, Klugman K, von Gottberg A. Virulence characteristics of Klebsiella and clinical manifestations of K. pneumoniae bloodstream infections. Emerg Infect Dis 2007; 13(7):986-993.          [ Links ]

6. Donlan R, Costerton W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev 2002; 15(2): 933-951.          [ Links ]

7. Anderl J, Zahller J, Roe F, Stewart P. Role of nutrient limitation and stationary-phase existence in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47(4):1251-1256.        [ Links ]

8. Bagge N, Schuster M, Hentzer M, Ciofu O, Givskov M, Greenberg E, Niels H. Pseudomonas aeruginosa biofilms exposed to imipenem exhibit changes in global gene expression and b-lactamase and alginate production. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48(4):1175-1187.          [ Links ]

9. Fux C, Costerton J, Stewart P, Stoodley P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends Microbiol 2005; 13(1):34-40.          [ Links ]

10. Koneman EW, Allen SD, Dowell VR, Janda WN, Sommers H, Winn WC. Diagnóstico Microbiológico. Texto atlas color. 3ª. Ed. México: Editorial Médica Panamericana; 1997.          [ Links ]

11. Woods GL, Washington JA. Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods. In: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH, editores. Manual of Clinical Microbiology, 6º ed. Washington, DC. American Society for Microbiology 1995; 1327-1341.          [ Links ]

12. Clinical and Laboratory Standards Institute. Document M100-S17. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Methods for dilution antimicrobial susceptibility test for bacteria that grow aerobically M7-A7. Vol. 27, Nº 1, 17^th informational supplement Wayne, PA: CLSI. 2007. p. 98-103.          [ Links ]

13. O’Toole G, Kolter R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis. Mol Microbiol 1998; 28(3):449-461.          [ Links ]

14. O’Toole G, Pratt A, Watnick P, Newman D, Weaver V, Kolter R. Genetic approaches to study of biofilms. Methods Enzymol 1999; 310:91-109.          [ Links ]

15. Suescún A, Cubillos J, Zambrano M. Genes involucrados en la biogénesis de fimbrias afectan la formación de biopelículas por parte de Klebsiella pneumoniae. Biomédica 2006; 26:528-537.          [ Links ]

16. Kizirgil A, Demirdag K, Orden M, Bulut Y, Yakupogullari Y, Toraman Z. In vitro activity of three different antimicrobial agents against ESBL producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae blood isolates. Microbiol Res 2005; 160:135-140.          [ Links ]

17. Balestrino D, Haagensen J, Rich C, Foriester C. Characterization of type 2 quorum sensing in Klebsiella pneumoniae and relationship with biofilm formation. J Bacteriol 2005; 187(8):2870-2880.          [ Links ]

18. Raffa R, Iannuzzo J, Levine D, Saeid K, Schwartz R, Sucic N. Bacterial communication “quorum sensing” via ligands and receptors: a novel pharmacologic for the design of antibiotic drugs. J Pharmacol Exp Therap 2005; 312(2):417-423.          [ Links ]

19. Lasa I. Towards the identification of the common features of bacterial biofilm development. Int Microbiol 2006; 9:21-28.          [ Links ]

20. Rasmussen TB, Givskov M. Quorum-sensing inhibitors as anti-pathogenis drugs. Int J Med Microbiol 2006; 296:149-161.          [ Links ]

21. Mateo M, Maestre J. Biofilm: modelo de comunicación bacteriana y resistencia a los antimicrobianos. Rev Esp Quimioter 2004; 17(1):26-28.          [ Links ]

22. Drenkard E, Ausubel FM. Pseudomonas biofilm formation and antibiotic resistance are linked to phenotypic variation. Nature 2002; 416:740-743.        [ Links ]

23. Ehlers L, Bouwer E. RP4 plasmid transfer among species of Pseudomonas in a biofilm reactor. Water Sci Technol 1999; 7:163-171.        [ Links ] ]]> 1 2006 6 24 2 2000 15 37-42 3 2004 327 3 3 118-122 4 2003 57 667-701 5 2007 13 7 7 986-993 6 2002 15 2 2 933-951 7 2003 47 4 4 1251-1256 8 2004 48 4 4 1175-1187 9 2005 13 1 1 34-40 10 1997 3ª 11 1995 6º 1327-1341 12 Clinical and Laboratory Standards Institute 27 17 98-103 13 1998 28 3 3 449-461 14 1999 310 91-109 15 2006 26 528-537 16 2005 160 135-140 17 2005 187 8 8 2870-2880 18 2005 312 2 2 417-423 19 2006 9 21-28 20 2006 296 149-161 21 2004 17 1 1 26-28 22 2002 416 740-743 23 1999 7 163-171