Efectos de la exposición ocupacional a plaguicidas sobre la calidad del semen en trabajadores de una comunidad agrícola del estado Mérida, Venezuela. 

Effects of occupational exposure to pesticides on semen quality of workers in an agricultural community of Merida state, Venezuela.

Leticia Miranda-Contreras¹, Ibis Cruz², Jesús A. Osuna², Roald Gómez-Pérez³, Lisbeth Berrueta⁴, Siham Salmen⁴, Melisa Colmenares¹, Silvio Barreto¹, Alirio Balza¹, Yasmin Morales¹, Leisalba Zavala¹, Emilitza Labarca¹, Nelly García¹, Beluardi Sanchez¹, Carlos A. Contreras⁵ y Henry Andrade⁶. 

¹Centro de Microscopía Electrónica Dr. Ernesto Palacios Prü, Universidad de Los Andes. Mérida, Venezuela.

²Laboratorio de Andrología, Facultad de Medicina, Universidad de Los Andes.
Mérida, Venezuela.

³Departamento de Endocrinología, Hospital Universitario de Los Andes.
Mérida, Venezuela.

⁴Instituto de Inmunología Clínica, Universidad de Los Andes. Mérida, Venezuela.

⁶Planificacion y Desarrollo (PLANDES), Universidad de Los Andes. Mérida, Venezuela. 

Resumen. Numerosos estudios informan de los efectos adversos de plaguicidas sobre la salud reproductiva masculina. Los objetivos de este estudio fueron investigar si existe una relación entre exposición ocupacional a plaguicidas y la calidad del semen, y determinar si la exposición crónica a plaguicidas afecta diferencialmente la calidad del semen de trabajadores de diferentes edades. Se realizó un estudio comparativo entre 64 agricultores y 64 hombres control. Los trabajadores agrícolas fueron entrevistados para determinar su historia ocupacional, particularmente las actividades que pueden involucrar exposición a plaguicidas. Se evaluaron los parámetros seminales y se hizo un análisis comparativo entre el grupo expuesto y control, así como entre los grupos de edad 18-29, 30-37 y 38-60 años. Se encontraron alteraciones significativas de algunos parámetros del semen en el grupo expuesto, tales como: disminuciones en la concentración, motilidad lenta progresiva e integridad de membrana espermática; a su vez, incrementos en eosina Y positiva e índice de fragmentación del DNA espermático. Los resultados obtenidos por grupo de edad mostraron diferencias significativas entre los grupos expuesto y control, para los parámetros de integridad de membrana, eosina Y positiva e índice de fragmentación del DNA espermático, siendo el grupo expuesto entre 18-29 años el que mostró mayores casos alterados de estos parámetros. Los resultados de este estudio comprueban que la exposición ocupacional a plaguicidas está asociada con alteraciones en la calidad espermática, creando riesgo para la capacidad reproductiva de los trabajadores del campo. 

Palabras clave:  exposición ocupacional, plaguicidas, calidad del semen, salud reproductiva. 

Key words: 

occupational exposure, pesticides, semen quality, reproductive health. 

Abstract. Numerous studies report adverse effects of pesticides on male reproductive health. The objectives of this study were to investigate whether there is a relationship between occupational exposure to pesticides and semen quality, and to determine whether chronic exposure to pesticides differentially affects semen quality in men of different ages. A comparative study of 64 farmers and 64 control men was performed. The farmers were interviewed to determine their occupational history and particularly, activities that may involve exposure to pesticides. Semen parameters were evaluated and a comparative analysis of semen variables between exposed and control groups, as well as between age groups: 18-29, 30-37 and 38-60 years was done. Significant alterations of some semen parameters in the exposed group were found, such as: decreases in sperm concentration, slow progressive motility and sperm membrane integrity; at the same time, increases in eosin Y positive and sperm DNA fragmentation index. The results obtained by age groups showed significant differences between exposed and control groups for the parameters of membrane integrity, eosin Y positive and sperm DNA fragmentation index, being the exposed group between 18-29 years that showed the highest altered cases of these parameters. Our results prove that occupational pesticide exposure is associated with alterations in sperm quality, creating a risk to farm workers in their reproductive capacity. 

Recibido: 15-05-2014 Aceptado: 12-02-2015 

INTRODUCCIÓN 

Mérida es una de las regiones agrícolas más productivas de Venezuela. La zona de Bailadores del Municipio Rivas Dávila tiene grandes extensiones de tierra dedicadas a una diversidad de cultivos de hortalizas, tubérculos, frutas y flores, para lo cual se ha requerido la aplicación de plaguicidas en cantidades considerables. Según cifras oficiales, para 2010 la producción agroalimentaria del Municipio Rivas Dávila fue de 55.464 t, correspondiente al 7% de la producción del estado, y la producción de flores ornamentales fue 408.000 paquetes, correspondiente al 9% de la producción del estado (1, 2). Para el año 2002, el consumo de plaguicidas en el municipio se estimó en 36,5 t, según información extraoficial suministrada por el Ministerio de Producción y Comercio, estos fueron utilizados en una superficie cosechada de 1.295 ha para una producción de 40.100 t en el rubro agroalimentario. Aunque no se dispone de información actualizada, se estima que el consumo de plaguicidas para 2012 aumentó considerablemente debido al incremento en la superficie total cosechada y la introducción del rubro de plantas ornamentales (3). La aplicación excesiva de plaguicidas en la actividad agrícola ha traído como consecuencia la contaminación de las fuentes de agua en esta zona, tanto de aguas superficiales como de agua para consumo humano (4-7). 

La toxicidad de un gran número de plaguicidas y sus metabolitos se ha atribuido a su capacidad de disrupción endocrina; es decir, pueden actuar en el organismo interfiriendo con las hormonas endógenas, debido a su gran capacidad para enlazarse a los receptores de estrógenos y andrógenos, funcionando además como agonistas o antagonistas de estas hormonas (21-23). Es bien conocido que la espermatogénesis es regulada por el sistema endocrino, por lo cual la calidad del semen puede ser particularmente sensible a cualquier plaguicida o sus metabolitos, los cuales pueden imitar las hormonas masculinas o causar daño directo al aparato reproductor masculino (24). 

En las últimas décadas se han incrementado los estudios en el hombre para evaluar los efectos de los plaguicidas sobre la calidad espermática, que es uno de los factores importantes relacionados con la infertilidad masculina (14, 25-27). La disminución en la concentración espermática fue el hallazgo más mencionado relacionado con la exposición a diferentes grupos de plaguicidas; también se ha observado una reducción en la cantidad total espermática, así como en la motilidad y la morfología normal de los espermatozoides. Adicionalmente, se ha reportado un incremento en la incidencia de anormalidades en los espermatozoides, así como de malformaciones urogenitales y cáncer de la próstata y del testículo (28-31). 

A pesar de los numerosos estudios que muestran efectos adversos de plaguicidas sobre la salud del hombre, existen poca información sobre los efectos de plaguicidas a largo plazo y la calidad espermática de los agricultores. Las investigaciones realizadas en comunidades agrícolas han enfatizado la necesidad de implementar programas educativos sobre el uso de agroquímicos con el propósito de reducir los riesgos de contaminación. Los objetivos del presente estudio fueron determinar si la exposición crónica a los plaguicidas altera los parámetros de la calidad espermática y si afecta diferencialmente la calidad del semen de los trabajadores agrícolas de diferentes edades. 

MATERIALES Y MÉTODOS 

Área de estudio 

El Municipio Rivas Dávila conforma la zona alta del valle del Río Mocotíes, posee una altitud promedio de 1800 msnm y se ubica entre las coordenadas geográficas 8°09’29’’-8°19’39’’ de latitud norte y 71°44’53’’-71°54’38’’ de longitud oeste (32). El complejo hidrológico del Municipio Rivas Dávila está compuesto principalmente por el Río Mocotíes, que comprende un área de 189 km², el cual se forma de la unión entre los Ríos Las Tapias y Zarzales, que también es conocido como Río Las Playitas (33). Es importante destacar, que muchas de las corrientes de aguas superficiales de la región son utilizadas actualmente para alimentar sistemas de riego agrícola y en algunos casos, también son utilizadas para el consumo humano. 

Población de estudio 

Un estudio transversal fue realizado entre 2008 y 2010, basado en entrevistas a hombres participantes y recolección de muestras de semen de 64 agricultores expuestos ocupacionalmente a los efectos de plaguicidas (Grupo expuesto) y 64 hombres no expuestos (Grupo control). Se tomaron en cuenta como criterios de inclusión para los sujetos del grupo expuesto su historia de exposición a plaguicidas en forma directa y período de residencia en el Municipio Rivas Dávila, Estado Mérida, Venezuela, por lo menos dos años antes del estudio. La edad de los participantes de la investigación estuvo comprendida entre 18 y 55 años. Los sujetos del grupo control fueron incluidos en el estudio si nunca habían trabajado con plaguicidas y que no hubieran tenido contacto con plaguicidas, ocupacional y no ocupacionalmente; los controles fueron seleccionados al azar en la ciudad de Mérida, a 90 km de la región agrícola del Municipio Rivas Dávila. Se tomaron como criterios de exclusión todas aquellas patologías que afectaran la reproducción masculina (testiculares: orquitis, varicocele, criptorquidia, trauma escrotal; infección del tracto urogenital; enfermedades de transmisión sexual recientes). 

Análisis del semen 

A todos los hombres participantes del estudio, se les pidió abstinencia sexual y alcohólica de 3 a 7 días antes de la recolección de la muestra de semen. El semen fue recolectado por masturbación siguiendo instrucciones especiales y según las Normas de la Organización Mundial de la Salud (OMS) (34). Las muestras de semen fueron analizadas en el sitio durante la primera hora para la observación macro y microscópica, utilizando las técnicas normalizadas internacionales, de acuerdo al criterio de la OMS (34). Para el análisis macroscópico, se determinaron las características físicas, tales como: pH, volumen, licuefacción, aspecto y viscosidad. En el análisis microscópico, se evaluaron los parámetros del semen: vitalidad (Test de Eosina), motilidad, concentración, Test de Integridad de Membrana (TIM), morfología espermática, y citología para descartar leucocitospermia. 

La integridad de la cromatina espermática fue evaluada mediante citometría de flujo utilizando el procedimiento para SCSA, basado en el método de Evenson y Jost (35) modificado por Cruz y col. (36). Debido a las propiedades metacromáticas del naranja de acridina, es posible distinguir entre la doble cadena DNA (ds) (fluorescencia verde) y la cadena sencilla DNA (ss) (fluorescencia roja) cuando se expone a 488 nm de luz láser a partir de un citómetro de flujo (FACSort, Cell Queso software, Becton Dickinson, San José, CA, USA). Los resultados del Índice de Fragmentación de DNA (IFD) fueron expresados en porcentaje y considerados normales cuando se encontraban por debajo de 30%. 

De acuerdo a los criterios de la OMS (34), la calidad espermática debe ser evaluada por lo menos de dos muestras de semen, con intervalos de 15 días, promediando ambos resultados, para obtener una conclusión definitiva debido a una gran variabilidad biológica existente, aun dentro del mismo individuo. Tal criterio representa una limitación del presente estudio en relación con la obtención de muestra única por individuo in situ, por tratarse de un estudio de campo. 

Análisis estadístico 

Las variables continuas se expresaron como promedio ± desviación estándar. Para establecer las diferencias entre las variables continuas, se utilizó el análisis de varianza (ANOVA) para comparar grupos de edad. Se aplicó la prueba t de muestras independientes con nivel de significación de 0,05 para detectar diferencias entre las medias de dos poblaciones distribuidas normalmente. Se realizó la prueba de homogeneidad basada en el estadístico exacto de Fisher, con nivel de significación de 0,05, para comparar el porcentaje de pacientes con parámetros normales entre las dos poblaciones bajo estudio. Con el fin de determinar donde se encuentran esas diferencias, se realizó la prueba a posteriori de Tukey de comparaciones múltiples con nivel de significación de 0,05. Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS versión 15 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). 

RESULTADOS 

Se estudiaron 64 hombres, todos trabajadores agrícolas del Municipio Rivas Dávila del Estado Mérida, Venezuela, quienes se encuentran expuestos ocupacionalmente a los efectos tóxicos de plaguicidas agroquímicos (grupo expuesto). La edad promedio del grupo expuesto fue de 33,08 ± 9,78 años; sus edades se distribuyeron de la siguiente manera: 18-29 años, 42,2%; 30-37 años, 23,4%; y 38-60 años, 34,4%. Asimismo, igual número (64) de hombres se seleccionó al azar, del Municipio Libertador del Estado Mérida, Venezuela, que no estuvieran expuestos a plaguicidas (grupo control). La edad promedio del grupo control fue de 33,97 ± 7,50 años, que se distribuyen por grupo de edad de la siguiente manera: 18-29 años, 29,7%; 30-37 años, 45,3%; y 38-60 años, 25,0%. 

En la Tabla I se muestra el análisis comparativo de los parámetros de calidad del semen entre el grupo Expuesto y Control. Los resultados obtenidos señalan diferencias significativas en valores promedios de los siguientes parámetros: Concentración espermática (p=0,011) (Expuestos = 84,76 millones/mL vs Control=100,81 millones/mL; Eosina Y positivo (p=0,000) (Expuestos=31,97% vs Control=20,17%); Motilidad lenta progresiva (a+b) (p=0,005) (Expuestos=48,20% vs Control = 56,30%; TIM (p=0,001) (Expuestos= 52,34% vs Control=59,78%; y, por último, IFD (p=0,000) (Expuestos=37,02% vs Control=27,23%. 

Tomando en consideración los percentiles 33 y 66 de la edad, se agruparon los hombres en los grupos de edad 18-29, 30-37 y 38-60 años, para distribuir la muestra de manera homogénea; es decir, grupos de edades aproximadamente igual en tamaño de individuos; sobre estos grupos de edad se procedió a comparar los parámetros de calidad espermática en los grupos control y expuestos, empleando la prueba T de muestras independientes con nivel de significación de 0,05. Los resultados obtenidos por grupo de edad muestran diferencias significativas para los parámetros TIM, Eosina Y positivo e IFD (Tabla III). 

Para el grupo de edad entre 18 a 29 años, se observaron diferencias significativas en los siguientes parámetros: TIM (p=0,000), Eosina Y positivo (p=0,000), e IFD (p=0,000), donde los integrantes del grupo expuesto presentaron promedios fuera de los límites de referencia establecidos; en contraste, el grupo control presentó promedios dentro de los valores referenciales. 

Para los grupos de edad entre 30 a 37 años y 38 a 60 años, se observaron diferencias significativas en la Eosina Y positivo y el IFD. Para el grupo expuesto, los valores de Eosina Y positivo fueron de 31,87% (30 a 37 años) y 31,23% (38 a 60 años) y para el grupo control de 20,86% (30 a 37 años) y 21,63% (38 a 60 años). Los promedios del IFD para el grupo expuesto fue de 37,75% (30 a 37 años) y 35,82% (38 a 60 años), mientras que para el grupo control, de 27,12% (30 a 37 años) y 27,25% (38 a 60 años). En ambos parámetros los valores promedio encontrados fueron mayores en el grupo expuesto que en el grupo control (Tabla III). 

Al comparar los valores normales de los parámetros de calidad espermática por grupo de edad (Tabla IV), en el grupo de edad entre 18 y 29 años se observaron diferencias significativas para los variables TIM (p=0,000) y Eosina Y positivo (p=0,000). En el grupo control, el porcentaje de pacientes con valores normales se ubicó en 89,47% (TIM) y 68,42% (Eosina Y positivo), mientras que en el grupo expuesto fue de 33,33% (TIM) y 0,00% (Eosina Y positivo). No se observó diferencia estadística para el IFD; sin embargo, el porcentaje de pacientes con valores normales fue de 61,11% para el grupo control y 30,00% para el grupo expuesto, lo cual constituye una significancia clínica ya que el grupo control presenta 2,04 (61,11%/30,00%) veces más valores normales que el grupo expuesto. 

Para el grupo de edad entre 30 y 37 años, se observó diferencia significativa en el parámetro Eosina Y positivo (p=0,021), donde el 51,72% de los pacientes del grupo control presentaron valores normales, en contraste al 13,33% del grupo expuesto. Por otra parte, en los parámetros TIM e IFD no se observaron diferencias significativas; no obstante, los resultados muestran una relevancia clínica dado que los porcentajes de pacientes normales del grupo control son 1,63 (75,86% / 46,67%) y 1,64 (70,37% / 42,86%) veces mayor, respectivamente, en comparación al grupo expuesto. 

Con respecto al grupo de edad entre 38 y 60 años, se observaron diferencias significativas para el TIM (p=0,020), Eosina Y positivo (p=0,026) e IFD (p=0,013). Los porcentajes de pacientes normales fueron para el TIM 56,25% (grupo control) y 18,18% (grupo expuesto), Eosina Y positivo 31,25% (grupo control) y 4,55% (grupo expuesto) e IFD 62,50% (grupo control) y 17,65% (grupo expuesto). 

DISCUSIÓN 

En este estudio se han demostrado alteraciones significativas de algunos parámetros de calidad del semen de agricultores ocupacionalmente expuestos a los efectos tóxicos de plaguicidas en sus labores diarios en una comunidad agrícola del estado Mérida, Venezuela. Los resultados de las entrevistas a los trabajadores agrícolas sugieren que ellos sufren una exposición crónica a los efectos adversos de plaguicidas debido a las pocas precauciones de seguridad tomadas en el manejo de los mismos, además la falta de políticas claras que permitan aplicar los controles y las leyes existentes, tanto a nivel nacional como internacional (37-41). Aunado a estos factores, la mayoría de ellos viven en las cercanías de los campos agrícolas, donde están expuestos constantemente a bajos niveles de plaguicidas asociados a la contaminación del agua, aire, suelo y de los productos de la siembra que consumen (4-7). 

Los hallazgos de este estudio fueron consistentes con reportes de otros investigadores, que confirman el impacto de plaguicidas sobre la salud reproductiva del trabajador agrícola. En las entrevistas a los participantes del estudio, los agricultores mencionaron el uso de diferentes clases de plaguicidas, tales como: fosfonometilglicina, organoclorados, organofosforados, ditiocarbamatos, carbamatos, bipiridilos, triazinas y piretroides, entre otros, mostrando evidencia que los trabajadores fueron expuestos crónicamente a los efectos tóxicos de mezclas de plaguicidas. Los resultados del estudio demuestran alteraciones significativas de algunos parámetros del semen del grupo expuesto, tales como: disminución de la concentración espermática (p=0,011), aumento en el porcentaje de Eosina Y positivo (p=0,000), decrecimiento de la motilidad espermática lenta progresiva (p=0,005), disminución en el porcentaje del TIM (p=0,001) y aumento en el IFD espermático (p=0,000) (Tabla I). En el grupo expuesto se detectó mayor porcentaje de resultados alterados en comparación con el grupo control en los siguientes parámetros seminales: cantidad espermática, Eosina Y positivo, motilidad lenta progresiva, TIM e IFD espermático (Tabla II). Aunque la mayoría de los grupos expuesto y control mostró niveles normales de cantidad y motilidad espermática, no obstante, entre ambos grupos se encontraron diferencias significativas en los casos alterados. Por otra parte, es importante notar que el 95% del grupo expuesto tenía un alto porcentaje de Eosina Y positivo, lo cual indica que la mayoría de los trabajadores agrícolas sufrían alteraciones en la vitalidad espermática. Con respecto al IFD espermático, el 71% del grupo expuesto se encontró con un nivel elevado de daños en la cromatina espermática. En el grupo control, las incidencias de los últimos dos parámetros de calidad seminal fueron de 48% y 34%, respectivamente, esto significa que los casos alterados de vitalidad e integridad de DNA espermático se duplicaron en el grupo expuesto. Estos resultados son consistentes con otros trabajos que reportaron una asociación entre parámetros anormales del semen y alteraciones en el DNA espermático (42, 43). La integridad de la cromatina espermática es central para la transmisión de la información genética durante la reproducción; la acumulación de sustancias xenobióticas tóxicas, como son los plaguicidas, puede causar problemas asociados con infertilidad masculino, baja probabilidad de embarazo y pérdidas fetales recurrentes (44-46). 

Varios factores no-ocupacionales, tales como edad, fumar y consumo crónico de alcohol, se conocen que modifican las características del semen y se han asociado con baja calidad espermática y alteración de la integridad de DNA espermático (47-49). Estos factores pueden ejercer influencia sobre la calidad seminal, exacerbando los efectos de la exposición crónica a los plaguicidas. En el grupo expuesto, el 33% eran fumadores ocasionales y el 34%, consumidores de alcohol los fines de semana; por otra parte, en el grupo control, el 46,88% de los participantes eran fumadores y el 54,69%, consumidores de alcohol ocasionales. En este estudio, se ha analizado la influencia del factor edad sobre la calidad del semen, sin embargo, cómo influyen los factores demográficos sobre los parámetros seminales, es un tema que se analizará en un artículo separado. 

Algunos trabajos han determinado los límites de edad en hombres sanos para los cambios en los parámetros del semen, tales como: volumen del eyaculado, concentración espermática, motilidad espermática y morfología normal (50-52). Una relación inversa estadísticamente significativa fue observada entre el volumen seminal, la calidad espermática y la edad del paciente; los valores picos de los parámetros del semen fueron observados entre las edades ³30 y <35 años, luego, comenzaron a reducirse a partir de los 55 años (50). En un estudio realizado con 998 hombres chinos sanos, entre 20 a 60 años, Zhu y col. (51) mostraron una correlación negativa de la edad del hombre con los parámetros espermáticos: motilidad progresiva, vitalidad y morfología normal. Los variables de motilidad rápida progresiva y morfología normal comienzan a decrecer lentamente a partir de los 30 años, mientras que la motilidad lenta progresiva, al principio de los 40 años. De acuerdo a Stone y col. (52), los niveles de los parámetros de eyaculados no cambian antes de los 34 años; después de esa edad, la cantidad total y la motilidad espermática comienzan a declinar. La concentración espermática y morfología espermática normal disminuyen después de los 40 años, mientras que la motilidad espermática y el volumen del eyaculado comienzan a decrecer a los 43 y 45 años, respectivamente. 

En este trabajo se observó una disminución diferencial significativa entre los diferentes grupos etarios (18-29, 30-37 y 38-60 años) de dos parámetros de la calidad seminal: TIM y Eosina Y positivo, tanto en el grupo expuesto así como en el grupo control (Tabla III). En el grupo control, los valores del TIM comienzan a disminuir por debajo de los criterios de normalidad de la OMS (34) después de los 38 años de edad, demostrando claramente la influencia del factor edad con el desmejoramiento de la calidad del semen. El TIM es una prueba que evalúa la integridad funcional de la membrana espermática y sirve como indicador de fertilidad potencial del espermatozoide (53). En los resultados del presente estudio, llama la atención que el grupo expuesto entre 18-29 años tenían los valores del TIM por debajo del rango de normalidad, semejante a lo encontrado en el grupo de edad entre 38-60 años (Tabla III). Los casos alterados del TIM en el grupo expuesto de 18-29 años alcanzaron el 66,67% en comparación con el grupo control, el cual registró sólo el 10,53% (Tabla IV). Es preocupante el uso inadecuado de plaguicidas por los agricultores, en particular los trabajadores jóvenes, debido a que se ponen en riesgo su fertilidad y la salud reproductiva en general. 

Es de resaltar que en el grupo expuesto, los valores de Eosina Y positivo e IFD por grupo de edad se encuentran fuera del rango de normalidad por la OMS (34) y no muestran cambios relacionados con la edad (Tabla III). Sin embargo, en el grupo control se puede apreciar la influencia del factor edad sobre la vitalidad espermática con la disminución de los valores de Eosina Y positivo (Tabla III) y el aumento de los casos alterados (Tabla IV) con el incremento de edad, resultados que fueron consistentes con los obtenidos por Zhu y col. (51). 

En el grupo expuesto, también se observó un incremento de los casos alterados del IFD espermático con la edad (Tabla IV). Similar al caso del TIM, un alto porcentaje (70%) de los trabajadores jóvenes, entre 18-29 años, mostró un nivel elevado de daños en el DNA espermático, colocándolos en mayor riesgo de sub-fertilidad a temprana edad. Los resultados del presente estudio son consistentes con la literatura previa (19, 36, 43, 47), demostrando una asociación entre parámetros seminales anormales e incremento en los daños en el DNA espermático. 

AGRADECIMIENTOS 

Esta investigación fue financiada por el Fondo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (FONACIT) a través del Proyecto S1-2002000281 y del Consejo de Desarrollo Científico, Humanístico, Tecnológico y Artes (CDCHTA) de la Universidad de Los Andes con el Proyecto M-912-07-07-C. 

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