0535-5133 0535-5133 S0535-51332015000300006 Venezuela Venezuela 00 09 2015 00 09 2015 56 3 284 295

T del gen de la metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) ha sido implicado como factor de riesgo para DTN. El objetivo de este trabajo fue investigar la asociación del polimorfismo 677C>T del gen de la MTHFR como factor de riesgo en los DTN. Se analizaron muestras de ADN de 52 madres con antecedente de al menos un hijo con DTN y de 119 madres controles. A través de la reacción en cadena de la polimerasa se amplificó un fragmento de 198 pb, el cual se sometió a digestión con la enzima HinfI. La frecuencia alélica de la MTHFR en los grupos problema y control fue de 51,92% y 34,45%; para el alelo T y 48,08% y 65,55%; para el C respectivamente. Se encontró diferencia significativa entre las frecuencias del alelo T y del alelo C (p: 0,002), así como entre las frecuencias genotípicas (p: 0,007) al ser comparadas en ambos grupos. El odds ratio (OR) para el genotipo TT vs CC se estimó como OR: 4,9 [IC 95%: 1,347-6,416] p: 0,002; CT+TT vs CC: OR: 2,9 [IC 95%: 1,347-6,416] p: 0,005; TT vs CT+CC: OR: 2,675 [IC 95%: 1,111-6,441] p: 0,024. Los presentes datos aportan una asociación significativa entre el polimorfismo 677C>T de la MTHFR y riesgo aumentado en las madres con antecedente de hijos con DTN.]]>

T polymorphism has been implicated as a risk factor for NTD. The main objective of this research was to investigate the association of the 677C>T polymorphism of the MTHFR gene as a genetic risk factor for NTD. Molecular analysis was performed in DNA samples from 52 mothers with antecedent of NTD offspring and from 119 healthy control mothers. Using the Polymerase Chain Reaction, a 198 bases pairs fragment was digested with the restriction enzyme HinfI. 677T MTHFR allele frequencies for the problem and the control groups were 51.92% and 34.45%, respectively, and 677C MTHFR allele frequencies were 48.08% and 65.55%, respectively. There were significant differences in allele (p: 0.002) and genotype (p: 0.007) frequencies between these two groups. The odds ratio (OR) to the TT genotype vs the CC genotype was estimated as OR: 4.9 [95% CI: 1,347-6.416] p: 0.002; CT+TT vs CC: OR: 2.9 [95% CI: 1.347-6.416] p: 0.005; TT vs CT+CC: OR: 2.675 [95% CI: 1,111-6.441] p: 0.024. The data presented in this study support the relationship between MTHFR 677C>T polymorphism and risk in mothers with antecedent of NTD offspring.]]>
Polimorfismo C677T del gen de la metilentetrahidrofolato reductasa en madres de  niños afectados 
con defectos del tubo neural

Alisandra Morales de Machín1, Karile Méndez1, Ernesto Solís1, Lisbeth Borjas de Fajardo1, Ana Bracho1, María Luisa Hernández2, Aimara Negrón1, Wilmer Delgado1  y Yanira Sánchez1

1. Instituto de Investigaciones Genéticas, Universidad del Zulia (IIG-LUZ) Maracaibo, Venezuela.

2. Cátedra de Histología y Embriología, Facultad de Medicina,  Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela.

Resumen. Los defectos del tubo neural (DTN) son las alteraciones congénitas más frecuentes del sistema nervioso central. El mecanismo de transmisión hereditario de los DTN aislados es multifactorial, se debe a la interacción de factores ambientales y genéticos. El polimorfismo 677C>T del gen de la metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) ha sido implicado como factor de riesgo para DTN. El objetivo de este trabajo fue investigar la asociación del polimorfismo 677C>T del gen de la MTHFR como factor de riesgo en los DTN.  Se analizaron muestras de ADN de 52 madres con antecedente de al menos un hijo con DTN y de 119 madres controles. A través de la reacción en cadena de la polimerasa se amplificó un fragmento de 198 pb, el cual se sometió a digestión con la enzima HinfI. La frecuencia alélica de la MTHFR en los grupos problema y control fue de 51,92% y 34,45%; para el alelo T y 48,08% y 65,55%; para el C respectivamente. Se encontró diferencia significativa entre las frecuencias del alelo T  y del alelo C (p: 0,002), así como entre las frecuencias genotípicas (p: 0,007) al ser comparadas en ambos grupos. El odds ratio (OR) para el genotipo TT vs CC se estimó como OR: 4,9 [IC 95%: 1,347-6,416] p: 0,002; CT+TT vs CC: OR: 2,9 [IC 95%: 1,347-6,416] p: 0,005; TT vs CT+CC: OR: 2,675 [IC 95%: 1,111-6,441] p: 0,024. Los presentes datos aportan una asociación significativa entre el polimorfismo 677C>T de la MTHFR  y riesgo aumentado en las madres con antecedente de hijos con DTN.    
  ]]> Palabras clave: Polimorfismo MTHFR C677T; defecto del tubo neural.

C677T polymorphism of the methylentetrahydrofolate reductase gene in mothers of  children affected  with neural tube defects.

Abstract. Neural tube defects (NTD) are the most common congenital anomalies of the central nervous system, with a multifactorial pattern of inheritance, presumably involving the interaction of several genetic and environmental factors. The methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene 677C>T polymorphism has been implicated as a risk factor for NTD.  The main objective of this research was to investigate the association of the 677C>T polymorphism of the MTHFR gene as a genetic risk factor for NTD. Molecular analysis was performed in DNA samples from 52 mothers with antecedent of NTD offspring and from 119 healthy control mothers. Using the Polymerase Chain Reaction, a 198 bases pairs fragment was digested with the restriction enzyme HinfI. 677T MTHFR allele frequencies for the problem and the control groups were 51.92% and 34.45%, respectively, and 677C MTHFR allele frequencies were 48.08% and 65.55%, respectively. There were significant differences in allele (p: 0.002) and genotype (p: 0.007) frequencies between these two groups. The odds ratio (OR) to the TT genotype vs the CC genotype was estimated as OR: 4.9 [95% CI: 1,347-6.416] p: 0.002; CT+TT vs CC: OR: 2.9 [95% CI: 1.347-6.416] p: 0.005; TT vs CT+CC: OR: 2.675 [95% CI: 1,111-6.441] p: 0.024. The data presented in this study support the relationship between MTHFR 677C>T polymorphism and risk in mothers with antecedent of NTD offspring.     

Keywords: MTHFR C677T polymorphism; neural tube defect.

Recibido: 28-10-2014 Aceptado: 26-03-2015 ]]>
INTRODUCCIÓN

Los defectos del tubo neural (DTN), son las anomalías más frecuentes y severas del sistema nervioso central (SNC) (1,2), resultan de un fallo en el desarrollo y cierre normal del tubo neural (3,4). Se clasifican según su localización, en espinales y craneales, los defectos espinales incluyen la espina bífida (EB) y sus variedades, oculta y quística (meningocele y mielomeningocele) y los defectos craneales (craneosquisis) que incluyen la anencefalia y  el cefalocele (5,6). Según la presencia o no de tejido neural expuesto, el DTN se clasifica en abierto y cerrado (5,6). Los DTN abiertos que incluyen la EB abierta y la anencefalia, resultan de falla en la neurulación primaria, que involucra plegamiento y fusión de los pliegues neurales. Esto puede ocurrir a diferentes niveles del axis del cuerpo, lo cual refleja la ocurrencia de múltiples sitios de cierre del tubo neural. El cierre en la región craneal se completa en el día 25 y el cierre en el neuroporo posterior, el cual completa la neurulación primaria, ocurre durante los días 26 a 28 post fertilización (5).

La cráneorraquisquisis resulta de la falla de fusión de todo el tubo neural, es un DTN abierto severo y poco frecuente  (5,6). Los DTN cerrados, resultan de defectos en el desarrollo del mesodermo axial que forma las vértebras y el cráneo. Producirán encefalocele o meningocele, en los cuales el tubo neural cerrado, está herniado a través de la región afectada del cráneo o de la columna vertebral (5). Se estima que la frecuencia a nivel mundial es de 1 a 10 por 1.000 nacimientos (7) y de 0,5 a 2 por 1.000 embarazos (4). En Venezuela, Hernández y col citan que la frecuencia de DTN varía de 0,5 a 2 por 1.000 nacidos vivos (8). La mayoría de los DTN ocurren de forma aislada y su patrón de herencia es multifactorial, resulta de complejas interacciones entre ciertos factores medioambientales y genéticos (9). Martínez y col han citado que los DTN se han asociado con bajo nivel económico, hipertermia, medicación anticonvulsivante, diabetes y factores nutricionales (10).      

Se ha planteado la asociación entre el desarrollo de DTN y niveles bajos de folato (11), otros han reportado disminución en la prevalencia  de los DTN debido al uso de suplementos vitamínicos que contenían ácido fólico, durante la etapa periconcepcional (2,12-16), o a la fortificación con ácido fólico de alimentos de consumo masivo  (17-23). El ácido fólico es una molécula hidrosoluble, que pertenece al grupo de las vitaminas del complejo B. Se considera un nutriente esencial. El término ácido fólico es usado para la forma sintética, presente en multivitaminas, tabletas de ácido fólico y alimentos fortificados. La forma natural es referida como folato y se  consigue en verduras y hortalizas, entre las cuales cabe destacar las acelgas, espinacas, remolachas, coles y guisantes. Asímismo los garbanzos, algunas frutas frescas como las naranjas, melón y plátano; frutos secos tales como almendras y avellanas; también en  levaduras e hígado. Una cantidad de folato puede ser destruida durante la cocción, procesamiento y almacenaje (3).

Aunque en la embarazada pueden coexistir enfermedades causantes de anemia, la causa más frecuente es el déficit nutricional por la deficiencia aislada o combinada de hierro y ácido fólico (24-26). En Venezuela, en el estado Zulia, la deficiencia de folato sérico y eritrocitario en embarazadas ha sido reportada en valores de 13% a 39% y de 18% a 47% respectivamente (27-30). En el caso de la mujer no embarazada adolescentes y adultas, la deficiencia de folato  sérico ha sido reportada en 13% a 24,6% (27,28, 31-33) y el folato eritrocitario entre 10% a 14% (27, 28, 31). En las mujeres indígenas Bari de Campo Rosario y Yucpa de Peraya de ≥ 18 años, la deficiencia de folato sérico reportada fue de 89,2% (34) y 26,3% respectivamente (35).  ]]>
La prevalencia de deficiencia de folato en Venezuela ha sido reportada en  31, 53%; en niños, adolescentes  y mujeres embarazadas (36).  Se ha propuesto que existe predisposición a DTN, ante la presencia del polimorfismo 677C>T del gen que codifica la enzima mutilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR). Este factor de riesgo es modulado por niveles de folato en el cuerpo   (3, 37).  El gen de la MTHFR está localizado en la banda 36.3 del brazo corto del cromosoma 1 (1p36.3). Codifica la enzima MTHFR (38), Frosst y col (39) citan que ella a su vez cataliza la reducción de 5, 10 – metilen-tetrahidrofolato a 5 – metilen-tetrahidrofolato, que es la forma de folato predominantemente circulante y es el donador de carbonos para la remetilación de homocisteína a metionina (39), con lo cual es precursor de una cadena de reacciones de metilación de sustancias de interés biológico, como la síntesis de ácido desoxirribonucleico (ADN), proteínas, neurotransmisores y fosfolípidos (40); así el folato es esencial para la función, división y diferenciación celular (3). El polimorfismo 677C>T implica una variación en la posición 677 del nucleótido, que involucra el cambio de una base citosina (C) a timina (T), dando como resultado una sustitución de valina (GTC) por alanina (GCC). Esta variante  es termolábil y como consecuencia, las personas, homocigotos 677TT y heterocigotos 677CT, tienen la actividad enzimática reducida en 70% y 35% respectivamente (39).

El genotipo homocigoto 677TT está asociado a niveles de homocisteína sérica elevados (hHcy), asociada con bajo nivel de folato en el plasma, aunque esta relación puede no siempre coexistir (41,42,43). La producción de 5-metiltetrahidrofolato requiere de abastecimiento adecuado de folato y la función apropiada de la MTHFR, por lo tanto, si hay enzimas funcionando inapropiadamente o los cofactores no se presentan en cantidades adecuadas existe la posibilidad de originar hHcy (41). El mecanismo exacto por el cual la hHcy puede contribuir al desarrollo de DTN es desconocido, pero es posible incluir teorías acerca de posibles efectos estructurales y neurológicos en el embrión (44). La homocisteína es embriotóxica durante el proceso de neurulación (3), e induce DTN en embriones de pollo cuando se administra antes y durante el periodo de neurulación (45). Los niveles disminuidos de metionina, debido a alteración en la remetilación de homocisteina a metionina, podrían resultar en niveles disminuidos de S - adenosil metionina, que es el donador universal de grupos metilos y un sustrato para múltiples reacciones de transmetilación, que incluyen la metilación del ADN, lo que ocasiona daño a la neurulación, por metilación inadecuada de genes, silenciando su expresión (3).      

Los eventos comunes a los diversos factores de riesgo ambiental y genético, confluyen en los procesos de neurulación y en el metabolismo del folato/homocisteína (46). En Venezuela, específicamente en el estado Zulia, a pesar de haberse reportado una frecuencia de 2,28 en 1000 nacidos de DTN en la Costa Oriental del Lago de Maracaibo (47), no se ha descrito sobre la asociación de este polimorfismo como factor de riesgo para la aparición de DTN. Debido a esto el objetivo de este trabajo fue  investigar la asociación del polimorfismo 677C>T de la MTHFR como factor de riesgo en los defectos del tubo neural.

PACIENTES Y MÉTODOS

Se estudiaron 52 madres no relacionadas, con antecedente de al menos un hijo con DTN aislado como grupo problema, se recogió la información si recibieron ácido fólico en etapa periconcepcional y de los hijos con DTN información sobre tipo de defecto, sexo y si fallecieron o no y 119 madres no relacionadas sin este antecedente como grupo control, con edad y condición socioeconómica similar, residentes en la misma área geográfica. Se obtuvo ADN de 171 muestras, a partir de 5 mL de sangre periférica anticoagulada con EDTA 500 mM  según técnica convencional (48).  ]]>
Para la realización de este trabajo, se contó con el consentimiento informado de las madres estudiadas y la aprobación del Comité de Bioética del Instituto de Investigaciones Genéticas de LUZ (IIG-LUZ).

Análisis molecular

La identificación de la transición C>T en el nucleótido 677 del gen de la MTHFR se realizó utilizando el método descrito por Frosst y col (39). La secuencia de los iniciadores utilizados fue la siguiente: 5´-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3´ y 5´-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3´, estos iniciadores están diseñados para generar un producto amplificado de 198 pares de bases (pb), el cual se sometió a digestión con la enzima de restricción HinfI, esta enzima reconoce el sitio de restricción creado por la transición C>T en la posición 677. El alelo con la variante polimórfica T se corta en dos fragmentos, uno de 175 y otro de 23 pb y el alelo normal (C) no se corta (39). El producto digerido se caracterizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%, y se visualizó utilizando la tinción de bromuro de etidio. El genotipo homocigoto CC se definió como la presencia de una sola banda de 198 pb, homocigoto TT cuando se visualizó una banda de 175 pb y heterocigoto CT para el polimorfismo cuando se observaron fragmentos de 198 y 175 pb, la banda de 23 pb se sale del gel.

A partir de las frecuencias genotípicas, se calcularon las frecuencias alélicas en los 2 grupos y se verificó el ajuste al modelo de Equilibrio de Hardy Weinberg (49,50) en el grupo control. Se utilizó el estadístico Chi cuadrado (X2), a un nivel de significación de < 0,05 para calcular la diferencia entre la frecuencia alélica entre el grupo problema y el control. Para establecer la relación entre la presencia del alelo T en el polimorfismo 677C>T en el gen de la MTHFR y el incremento de riesgo de DTN, se compararon las frecuencias de los genotipos con la variante (CT y TT) con el genotipo normal (CC), en el grupo problema y el control. Para el procesamiento de este estadístico, se utilizó el paquete SPSS 15.0 (Statistical Package for the Social Sciences).

RESULTADOS
]]> Las 52 madres en el grupo problema tenían edad comprendida entre los 14 y 43 años, siendo el promedio de 25,1 años ± 5,7 años. Según la información obtenida de las madres del grupo problema, el DTN se produjo en 54 embarazos: 19 fetos fueron evacuados antes de las 30 semanas de gestación, posterior a un ecograma fetal, 19 resultaron mortinatos, 16 nacieron vivos, de los cuales nueve fallecieron durante la primera semana y siete aún viven.  El tipo de DTN fue: anencefalia en 32 embarazos, dos de ellos con mielomeningocele y cinco con raquisquisis,  mielomeningocele en 15, meningocele en cinco y encefalocele en dos. Dos mujeres tuvieron el antecedente de dos hijos de diferente sexo con anencefalia (Tabla I). Además 11 presentaron antecedente de pérdida gestacional, cuatro de ellas con pérdida gestacional malformada.

En el grupo de controles se analizaron 119 madres de 19 a 55 años de edad, siendo el promedio de 37,5 años ± 9,8 años.   El análisis de los genotipos del gen de la MTHFR se observa en la Fig. 1.  Las frecuencias genotípicas y alélicas para el polimorfismo 677C>T, se presentan en la Tabla II. Las comparaciones entre ambos grupos resultaron significativas para las distribuciones alélicas (p= 0,002) y genotípicas, tanto para los tres genotipos (p= 0,007), como para la comparación por pares y para la combinación de los genotipos positivos o negativos para T (p<0,05). De manera análoga, los ORs resultaron significativos para la comparación CT vs CC: OR= 2,53 [1,127-5,700]; TT vs CC: OR= 4,9 [1,714-14,004]; para CT+TT vs CC: OR= 2,9 [1,347-6,416]; y para TT vs CC+CT: OR= 2,675 [1,111-6,441]; se presentan en la Tabla III.  El polimorfismo analizado se encontró en Equilibrio de Hardy Weinberg en el grupo control.


Fig. 1. Imagen de un gel de agarosa al 2% del producto de digestión con la enzima HinfI. Análisis del polimorfismo 677C>T. M: marcador de peso molecular ø 174 x Hae III. 1: control positivo homocigoto TT para el corte de la enzima HinfI y genera una banda de 175 pb, la banda de 23 pb no se evidencia en el gel. 2: control positivo heterocigoto CT es cortado por la enzima y produce una banda de 198 pb, una de 175 pb, la banda de 23 pb no se evidencia en el gel.  3: homocigoto CC no es cortado y genera un fragmento de 198 pb. 4,6: heterocigoto CT. 5,7: homocigoto TT. 8: control de sistema, mezcla de reacción sin ADN.



]]> TABLA I
DEFECTOS DEL TUBO NEURAL. DISTRIBUCIÓN SEGÚN EL SEXO. RECURRENCIA


TABLA II
FRECUENCIA GENOTÍPICA Y ALÉLICA POR GRUPOS

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TABLA III
RIESGO DE DEFECTO DE TUBO NEURAL (ODDS RATIO) EN GRUPO PROBLEMA Y GRUPO CONTROL

 
DISCUSIÓN

Los DTN, son un problema de salud pública en el ámbito mundial, por su mortalidad, morbilidad, costo social y económico  (51,52). En su conjunto, son una de las primeras causas de nacidos muertos, de mortalidad en la primera infancia y de minusvalías en los niños que sobreviven (9).La etiología de los DTN es compleja y poco conocida (53), por lo que es importante identificar los factores de riesgo que afectan a una población. Martínez y col citaron que factores nutricionales y genéticos han sido implicados en la etiología de estos defectos. La deficiencia de folato y una alteración en el metabolismo de la homocisteína dependiente del folato en las madres, como también la presencia de la enzima MTHFR termolábil, han sido asociadas con riesgo incrementado de tener hijos con DTN (54). Se ha propuesto que existe asociación o predisposición a DTN, ante la presencia del polimorfismo 677C>T del gen de la enzima MTHFR. A los individuos homocigotos TT se les ha asociado con un mayor riesgo de DTN. Con el fin de investigar esta asociación, se han realizado múltiples estudios caso control en diferentes poblaciones, que han revelado una gran heterogeneidad en la prevalencia del polimorfismo 677C>T. Mientras en ciertas poblaciones no se ha observado un riesgo incrementado de DTN para el genotipo TT, tales como Alemania (55), Francia (56), España (57), Turquía (58,59), Brasil (60), Chile (61).

En otras poblaciones tales como Irlanda (52,62,63), Holanda (37,64), Polonia (65), Italia (66), Turquía (67), México (10,68), Puerto Rico (69), el presente estudio y  estudios de meta-análisis (70-72) parecen indicar que el polimorfismo 677C>T se asocia con riesgo incrementado de DTN. En el presente estudio la asociación resultó significativa tanto con el genotipo materno 677TT como con el genotipo 677CT. La diferencia en los resultados es probablemente secundaria a la heterogeneidad poblacional y de diseño metodológico. ]]>
Estos resultados enriquecerán y reforzaran el asesoramiento genético de las familias con DTN en esta población, sugiriendo un régimen alimentario rico en folato, también permitirá sustentar la terapia preventiva con ácido fólico periconcepcional para este grupo problema y para las familias con afectados de DTN, la razón de administrar el requerimiento necesario desde antes de la concepción se debe a que el tubo neural se cierra entre los días 25 a 28 de la gestación, antes de que la mayoría de las mujeres se den cuenta de que están embarazadas; en la literatura revisada se observó que en Venezuela, las mujeres embarazadas que habían recibido ácido fólico, lo hicieron a partir del primer trimestre o después y otras no lo recibieron (30,73-75); de igual manera en el presente trabajo 50 mujeres recibieron ácido fólico a partir del segundo trimestre y dos nunca lo recibieron. Además extender esta medida para la población general de mujeres en edad reproductiva, como ya lo han sugerido otros investigadores (76), a través de proyectos de intervención y promoción permanente acerca de los beneficios del consumo de ácido fólico y deben dar las orientaciones, para que se tomen algunas decisiones desde el punto de vista preventivo, tales como proponer al Ministerio del Poder Popular para la Salud, que se estudien posibles medidas de suplementación y fortificación con ácido fólico de alimentos de consumo masivo como harinas, cereales, pastas.  Con la finalidad de reducir la recurrencia y ocurrencia de los DTN en nuestro país. Tanto, concentraciones bajas de folato, como la homocisteína elevada asociada con genotipos CT y TT,  pueden ser corregidas con la administración de ácido fólico (63). 

La dosis recomendada de ácido fólico para la prevención de DTN en todas las mujeres en edad reproductiva es de 0,4 mg por día (77), sin embargo, en los casos en que existe el antecedente de familiares o hijos con DTN se deben consumir 4 mg diarios (78). El suplemento debe administrarse como mínimo desde un mes antes de la concepción y durante el primer trimestre de la gestación. Mosley y col. (79) han citado que la organización encargada de la regulación de drogas y alimentos en Estados Unidos ha propuesto la fortificación de cereales en una cantidad de 140 µg de ácido fólico por 100 g de cereal . Dada la trascendencia en el ámbito familiar, social y económico de estos problemas; es necesario seguir investigando para ayudar a resolver los problemas metodológicos y hacer estudios multicéntricos para evaluar los puntos que aún están en controversia.

AGRADECIMIENTO

Este trabajo fue financiado por el Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico (CONDES) de la Universidad del Zulia (Proyecto CC – 0361 – 13). A Enrique Alejandro Machín Morales por toda la ayuda prestada.

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