Gloria A. Cabezas*, Manuel Velasco*

*Cátedras de Fisiología y Farmacología de la Escuela de Medicina José M. Vargas, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela.

E-mail: gcabezas@cantv.net

Resumen

En trabajos previos hemos demostrado, que la administración de dopamina a bajas dosis por vía inhalatoria (0.5-2 µg/ml/min) produce dilatación bronquial en pacientes con ataques agudos de asma y planteamos que la dilatación observada es posiblemente mediada por receptores dopaminérgicos y no por receptores de tipo adrenérgico. Estudiar el posible efecto modulador de la dopamina sobre el músculo liso de tráquea aislada de rata y examinar el efecto de los antagonistas α y β2 adrenérgicos y de los antagonistas dopaminérgicos DA1 y DA2, sobre la actividad dopaminérgica en tráquea aislada de ratas Sprague Dawley. Métodos. Anillos de tráquea de ratas Sprague Dawley de 200 a 400 gramos de peso, fueron escindidos y colocados en un baño de órgano aislado con solución Krebs a 37ºC, Oxígeno 95% y CO2 5%. Las contracciones fueron registradas con un transductor isométrico y un polígrafo (Letica) e inducidas añadiendo dosis acumulativas de acetilcolina al baño (1, 3, 6 µM seguidas de curvas acumulativas, de dopamina (1, 3, 10 µM). Cada antagonista se incubó por 15 min y se repitieron las curvas con acetilcolina y con dopamina. La dopamina inhibió la contracción inducida por estimulación de campo eléctrico y por los agentes farmacológicos acetilcolina y carbaminoilcolina. Sobre la contracción con acetilcolina la dopamina a dosis de 1 y 3 µM produjo inicialmente un pequeño aumento de la contracción, seguida de una dilatación de mayor magnitud; la adición de dopamina 10 µM revirtió totalmente la contracción. Las dos fases de la dopamina no fueron bloqueadas por propranolol (0.1 µM), ni por los antagonistas α adrenérgicos terasozin (0.1µM) ni yohimbina (0.1 µM). El antagonista DA2, metoclopramida (1, 2, 4, 8 µM) produjo un efecto potenciador colinérgico, pero no bloqueó las dos fases de la dopamina. La incubación con el antagonista DA1, SCH23390 (0.1 µM) produjo una contracción inmediata, sostenida, por mas de 15 min. y produjo un bloqueo parcial de la inhibición dopaminérgica. Este trabajo sugiere que a) los receptores DA1 y no los receptores DA2 son los responsables de la broncodilatación inducida por dopamina; b) los receptores adrenérgicos no están involucrados en esta respuesta; c) el SCH23390 induce una respuesta contráctil en el músculo liso bronquial que amerita futuras investigaciones.

Palabras Claves: Receptores dopaminergicos bronquiales, dilatacion bronquial dopaminergica, control nervioso de las lineas aereas, asma bronquial

Abstract

We have previously demonstrated that low doses of inhaled dopamine (0.5-2 µg/ml/min) induces bronchial dilatation in patients with acute asthma attack, suggesting that dopamine effect is mediated by dopaminergic receptors rather than by adrenergic receptors. In the present work we examined the probable dopaminergic regulatory effect on rat tracheal smooth muscle and the β₂, α₁, α₂ adrenergic and, DA₁, and DA₂ dopaminergic antagonist effect. We studied 90 male Sprague Dawley rats weighing 200 - 400 grams. Tracheal rings were excised and placed in an organ bath containing Krebs´s solution at 37ºC, gassed with oxygen (95%) and carbon dioxide (5%). Contractile responses were recorded with an isometric transducer in a polygraph (Letica, Spain). Contraction was induced by adding acetylcholine, into the bath. Dopamine doses response curves were obtained. Dopamine (0.1, 0.3, µM) transiently increased cholinergic contractions at first, followed by a marked inhibition; adding dopamine (10 µM) completely reversed contraction. Biphasic dopaminergic response was not blocked by β₂ adrenergic antagonists propranolol (0.1µM) or by antagonists α₁, terazosin (0.1µM) or α₂ yohimbine (0.1µM) administration 15 minutes before contractions were elicited. DA₂ antagonist metoclopramide (1, 2, 4, 8 µM) increased cholinergic contraction and did not block dopamine induced bronchodiltation. DA1 antagonist SCH23390 (0.1µM), elicited an abrupt and prolonged contraction (more than 15 min.) and partially inhibited the inhibitory effect of dopamine. We concluded that on airways a) dopamine effect is mediated by DA₁ rather than by DA₂ receptors; b) adrenergic receptors are not involved on dopamine induced response; c) metoclopramide seems to exhibit a cholinergic effect. d) In addition to DA₁ antagonist SCH23390 has intrinsic contractile activity on airway smooth muscle that deserves further research.

Key words: bronchial dopaminergic receptors, dopaminergic bronchial dilatation, nervous control of airways, bronchial asma.

Introducción

Ha sido demostrado en humanos, que la dopamina ejerce un efecto inhibidor sobre la broncoconstricción inducida por histamina en sujetos normales y en asmáticos¹ también ha sido demostrado^2,3,4 que la administración por vía inhalatoria de bajas dosis de dopamina (0.5-2 µg/Kg/min) produce dilatación bronquial en pacientes con ataques agudos de asma, pero no modifica el tono basal bronquial en sujetos normales ni en pacientes con antecedentes de asma bronquial sin crisis de broncoespasmo. Estos experimentos sugieren que la dopamina ejerce un papel regulador bronquial y que su efecto es posiblemente mediado por receptores dopaminérgicos y no por receptores adrenérgicos, sugiriendo que el receptor dopaminérgico es posiblemente de tipo DA1.

En animales de experimentación los resultados son diferentes en las distintas especies estudiadas. En bronquios aislados de cobayo⁵, la dopamina inhibe la contracción inducida por estimulación eléctrica y por acetilcolina pero sus efectos no fueron bloqueados por propranolol, yohihimbina, ni por haloperidol (antagonista DA2). Sin embargo, en tráquea aislada de perros⁶ la dopamina produce contracción que es antagonizada por haloperidol, propranolol y yohimbina. Por ptra parte, Birreli y col⁷, han demostrado en ratas, que a nivel de los nervios sensitivos bronquiales, la dopamina es capaz de inhibir reflejos de tipo vagal tales como la liberación de plasma de los vasos bronquiales, y que su efecto inhibitorio es bloqueado por antagonistas dopaminérgicos tipo DA2. Peiser y col⁸ han identificado la expresión de receptores DA2 en neuronas sensitivas que se proyectan en las vías aéreas de rata. Ha sido reportado además, que el compuesto agonista dual DA2 y B2 Viozan, (HCl, AR-C68397AA)⁹, es más efectivo para prevenir la tos y la producción de mucus comparado con el uso de agonistas β2 exclusivamente. Está siendo investigada^8,9,10. La utilidad clínica de este compuesto en el tratamiento de la enfermedad broncopulmonar obstructiva crónica (EBOC)^10,11. Se requiere mayores estudios para caracterizar el tipo de receptor involucrado en la respuesta reguladora de la dopamina en las vías aéreas.

El objetivo del presente trabajo fue estudiar en ratas, el efecto de la dopamina sobre el músculo liso de tráquea aislada y caracterizar el receptor dopaminérgico involucrado en la respuesta mediante el uso de antagonistas adrenérgicos α y β2 y de antagonistas dopaminérgicos DA1 y DA2, sobre la actividad dopaminérgica en tráquea aislada de ratas.

Metodos

Se estudiaron 90 ratas macho Sprague Dawley de 200 a 400 gramos de peso. Fueron anestesiadas con Pentobarbital Sódico (30 mg/ kg intraperitoneal) y su tráquea fue rápidamente disecada, se escindieron 5-6 anillos los cuales fueron fijados mediante un gancho de platino dentro de un baño de vidrio para órgano aislado con 10 ml de solución de Krebs modificado con la siguiente composición (g/L): (NaCl (68.44), KCl (3.50), CaCl2 (2.77), KH2PO4 (1.63), MgSO4, 7H2O (2.95), NaHCO3 (21.0), Glucosa 2gr y Ácido Ascorbico 10ֿ⁴ M hasta alcanzar pH 7.4. Durante el experimento, la solución fue gaseada con Oxígeno 95% y CO2 5% y mantenida a una temperatura de 37º C en un baño de órgano aislado baño (Techne Cambridge Ltd, United Kingdom). La Tensión isométrica fue medida con un transductor isométrico (Letica Scientific Instruments, Barcelona, España). Los incrementos en la tensión isométrica (contracción) fueron registrados en un polígrafo (Letica Scientific Instruments modelo 4006 Barcelona, España). Después que los anillos de tráquea fueron colocados en el baño, se ajustó la tensión a 1 g y la preparación fue dejada en reposo para equilibrarse durante 60 minutos antes de iniciar el experimento; después de cada procedimiento la preparación fue lavada, se ajustó la tensión a 1 g y se dejó en reposo durante 30 minutos para su equilibrio.

Las contracciones fueron inducidas mediante dos procedimientos: 1) Estimulación eléctrica. Se aplicaron estímulos eléctricos (10 Hz, 2 msg y 15 V) que permitían obtener una respuesta supramáxima, (los parámetros de estimulación fueron fijados previamente mediante la realización de curvas estímulo respuesta. Los estímulos fueron producidos por un estimulador eléctrico (Letica Scientific Instruments, Modelo LE12106 digital, Barcelona, España), con pulsos rectangulares a través de un par de electrodos de platino; uno de ellos constituía el gancho que fijaba la preparación dentro del baño y el otro se encontraba separado 5 mm del tejido. b) Estimulación farmacológica. Se colocaron en el baño, con una pipeta Hamilton, dosis acumulativas de acetilcolina o de carbamilcolina hasta alcanzar la respuesta máxima y después se seleccionaron las dosis que producían el 50% de la respuesta máxima (D_E50); El efecto de la dopamina fue evaluado administrando en el baño dosis acumulativas, de dopamina (1, 3, 6 y 10 µM) después de haber administrado la D_E50 de acetilcolina o carbamilcolina. Seguidamente, se incubó la preparación con el correspondiente antagonista adrenérgico o dopaminérgico durante 15 minutos y se repitieron las dosis acumulativas de acetilcolina y dopamina descritas previamente.

Drogas: Acetilcolina (Sigma); Carbamilcolina (Sigma); Dopamina (Rascordin^® en ampollas de 50 mg/ml (Laboratorios Fleming); Propranolol (Inderal^® - Astra Zeneca); Metoclopramida Clorhidrato (Irtopan^® Laboratrio North Medicamenta); SCH23390 (Sigma); Yohimbina (Sigma); Terasozin (Sigma). Las drogas fueron disueltas en solución salina al 0.9%.

Método Estadístico. En todos los casos, se aplicó la prueba "t" de Student, para muestras dependientes con dos colas.

1. Efecto de la dopamina sobre la tensión basal

Después de ajustar la tensión basal a 750, 1000, y 1500 mg. (n=5), no se observó actividad intrínseca de la dopamina administrada en el baño a dosis acumulativas de 1,3, 6 y 10µM.

2. Efecto de la dopamina sobre la contracción inducida por estimulación eléctrica

La administración de dosis acumulativas de dopamina (1,3,6 µM), (n =5) revirtió la contracción inducida por estimulación eléctrica supramáxima (16V, 2msg, y 10Hz).

3. Efecto de la dopamina sobre la contracción inducida por acetilcolina

Las dosis acumulativas de dopamina de 1 y 3 µM, produjo un pequeño aumento inicial de la contracción colinérgica, seguida de una dilatación de mayor magnitud. La posterior administración de dopamina a una concentración de 6 µM produjo la reversión completa de la contracción (n=25).

Grafico1, muestra las medias, de las contracciones obtenidas en 25 experimentos. La primera columna corresponde a la administración de dosis DE50 de Ach; la segunda a la contracción inicial obtenida con dopamina a dosis de 3 µM y la última columna a la inhibición obtenida con dopamina 6 µM.[ (*) p<0.5 ].

Gráfico 1. La primera columna corresponde a la contracción expresa enmg, inducida por Ach (control); la segunda corresponde a la dopamina 3mM y la tercera los valores son expresados como medidas y d.e, (*) corresponde  a p<0.05 cuando se compara la acción  de la dopamina con su respectivo control. (n=25)

4.1 Antagonista adrenérgicos β2 propranolol.

El antagonista adrenérgico β2 propranolol (10, 20 µM), no bloqueó el efecto inicial contráctil, ni el efecto inhibitorio de la dopamina sobre la contracción inducida por acetilcolina. Gráfico 2, Tabla 1. (n=8, p<0.05).

Gráfico 2 La primera columna corresponde a la contracción inducida por Ach D50 (control); La segunda a la administración de dopamina 3mM, y la tercera a la dopamina 6 mM, antes de la administración de Ach y la de dopamina 3 y 6 mM se repiten después de incubar con el antagonista β2 adrenérgico propranolol; Los valores son expresados  como medias y d.e.(*) corresponde a p< 0.05 cunado se compara la acción de la dopamina con su respectivo control. (n=8).

4.2. Antagonista α1 adrenérgico terasozin

La incubación con el antagonista α1 adrenérgico terasozín (0.1 µM) no bloqueó la contracción inicial, ni la relajación producida por dopamina (n=5, p< 0.05), cuando se compara el efecto de la dopamina (3, y 6 µM) con su respectivo control. (Tabla 1)

4.3. Antagonista α2 adrenérgico, yohimbina

4.4. Antagonista dopaminérgico selectivo DA1, SCH23390

Durante la incubación con SCH23390 se produjo un aumento sostenido del tono basal, indicando una actividad intrínseca sobre el músculo liso bronquial (n=5). En un experimento diseñado para determinar la duración de esta actividad producido por el SCH23390, se observó una prolongación de la contracción por un período mayor de una hora.

Después de la incubación con SCH23390, la administración de acetilcolina incrementó la contracción de acuerdo a la dosis. El SCH 23390 no bloqueó la respuesta contráctil inicial inducida por dopamina pero inhibió parcialmente (67%) la relajación producida por 6µM de dopamina (n=5). (p<0.00051)

El Gráfico 3, y la Tabla 1, muestran el efecto de la dopamina (3 y 6 µM) sobre la contracción colinérgica, antes y después de incubar con el antagonista dopaminérgico DA1, SCH23390 (0.1 µM) (n=5).

Gráfico 3. La primera corresponde a la contracción inducida por Ach D50 (control); La segunda a la administración de dopamina 3mM, y la tercera a la de dopamina 6 mM, antes de la administración de SCH23390. La administración de Ach y la de dopamina 3 y 6 mM se repiten despues de incubar con el antagonista; los valores son presentados como medias y d.e. (*) corresponde a p<0.05 cuando se compara la acción de la dopamina con su respectivo control. (n=5).

4.5. Antagonista dopaminérgico DA2 metoclopramida, (MTC)

La incubación con metoclopramida (5, 10, y 20 µM) durante 15 minutos no modificó el tono basal bronquial y no bloqueó la contracción inicial, ni la dilatación producida por dopamina. (n=11; p > 0.05), (Fig. 1 y Tabla 1)

La Tabla 1, muestra un resumen de las acciones de la dopamina sobre la contracción colinérgica, antes y después de administrar los diferentes antagonistas adrenérgicos y dopaminérgicos. Los valores en mg, de las contracciones son expresados en medias y d.e. La significancia (p) ha sido obtenida utilizando la prueba "t" de Student para muestras dependientes.

Discusion

En la presente preparación de tráquea aislada de rata, no se observó ninguna actividad intrínseca de la dopamina. La administración de dopamina fue capaz de revertir la contracción inducida por estimulación eléctrica supramáxima (liberación de Ach endógena) y también, la contracción producida por dosis acumulativas de Ach exógena. Lo cual evidencia que la dopamina actúa a nivel pre y postsináptico.

Este efecto inhibitorio es similar a lo observado en individuos con crisis de asma por Michoud¹ y Cabezas^2,3,4, y a lo reportado por Kamikawa5 en cobayos.

La fase de broncodilatación no fue bloqueada por los antagonistas adrenérgicos β2, α₁ ni α₂; tampoco fue inhibida por el antagonista D2, metoclopramida pero, fue bloqueada parcialmente, por el antagonista selectivo DA1 SCH23390 sugiriendo que el receptor DA1 está involucrado en la respuesta broncodilatadora postsináptica. Adicionalmente, la dopamina ejerce un efecto inhibitorio sobre los reflejos vagales estimulando receptores tipo DA2, ubicados en los nervios sensitivos que inervan los vasos sanguíneos bronquiales^7,8 indicando que la función inhibitoria de los receptores dopaminérgicos en bronquios, es mas importante que la de simple precursor de Noreprinefrina.

Sin embargo, la administración de dosis acumulativas menores (1 y 3 µM) de dopamina produjo antes de la relajación, un aumento inicial leve de la contracción colinérgica seguida de la relajación de mayor magnitud y duración. La fase inicial excitatoria, no fue bloqueada por antagonistas adrenérgicos ni dopaminérgicos, sugiriendo que esa respuesta es mediada a través de un mecanismo diferente que involucra a otro tipo de receptores a nivel pre o postsináptico, capaces de modular la liberación de acetilcolina en los ganglios colinérgicos

No hemos encontrado, hasta el presente, ninguna referencia en relación con la respuesta contráctil inducida en bronquios por el SCH23390; Esta es reproducible, sostenida y de larga duración (puede prolongarse hasta por una hora); su acción podría ser directa sobre músculo liso o bien indirecta a través de la liberación de mediadores químicos. Esta observación amerita futuras investigaciones.

Conclusiones

En la preparación de tráquea aislada de rata

2. La dopamina presenta una respuesta bifásica: inicialmente se potencia y luego se revierte totalmente la contracción inducida por estimulación eléctrica y por acetilcolina.

3. Los antagonistas adrenérgicos β2, α1 y α2, no bloquean el efecto ni el efecto inhibitorio de la dopamina

4. El antagonista selectivo DA2 metoclopramida no bloquea la respuesta dopaminérgica excitatoria ni la inhibitoria.

5. La respuesta inhibitoria de la dopamina es bloqueada parcialmente por el antagonista selectivo DA1 SCH23390 sugiriendo que el receptor DA1 está involucrado en la respuesta broncodilatadora.

6. La respuesta excitatoria de la dopamina no es bloqueada por los antagonistas adrenérgicos y tampoco por los antagonistas dopaminérgicos. Es posible que dicha respuesta sea de origen colinérgico o involucre otro tipo de mediador químico no adrenérgico, no colinérgico.

7. Los mecanismos que generan el aumento del tono basal bronquial producido por el SCH23390 amerita futuras investigaciones.

Referencias

1. Michoud MC, Amyot R, Jeanneret - Grosjean A. Dopamine effect on bronchomotor tone in vivo. Am Rev Respir Dis 1984; 130:755-758.        [ Links ]

2. Cabezas, GA; Lezama, Y; Vidal, R;. y Velasco, M. El-E3, Dopamine induces bronchodilatation in patients with bronchial asthma. Int J Clin Pharmacol Therap 1999;37(10): 510-513.        [ Links ]

3. Cabezas GA; Lezama Y; Velasco M. Dopaminérgic modulation of human bronchial tone. Archiv Med Research. 2001;32: 142-147.        [ Links ]

4. Cabezas GA; Velasco M. The actions of dopamine on the airways. American J Therapeutics.  2003; 10(4): 477-486.        [ Links ]

5. Kamikawa Y; Shimo Y. Inhibitory effects of catecholamine on cholinergically and non cholinergically mediated contractions of guinea-pig. J Pharm Pharmacol 1990; 41:131-134.        [ Links ]

6. Shue S-H; Chen C-J. The ecitatory effect of dopamine on islated canine tracheal smooth muscle. J Pharm Pharmacol 1990; 42:732, 734.        [ Links ]

7. Birrell MA; Crispino N; Hele DJ; Patel HJ; Yacoub MH; Barnes PJ; Belvisi MG. Effect of dopamine receptor agonists on sensory nerve activity: possible therapeutic targets for the treatment of asthma and COPD. Br J Pharmacol. 2002 Jun;136(4):620-8.        [ Links ]

8. Peiser C; Trevisani M; Groneberg DA; Dinh QT; Lencer D; Amadesi S; Maggiore B; Harrison S; Geppetti P; Fischer A. Dopamine type 2 receptor expression and function in rodent sensory neurons projecting to the airways. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2005; 289(1):L153-8.        [ Links ]

9. Bonnert RV; Brown RC; Chapman D; et al. Dual D2 - receptor and beta 2 adrenoreceptor agonists for treatment of airway diseases 1 Discovery and biological evaluation of some 7-(2-aminoethyl)-4-hydroxybenzothiazol-2(3H)-one analogues. J Med Chem. 1998; 41(25):4915 -4917.        [ Links ]

10. Laursen LC; Linquivist A; Hepbrun T; Lloyd J; Perret J; Sanders N; Rocchiccioli K. The role of the novel D2/beta2-agonist, Viozan (sibenadet HCl), in the treatment of symptoms of chronic obstructive pulmonary disease: results of a large-scale clinical investigation. Respir Med. 2003; 97 Suppl A:S23-33.        [ Links ]

11. Ind PW; Laitinen L; Laursen L; Wenzel S; Wouters E; Deamer L; Nystrom P. Early clinical investigation of Viozan (sibenadet HCl), a novel D2 dopamine receptor, beta2-adrenoceptor agonist for the treatment of chronic obstructive pulmonary disease symptoms. Respir Med 2003; 97 SupplA:S9-21.        [ Links ]

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Proyecto CDCH - 09.11.4397.99