Marysabel Torres, Maira Carrizales, Rosalía Sutil, Mercedes Márquez, Marielena Muñoz, Aldo Reigosa* y Víctor Barrios**.
Departamento de Farmacología, Facultad de Ciencias de
Dirigir correspondencia a Marysabel Torres: Urbanización El Bosque, Av. 114 (
Correo electrónico: mtorresr@uc.edu.ve
Este trabajo fue financiado por el Proyecto 96-008 del CDCH de
Resumen
El propósito de este estudio fue evaluar si la administración de diltiazem (30mg/día/vía oral), disminuye la hipercolesterolemia e inhibe la aterosclerosis en 38 conejos machos hipercolesterolemicos. Control: Conejarina por doce semanas, A: dieta rica con 0,3% de colesterol(DH) por doce semanas. B: DH por doce semanas y desde la tercera semana hasta la dodécima diltiazem. Grupo C: DH por dos semanas y Conejarina + diltiazem desde la tercera semana hasta la duodécima y D: DH por dos semanas y Conejarina desde la tercera hasta la duodécima semana. Se determinaron Colesterol Total (CT), LDL-colesterol (LDLc) y Triglicéridos (Tg) por métodos enzimáticos. A la duodécima semana, se sacrificaron los conejos y el estudio histológico fue realizado por los siguientes métodos: 1. Hematoxilina Eosina evaluó la presencia de lesiones, 2. Gomori′s: evaluó la profundidad de las lesiones 3. Computarizado: midió la extensión de las lesiones. En el grupo A y B aumentaron significativamente el CT, LDLc y Tg en relación al control en todos los periodos, a excepción de los Tg a la duodécima semana. Respecto a las lesiones ateroscleróticas, los grupos A y B presentaron lesiones tipo II, III, IV y V, el porcentaje promedio de área lesionada fue: Grupo A: 47,20%, Grupo B: 57,60%. Estos resultados permiten concluir que el diltiazem ejerce un efecto hipolipidemiante cuando se administra junto con una dieta rica en 0,3% colesterol, se confirma que una dieta adecuada es una buena estrategia para prevenir las dislipidemías y que el diltiazem no previno, ni indujo regresión de las lesiones ateroscleróticas.
Palabras claves: diltiazem, hipercolesterolemia, conejos.
Abstract
The purpose of this study was to evaluate whether the administration of dilltiazem (30mg/day/oral route) decreases hypercholesterolemia and inhibits atherosclerosis in 38 male hypercholesterolemic rabbits. Control rabbits were given a standard diet for twelve weeks; Experimental rabbits were given: Group A: 0.3% cholesterol-enriched diet (HD) for twelve weeks. Group B: HD for 12 weeks and diltiazem from week 3 until week 12. Group C: HD for two weeks and standard diet + diltiazem from week 3 until week 12. Group D: HD for two weeks and standard diet from week 3 until week 12. Biochemical assays of Total Cholesterol (TC), LDL-cholesterol (LDLc) and Triglycerides (Tg) were done by enzymatic methods. The rabbits were sacrificed at week 12 and a histological study was carried out using the following methods: 1. Hematoxylin-eosin for determined the presence of lesions. 2. Gomori´s: determined depth of lesions. 3. Computarized: determined extent of lesions. In groups A and B, TC, LDLc and Tg increased significantly in relation to control in all periods, with the exception of Tg at week 12. Regarding atherosclerotic lesions, groups A and B presented Type II, III, IV and V; average percentages of lesion extent were : Group A: 47.20% and Group B: 57.60%. These results suggest that diltiazem exerts a hypolipidic effect when administered in conjunction with a 0.3% cholesterol-enriched diet. It was confirmed that an adequate diet is a sound preventive strategy against dyslipidemia, and that diltiazem does not prevent or induces regression of atherosclerotic lesions.
Key words: diltiazem, hypercholesterolemia, rabbits
Introducción
En los últimos treinta años, se han acumulado evidencias tanto experimentales como clínicas que sugieren que los calcio antagonistas poseen un significativo efecto antiaterosclerótico, independiente de sus propiedades antihipertensivas1. La enfermedad arterial coronaria es una de las consecuencias de la aterosclerosis, y se considera un desorden vascular que conduce a incapacidad y muerte en la mayoría de los países desarrollados2. Entre los cambios celulares asociados a una mayor vulnerabilidad de la placa aterosclerótica esta la perdida de la regulación del calcio y el hecho ha generado interés acerca del posible potencial efecto antiaterogénico de los calcio antagonistas3,4.
Los antagonistas de calcio son considerados fármacos de primera línea en el tratamiento de la hipertensión, su efecto protector contra la isquemia miocárdica y potencial efecto antiaterogénico ha sido demostrado en varios modelos experimentales, lo que podría contribuir a su efecto preventivo en el proceso inicial aterosclerótico5, sin embargo, los resultados son inconsistentes y controversiales, así, un estudio llevado a cabo hace mas de dos décadas en conejos hipercolesterolemicos concluye que el diltiazem (2mg/Kg/día), el isradipino (2,5 mg/Kg/día) y el verapamil (0.25 mg/Kg/día) disminuyen el contenido de calcio y magnesio de la aorta, sin embargo, el efecto antiaterogénico sólo fue observado con el verapamil6. En contraposición, otro estudio realizado en 1996, en hámsters hipercolesterolemicos muestra que la administración de 45 mg/Kg/día de diltiazem concomitantemente con la dieta rica en colesterol por un mes produjo una reducción en la severidad de las lesiones ateroscleróticas a nivel de las válvulas aorticas, arterias coronarias y arco aortico, postulándose que el diltiazem actúa en las primeras fases de la aterosclerosis bloqueando el transporte de lípidos y su acumulación en el espacio subendotelial; mientras que el tratamiento con otro calcio antagonista la nifedipina, no suprimió el efecto aterogénico de una dieta rica en grasa, lo que sugiere que no todas las drogas calcio antagonistas poseen el mismo mecanismo de acción sobre la aterogenesis7.
Estudios recientes han renovado el interés acerca del potencial efecto estabilizador que poseen los calcio antagonistas de tercera generación, tal como la amlodipina, sobre la placa aterosclerótica8, así mismo, se ha reportado que la lacidipina disminuye la progresión y número de lesiones por paciente, postulándose que esta acción antiaterosclerotica es independiente de su efecto antihipertensivo9. Basados en lo anteriormente expuesto, se planificó el siguiente trabajo cuyo objetivo fue estudiar el efecto del tratamiento con diltiazem sobre los niveles séricos de lípidos y las lesiones ateroscleróticas de conejos hipercolesterolemicos Nueva Zelanda.
Métodos
Diseño experimental: Se emplearon treinta y ocho conejos machos Nueva Zelanda, de
Preparación de la dieta hipercolesterolemica: se preparó semanalmente, añadiendo a
Determinación de los lípidos séricos: Las determinaciones de los lípidos séricos colesterol total (CT), colesterol de las lipoproteínas de muy baja densidad (LDLc), y triglicéridos (Tg) se llevaron a cabo en el suero obtenido de la muestra de sangre. El CT y Tg se determinaron por el método enzimático colorimétrico directo (CHOD-PAP, Merck),
Estudio histopatológico: Al final de la duodécima semana, los conejos se sacrificaron, previa anestesia con ketamina (60mg/Kg), procediéndose a la remoción de la arteria aorta abdominal. El material se lavo inmediatamente en NaCl
Extensión de las lesiones: Sobre las aortas preservadas en formalina al 10% se colocó papel transparente, se dibujó el contorno de las arterias y las lesiones con un marcador para acetato, luego se tomaron fotografías de cada una de ellas con una cámara digital, para luego trasladar la información a una computadora14,15; posteriormente utilizando el programa Paint para Windows, se dibujaron por separado, los contornos y las lesiones y se grabaron en archivos separados, los cuales fueron procesados en un programa de computación diseñado (SDIAP) en
Análisis estadístico: Los resultados obtenidos con relación al CT, LDLc y Tg se presentan como medias ± el error estándar (ES) y las comparaciones a los diferentes periodos se realizaron por ANOVA de una vía y el test de Tukey-Kramer (InStat, versión 3.0 for Windows). Las lesiones ateroscleróticas se agruparon según el tipo y número de lesiones, se les realizó la prueba de Fisher’s, para esto, se asociaron las lesiones que presentaron los grupos, de la siguiente forma: 1. Lesiones tempranas: se sumaron las Tipo II y III. 2. Lesiones avanzadas: se sumaron las Tipo IV y V, la comparación entre los porcentajes de lesiones de los grupos se realizo mediante una “t” no pareada. La probabilidad estadística de p<0.05 fue considerada significativa en todos los casos.
Resultados
La administración de una dieta rica en 0.3% de Colesterol incremento significativamente el CT, LDLc y Tg desde las dos semanas (dato no mostrado).
Triglicéridos: En el gráfico 4, se observa que a las seis, nueve y doce semanas de experimentación el grupo A presentó, con respecto al control un incremento significativo de los niveles de Tg (p<0,001), el grupo B fue significativamente mayor que su control a la sexta (p<0,001) y novena (p<0.05) semana, mientras que a la duodécima semana no mostró diferencias, a las seis, nueve y doce semanas, el grupo B, fue significativamente menor que en el grupo A (p<0,001), los niveles de Tg en el grupo A fueron significativamente mayores a los de los grupos C y D a la sexta, novena y duodécima semana (p<0,001), los valores de Tg del grupo B fueron mayores que los del grupo C (p<0,01) y que los del grupo D (p<0,001), a las seis y nueve semanas. A las doce semanas no hubo diferencias entre B y C y el grupo B fue mayor que D (p<0,001), a las seis, nueve y doce semanas no se observaron cambios entre los grupos C y D al compararlos con su control, cuando se comparan los grupos C y D, sólo se observó que a las 12 semanas, los Tg en el grupo C fueron significativamente mayores que en el grupo D (p<0.01).
El objetivo de esta investigación fue evaluar los posibles efectos hipolipidemiantes y antiaterogénicos del diltiazem a la dosis de 30 mg. diarios. En este estudio, los hallazgos obtenidos indican que la administración de una dieta rica en 0,3% de colesterol incrementó significativamente el CT, LDLc y Tg a las seis, nueve y doce semanas, por otra parte, la incorporación de diltiazem a las dos semanas de estar recibiendo la dieta rica en 0.3% de colesterol disminuyó significativamente el CT, LDLc y Tg a las seis, nueve y doce semanas, lo que indica que el diltiazem administrado junto con una dieta enriquecida en 0.3% de colesterol puede contribuir a disminuir la hipercolesterolemia inducida por esta dieta, estos resultados concuerdan en parte con un estudio16 realizado en hámsters, a un grupo se les administró concomitantemente una dieta enriquecida con 3% de colesterol y 45 mg/kg de diltiazem + 20 mg/kg de enalapril y otro grupo de hámsters, solo recibió enalapril y encontraron que solo en el grupo en que asoció diltiazem mostró efecto hipocolesterolemico, así mismo, un estudio realizado en 199117, en conejos con igual dosis de diltiazem a la usada por nosotros, reporta disminución de los lípidos séricos y una correlación positiva de estos con los peróxidos lipídicos plasmáticos y el contenido de calcio en la intima media de la aorta, parámetros que no fueron controlados en esta investigación, igualmente, otro trabajo realizado en 1988, reporta disminución de
La disminución de los lípidos séricos observada en este estudio podría estar mediada por la hormona paratiroidea, ya que se ha asociado, el bloqueo de los canales de calcio con disminución de los niveles de esta y menos dislipidemia19, sin embargo en este estudio no se midieron niveles de la citada hormona.
En este estudio, es necesario resaltar que si bien se observó una disminución del CT y LDLc en los conejos que recibieron diltiazem concomitante con la dieta hipercolesterolemica (grupo B), esta disminución nunca fue superior a la encontrada en el grupo C (Conejarina + 0.3 % de Colesterol por 2 semanas, y a partir de la tercera semana, suspensión de la dieta hipercolesterolemica y administración de diltiazem hasta la duodécima semana), sin embargo, cuando se comparó el grupo C con el grupo D (dieta hipercolesterolemica por dos semanas y a partir de la tercera semana, suspensión de la dieta hipercolesterolemica y Conejarina hasta la duodécima semana), no se observan diferencias significativas, por lo que los resultados del grupo C no se puede atribuir al diltiazem, sino a la suspensión de la dieta hipercolesterolémica, de ahí, que la puesta en practica de adecuados hábitos dietéticos sigue siendo una muy buena medida para evitar las dislipidemías, las cuales constituyen un importante factor de riesgo para enfermedad cardiovascular.
En el presente estudio, los grupos A (Conejarina + 0,3% de Colesterol por 12 semanas) y el B (Conejarina + 0,3% de Colesterol por 12 semanas y a partir de la tercera semana, administración de diltiazem hasta la duodécima semana) no mostraron diferencias en cuanto a la extensión de las lesiones, por lo que no hubo prevención de la formación de lesiones, por otra parte, los grupos C (Conejarina + 0,3% de Colesterol por 2 semanas y a partir de la tercera semana, suspensión de la dieta hipercolesterolemica y administración de diltiazem hasta la duodécima semana) y D (dieta hipercolesterolemica por 2 semanas y a partir de la tercera semana suspensión de la dieta hipercolesterolémica y Conejarina hasta la duodécima semana) no presentaron diferencias en cuanto a las lesiones ateroscleróticas, lo que evidencia que el efecto de regresión observado en estos grupos, no se debe al diltiazem, sino a la dieta y corrobora que esta es una medida valida para inducir regresión de las lesiones ateroscleróticas
De ahí que, en relación a la actividad antiaterogenica del diltiazem, los resultados arriba mencionados señalan que no hubo ni prevención, ni regresión de la placa aterosclerótica una vez establecida la misma, lo cual concuerda con otros estudios, uno de ellos22, concluye que ni en las arterias, ni en órganos afectados de conejos hipercolesterolemicos se evidencio prevención de la acumulación del colesterol por los calcio antagonistas, otro estudio in vitro realizado por, Sobal, Menzel y Sinziger, 200121, acerca la acción del diltiazem en la oxidación de las LDLc concluye que este fármaco no previene la formación de sustancias reactivas del ácido tiobarbitúrico (TBARS) y por ende no previene la oxidación de las LDLc, el cual es considerado un estimulo aterogénico.
Así mismo, un estudio más reciente plantea que las drogas que carecen de carga positiva, tales como el diltiazem, felodipina, nifedipina y verapamil no tienen efecto sobre las propiedades de agregación de las LDL y formación de las células espumosas, mientras que las cargadas positivamente como la amlodipina en cambio, si disminuyen la agregación de las LDL, así, las propiedades electrostáticas de los bloqueantes de los canales de calcio podrían representar un novel mecanismo de su acción antiaterosclerotica23.
En contraste, con nuestros resultados, hay autores como Napoli y col., 1992 que defienden el efecto antiaterosclerótico del diltiazem24, describen que el diltiazem in vitro inhibe la oxidación de las LDLc, el cual puede ser un mecanismo que contribuya al efecto antiaterogénico in vivo de este fármaco, efecto que no se observo en este estudio. En ese mismo orden de ideas, Atkinson en 199725, indica que el diltiazem presenta un efecto de preservación del endotelio arterial. Mas recientemente26, en un estudio planimetrico e histológico con diltiazem en aortas de pollos ateroscleróticos se encontró una reducción significativa de la deposición de lípidos en la aorta y una disminución en la extensión y distribución de las lesiones ateroscleroticas.
De ahí, que si bien estos resultados muestran que el diltiazem administrado concomitante con una dieta hipercolesterolemica disminuye el aumento de los lípidos inducido por dicha dieta, aunque no mostró efecto antiaterosclerótico, por lo que se hace necesario profundizar en este sentido, y considerar valorar otros parámetros: niveles de la hormona paratiroidea, LDL oxidadas, medición de calcio en la aorta, etc, además, se debería planificar estudios con períodos de experimentación y/o dosis de diltiazem mayores, por supuesto, considerando que no induzcan trastornos cardiovasculares en los animales de experimentación, para de esta manera contribuir a esclarecer el mecanismo hipolipidemiante del diltiazem observado en el presente trabajo y porque este efecto no se acompaño de una acción antiaterosclerótica .
Agradecimientos:
Al CDCH-UC por la subvención para hacer posible este trabajo, al Laboratorio Parke-Davis quien por medio del Señor Carlos Fraile nos proporciono generosamente el diltiazem, a
Referencias
1. Mancini GB. Antiatherosclerotic effects of calcium channel blockers.Prog. Cardiovasc Dis.2002; 45(1):1-20.
2. Mason RP.Mechanism of plaque stabilization for the dihydropyridine calcium channel blocker amlodipine: review of the evidence. Atherosclerosis 2002:165(2):191-199.
3. Mason RP. Mechanism of atherosclerotic plaque stabilization for a lipophilic calcium antagonist amlodipine. Am J Cardiol. 2001, 21:88(10A):2M-6M.
4. Simon A, Levenson J. Effects of calcium channel blockers on atherosclerotic: new insights. Acta Cardiol. 2002; 57(4):249-255.
5. Zannad F. Effects of calcium antagonist on atherosclerosis progression and intima media thickness. Drugs. 2000, 59 spec 2: 39-46.
6. Drabkova E, Lazarova Z, Edelsteinova S, Czirfusz A, Gratzlova J, Holub P. The effect of calcium antagonists on total calcium and magnesium levels in the aorta of rabbits alter administration of dietary of cholesterol. Cas Lek Cesk. 1992,13; 131(5):146-148.
7. Raicu M, Pojoga L, Simionescu N, Simionescu M. Differential effect of two calcium channel blockers-nifedipine and diltiazem-on atherogenesis in hypercholesterolemic hamster.J Submicrosc Cytol Pathol. 1996, Apr.; 28(2):265-275.
8. Mason RP. Mechanism of plaque stabilization for a charged calcium channel blocker in coronary artery disease. Pharmacotherapy, 2001a, 21(9Pt2), 209S-215S.
9. Zanchetti A, Bond MG, Hennig M, Neiss A, Mancia G, Dal Palu C et al. Calcium antagonist lacidipine slows down progression of asymptomatic carotid atherosclerosis: principal results of the European Lacidipine Study on Atherosclerosis (ELSA), a randomized, double-blind, long- term trial. Circulation,2002;106(19),2422-2427.
10. Guide for the care and use of animals. Institute of Laboratory Animal Resources. 1996. National Research Council, National Academy Press, Washington DC, USA.
11. Wieland H, Seidel DA. Simple specific method for precipitation of low density lipoproteins. J. Lip.Res. 1983, Vol. 24: 904-909.
12. Luna, Lee. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology.1968, Editions McGraw Hill. New York. USA. Cap. 1- 4: 1-37
13. Stary HC, Chandler, B., Dinsmorer R., Fuster V. A definition of advanced types of atherosclerotics lesions and histological classification of atherosclerosis. A report from the committee on vascular lesions of the council on artheriosclerosis, American Heart Association. Atherosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 1995, Vol 15(9): 1512 – 1531.
14. Kouzuma, R; Tasaki, H; Komura, T; Nakashima, Y; Kuroiwa, A; Tanimoto, A; Koide, O. Combined treatment of probucol with diltiazem regresses atherosclerosis induced by 196 cholesterol diet in rabbit aorta. Artery. 1995, 21(6):337 –351.
15. Schwenke D C, Barh S. Vitamin E combined with selenium inhibits atherosclerosis in hypercholesterolemia rabbits independently of effects on plasma cholesterol concentrations. Circ. Res. 1998, 83:366-377.
16. Raicu, M; Pojoga, L; Simionescu, N; Simionescu, M. The effect of ACE inhibitors on atheroma formation is potentiated by association with a calcium channel blocker. A biochemical and ultrastructural study. J Submicrosc Cytol Pathol. 1997, 29(3):317- 328.
17. Zhang Y. The effects of nifedipine,diltiazem and Paeonia lactiflora Pali on atherogenesis in rabbits.Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi,1991;19(2):100-103.
18. Sugano M.Nakashima Y,Tasaki H, Tagasgi M,Kuroiwa A,Koide O. Effect of diltiazem on supresión and regresión of experimental atherosclerosis.Br J Exp Pathol, 1988;869):513-523.
19. Gadallah MF,el-Shahawy M, Andrews G, Ibrahim M, Randeen G, Hanna D, Gorospe W, Morkos A, Abassian M , Moles K. Factors modulating cytosolic calcium. Role in lipid metabolism and cardiovascular morbidity and mortality in peritoneal dyalisis patients.Adv. Pert Dial,2001,17:29-36.
20. Tzivoni D. End organ protection by calcium channel blockers. Clin Cardiol,2001 24(2): 102-106.
21. Sobal G, Menzel EJ, Sinziger H. Calcium antagonist as inhibitors of in vitro low density lipoprotein oxidation and glycation. Biochem Pharmacol.2001, 61(3): 373-379.
22. Frey, M; Just, H. Role of calcium antagonists in progression of arteriosclerosis. Evidence from animal experiments and clinical experience. Part I. Preventive effects of calcium antagonist in animal experiments. Basic Res Cardiol.1994 89 Suppl 1:161 – 176.
23. Phillip JE,Preston Mason R.Inhibition of oxidized LDL aggregation with the calcium channel blocker amlodipine: role of electrostatic interactions. Atherosclerosis,2003;168(2):239-244.
24. Napoli, C.; Ambrosio, G.; Chiariello, P; Chiariello, M. Calcium channel blockers inhibit human low density lipoprotein peroxidation induced by oxygen free radicals in vitro. Cardiologia. 1992,37(11):801-4.
25. Atkinson JB. Accelerated arteriosclerosis after transplantation, the possible role of calcium channel blockers. Int J Cardiol.1997, Suppl 2: S125-34.
26. García Perez B, Ayala I, Castells MT, Madrid JF, Ortega MR, Ortega JV, Ballesta J, Fernandez Pardo J, Valdes M. Planimetric and histological study of the aortae in atherosclerotic chickens treated with nifedipine, verapamil and diltiazem.Histol Histo Pathol, 2003, 18(4):1027-1033.