Síntesis de serotonina y presencia de hidroxilasa de triptófano en linfocitos de pacientes con depresión mayor tratados con fluoxetina y ácido fólico

Mary Urbina¹, Renée Lavie², Gustavo Resler², Julio Campos², Salvador Mata² y Lucimey Lima^1,2

¹Laboratorio de Neuroquímica, Centro de Biofísica y Bioquímica, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, Venezuela y ²Servicio de Psiquiatría, Hospital Vargas de Caracas, Caracas, Venezuela.

Autor de correspondencia: Dra. Lucimey Lima, Laboratorio de Neuroquímica, Centro de Biofísica y Bioquímica, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas,

Apdo. 21827, Caracas 1020-A. llima@ivic.ve

Resumen

El ácido fólico ha sido utilizado como coadyuvante antidepresivo, y se han reportado bajos niveles séricos en deprimidos. Debido al papel del ácido fólico y a la relevancia del sistema serotonérgico linfocitario en la depresión, el objetivo de este estudio es determinar la capacidad de producción de serotonina y la presencia de la hidroxilasa del triptófano en linfocitos de pacientes deprimidos tratados con fluoxetina y ácido fólico. Los pacientes fueron diagnosticados con los criterios del Manual Diagnóstico y Estadístico de la Asociación Psiquiátrica Americana, la intensidad del episodio depresivo se determinó mediante la Escala de Hamilton para Depresión. Veintisiete pacientes (21-58 años) fueron seleccionados, no presentaban otra patología ni riesgo suicida. Se distribuyeron en forma aleatoria en dos grupos experimentales, unos (14) recibieron fluoxetina, 20 mg/d, más ácido fólico, 10 mg/d y otros (13) fluoxetina más placebo. El grupo control fue constituido por 15 sujetos aparentemente sanos (26-49 años). Se tomaron muestras de sangre al principio y después de seis semanas. Diez pacientes de cada grupo experimental culminaron el estudio. La homocisteína plasmática disminuyó con la administración de ácido fólico. Los linfocitos fueron aislados por gradientes de densidades con Ficoll/Hypaque y adhesión diferencial al plástico. Las concentraciones de serotonina en linfocitos se determinaron por cromatografía líquida de alta resolución con detector electroquímico y no difirieron entre los dos grupos ni en relación al control, pero fueron bajas en los que recibieron el tratamiento. La síntesis de serotonina a partir de triptófano fue menor en los pacientes en relación a controles, y disminuyó después de los dos tratamientos. El número de linfocitos con la enzima fue menor en los pacientes y decreció después del ácido fólico. Los resultados apoyan la hipótesis monoaminérgica de la depresión, en la cual destacan modificaciones en sistemas como el serotonérgico, central y periférico. Las disminuciones en la concentración de serotonina después del tratamiento y en su síntesis antes del mismo indicarían regulaciones vinculadas a la función linfocitaria en deprimidos.

Palabras clave: ácido fólico, depresión mayor, hidroxilasa del triptófano, linfocitos, serotonina, síntesis de serotonina

Summary

Key words: folic acid, major depression, lymphocytes, serotonin, serotonin synthesis, tryptophan hydroxylase.

Recibido: 04/07/2008 Aceptado: 20/08/2008

Introducción

El ácido fólico es una vitamina del complejo B esencial para mantener la integridad y la función del ADN, y presenta relevancia como opción terapéutica razonable en las inflamaciones crónicas, las enfermedades autoinmunes y las alteraciones cardiovasculares¹. Aunque en los casos de deficiencias vitamínicas los suplementos se utilizan en concentraciones farmacológicas y sobrepasan los requerimientos diarios en condiciones normales, la nutrición adecuada es un requisito para el mantenimiento de la salud, y de particular interés para la depresión². Entre las sustancias señalas por estos autores se encuentran los ácidos grasos omega, el folato, la vitamina B₁₂, el hierro, el zinc y el selenio.

La tetrahidrobiopterina es un cofactor en la síntesis de las monoaminas que requiere folato para su formación, por lo que se ha estudiado en la depresión y se ha sugerido una interacción entre los síntomas depresivos, el folato y la biopterina³. Estos autores señalan una interacción significativa entre los síntomas depresivos, el folato y la biopterina. De acuerdo con estudios que señalan la existencia de una disminución de folato en la depresión, se ha propuesto como beneficioso el tratamiento coadyuvante con folatos^4,5. El ácido fólico y la vitamina B₁₂ son determinantes en el metabolismo de un carbono, durante el cual se forma S-adenosilmetionina, muy relevante en las funciones del sistema nervioso, y la deficiencia de estas dos vitaminas resulta en elevaciones de la homocisteina plasmática6. Además, los niveles de homocisteína se encuentran aumentados en la depresión y en correlación con la duración del episodio en curso⁷. La homocisteina es una molécula asociada a alto riesgo cardiovascular y también a la aparición de cambios en el volumen cerebral y en la sustancia blanca de pacientes geriátricos con trastornos psiquiátricos⁸.

Existe evidencia que indica que los linfocitos T circulantes de humanos contienen y transportan serotonina (5HT)^9,10,11. Además, en linfocitos T peritoneales de rata, la 5HT sintetizada se localiza alrededor del núcleo donde aparentemente actúa como neutralizador de radicales de oxígeno¹², un tipo de protección que parece realizar en las células asesinas naturales en conjunto con el 5-hidroxitriptófano¹³. La 5HT contenida en los linfocitos es liberada y actúa en forma autocrina y paracrina sobre sus receptores en las células inmunes circulantes¹⁴. La 5HT también funciona como precursor de la melatonina, la cual se sintetiza en los linfocitos humanos en reposo o estimulados, células que cuentan con toda la maquinaria enzimática para su producción¹⁵.

Se ha demostrado que en la depresión mayor existe una modificación del sistema serotonérgico de los linfocitos T, tal como lo indican las modificaciones del recambio de 5HT, el decremento del transportador de 5HT, el incremento de su proliferación, la activación de los receptores 5HT_1A y la disminución de los 5HT₇ ^14,16. Algunas de estas alteraciones son revertidas por el tratamiento con antidepresivos o mediante la combinación de antidepresivos y psicoterapia^17,18,19.

El triptófano constituye un aminoácido esencial y conocido precursor de la síntesis de 5HT²⁰. Hasta el presente no existen reportes sobre este proceso en linfocitos de pacientes con depresión mayor, aunque la síntesis de 5HT a partir de triptófano ha sido demostrada en linfocitos de rata²¹. Sin embargo, el catabolismo del triptófano, que se inicia con la enzima 2,3-dioxigenasa de indolamina, se ha estudiado en células inmunes y parece estar relacionado con la inflamación, la autoinmunidad y la apoptosis^{22,23,24,25,26}.

Debido a la ausencia de trabajos que estudien el sistema serotonérgico en linfocitos de deprimidos tratados con un suplemento de ácido fólico, y en vista de los reportes que muestran una relación entre el ácido fólico y la producción de 5HT, el propósito de este estudio ha sido comparar un grupo control con grupos de pacientes con depresión mayor que recibieran el antidepresivo fluoxetina y ácido fólico o fluoxetina y placebo, mediante: i) la determinación de las concentraciones de 5HT en los linfocitos antes y después del tratamiento; ii) la evaluación de la síntesis de 5HT antes y después del tratamiento; iii) el estudio de la posible diferencia en la mejoría de los síntomas ocasionada por el suplemento con ácido fólico; iv) la localización y el contaje de las células que expresen la enzima de síntesis de 5HT, la hidroxilasa del triptófano.

Veintisiete pacientes de la Consulta Externa de Psiquiatría del Hospital Vargas de Caracas, edades comprendidas entre 21 y 58 años de edad (35.04 ± 2.63, 4 varones) fueron seleccionados de acuerdo a los criterios de inclusión dentro de un grupo de 170 consultantes por depresión. Se diagnosticó un episodio depresivo mayor primero o un episodio en una persona con un trastorno depresivo recurrente, sin otra patología psiquiátrica o condición médica, sin síntomas psicóticos ni riesgo suicida, y sin tratamiento por al menos un mes antes de entrar en el protocolo. Cada paciente fue informado sobre el objetivo del trabajo, sobre las determinaciones y firmó un consentimiento escrito. El tratamiento fue suministrado y los pacientes sin Historia previa fueron incluidos en la Consulta Externa para controles sucesivos al finalizar la investigación. El estudio fue aprobado por los Comités de Etica de las instituciones respectivas, además de ser registrado en el International Standard Ramdomised Controlled Trial, Número: ISRCT06123818. El diseño correspondió a un protocolo de estudio doble ciego. Para el diagnóstico se utilizaron los criterios del Manual Diagnóstico y Estadístico de la Asociación Psiquiátrica Americana mediante la Entrevista Estructurada de los Trastornos del Eje I²⁷. La intensidad del episodio se determinó mediante la Escala de Hamilton para Depresión de 17 ítems²⁸, se incluyeron aquellos pacientes que tuvieran un puntaje igual o superior a 18 ²⁹, y se valoró a las 0, 3 y 6 semanas. La reducción en un 50% en el puntaje de la Escala se consideró como respuesta al tratamiento³⁰. Los pacientes se asignaron por un método al azar a dos grupos, uno (13 pacientes) que recibió fluoxetina, 20 mg/día, y placebo, y otro que recibió fluoxetina y ácido fólico, 10 mg/día (14 pacientes)³¹, durante 6 semanas. El tratamiento fue suministrado cada 2 semanas al paciente. El grupo control estuvo constituido por 15 sujetos aparentemente sanos, sin antecedentes personales o familiares de enfermedades psiquiátricas de edades comprendidas entre 26 y 49 años (34.13 ± 2.05, 6 varones). Los pacientes y los controles correspondieron a la clase social III y IV según el Método de Graffar modificado por Méndez y Méndez³².

Se tomó una muestra de sangre venosa periférica del antebrazo, entre las 7 y las 8 a.m., la cual fue colocada en tubos con heparina (1000 unidades/ml). Las muestras se enumeraron en forma continua de manera que fueran ciegas para los investigadores en el Laboratorio. Después de la centrifugacióna 500 g por 5 min se tomó el plasma y se centrifugó a 38000 g, 40C, por 10 min para obtener plasma pobre en plaquetas, el cual se conservó a -800C hasta realizar los análisis mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa³³.

Luego de la centrifugación de la sangre y separación del plasma, se tomó la capa de células blancas y algunas rojas y se transfirió a tubos con solución tampón de fosfato de sodio en salina p H 7.4 (PBS) y se centrifugó a 150 g a temperatura ambiente por 10 min. La capa de células blancas se tomó y se completó con PBS hasta 10 ml para colocarla sobre 5 ml Ficoll/Hypaque (1077 g/l) y centrifugar a 1500 g por 30 min. Se obtuvo la capa de células periféricas mononuclearesse obtuvo y se sembró en frascos plásticos sin substrato en medio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) por 1 h. Las células no adherentes, 85-90% CD3+, se utilizaron para las determinaciones, integridad celular > 96% por exclusión de Tripán azul. Las células fueron contadas, lavadas y suspendidas en solución tampón para la cromatografía, homogenizadas en un Tissumizer (Tekmar Company, EE.UU.), centrifugadas a 38000 g por 10 min y el sobrenadante fue conservado a -800C para determinación de 5HT. Se empleó un sistema que consiste en un integrador y una bomba Waters Modelo 600, un inyector automático Waters Model 7171, una columna Supelco LC-18 (15 cm x 4.6 mm, 5 µm), y un detector amperométrico Waters Modelo 464 (+0.7 V, 0.2 nA). La fase móvil consistió en acetato de sodio 0.02 M, ácido cítrico 0.0125 M, EDTA 1 mM, octanilsulfonato 1.52 mM pH 3.9, más 10% de acetonitrilo11. Se empleó el método del estándar externo para los cálculos mediante el programa (Millenium Waters, EE.UU). Las concentraciones son expresadas en ng/10⁶ células.

Para la estandarización del estudio de la síntesis de 5HT en los linfocitos aislados se realizaron experimentos con varias concentraciones de triptófano o de 5-OH-triptófano, 1 a 100 µM, así como de diversas diluciones de linfocitos y tiempos de incubación. El triptófano se usó para todos los experimentos. Las células, ~600000 en 100 µl, se añadieron a 100 µl de solución Ringer con pargilina, inhibidor de la monoaminooxidasa, a una concentración final de 10 µM. Luego de incubación por 5 min a 250C se colocaron los tubos en hielo, se añadieron 400 µl de solución tampón de cromatografía, se centrifugaron a 28000 g por 5 min y se congelaron las muestras a -800C. Para el momento de inyección al cromatógrafo se descongelaron, se sonicaron durante 5 min, se centrifugaron a 38000 g por 10 min, y se inyectaron de 100-150 µl del sobrenadante al cromatógrafo para determinar la 5HT formada a partir de triptófano menos la basal. Los resultados son expresados en pg/10⁶ células.

Luego se sometieron a la presencia de anticuerpos para la hidroxilasa del triptófano humana, D-15 contra la región interna, y C-20 contra la región carboxiterminal (Santa Cruz), ambos en cabra, dilución 1:100. La incubación fue por 14 horas a 40C. Posteriormente se hicieron 3 lavados en PBS con Triton X-100 0.2%. El segundo anticuerpo en conejo anticabra y conjugado con fluoresceína, 1:50, incubado por 1 h a temperatura ambiente (Santa Cruz). Se realizaron 3 lavados en PBS, se colocó Immuno-Mount (Kodak) sobre las células en la lámina para proteger la fluorescencia y el cubre-objeto para observarse en un microscopio fluorescente Nikon. Las células francamente fluorescentes se contaron sobre el total (alrededor de 300) para cada una de las condiciones experimentales.

Los resultados se expresan como la media ± error estándar de la media (EEM). La velocidad máxima (Vmax) y la constante de Michaelis-Menten (Km) se calcularon por ajuste curvilíneo con el programa GraphPad³⁴. El análisis de varianza y la prueba t de Student se realizaron para determinar la significancia estadística. Las diferencias se consideraron significativas para un valor de p < 0.05.

Resultados

De los 27 pacientes diagnosticados e incluidos en el protocolo, 20 completaron el estudio, el resto lo abandonó voluntariamente por mejoría parcial de los síntomas, no manifestaron efectos colaterales. Los síntomas más frecuentes fueron tristeza, anhedonia, anorexia, insomnio y ansiedad. Los dos grupos de pacientes no presentaron diferencias significativas en cuanto a la intensidad del episodio depresivo. El puntaje de la HAM-D fue de 22 ± 1 y de 23 ± 1 para los grupos con placebo o con ácido fólico, respectivamente. Hubo una disminución superior al 50% en ambos grupos después de las 6 semanas de tratamiento, 11 ± 1 para placebo y 8 ± 1 para ácido fólico (p < 0.05). El ácido fólico plasmático incrementó significativamente en los pacientes que lo recibían, 9.2 ± 1.9 y 47.8 ± 6.6 nM, respectivamente (p < 0.05), y no difirió de los controles antes del tratamiento. Los niveles de homocisteína bajaron significativamente en un 20% por efecto del ácido fólico, 9.9 ± 0.7 vs. 7.3 ± 0.6 (p < 0.05).

Concentraciones de serotonina en linfocitos de controles y de pacientes antes y después del tratamiento

Los niveles de 5HT en los linfocitos no fueron diferentes entre los controles y los pacientes antes de recibir los dos tipos de tratamiento. No existieron diferencias significativas en los niveles de 5HT linfocitaria entre los pacientes que recibirían placebo y en los que recibirían ácido fólico antes de comenzarla administración del tratamiento. La administración de fluoxetina y placebo o de fluoxetina y ácido fólico por 6 semanas produjo la disminución significativa en las concentraciones de 5HT en los linfocitos, si se compara con el control y con los niveles iniciales de cada grupo (Fig. 1 A y B).

La formación de 5HT a partir de triptófano fue menor en los pacientes que en los controles antes y después del tratamiento con fluoxetina más placebo y con fluoxetina más ácido fólico (Fig. 2 A y B). La síntesis de 5HT en los linfocitos no difirió en forma estadísticamente significativa entre los grupos de pacientes. Después del tratamiento hubo una reducción en la síntesis de 5HT de magnitud semejante en los pacientes que recibieron placebo o ácido fólico, y fue significativamente menor en ambos grupos con respecto a antes del tratamiento. El valor de la Km fue de 1.97 ± 0.39 µM para los controles. Los valores de la Km para los grupos de tratamiento con placebo o con ácido fólico fueron significativamente menores en relación al control, 0.59 ± 0.18 y 0.78 ± 0.41, respectivamente (p < 0.05). Los valores de la Km después del tratamiento difirieron significativamente entre los dos grupos, 0.97 ± 0.63 para el grupo con placebo y de 0.36 ± 0.10 para el grupo con ácido fólico (p < 0.05).

El porcentaje de células inmunoreactivas fue significativamente menor en los pacientes con respecto al grupo control, además hubo una disminución significativa luego del tratamiento con fluoxetina más ácido fólico (Fig. 3 y 4).

Discusión

Uno de los aspectos de interés de este estudio ha sido determinar si la administración conjunta de ácido fólico con un antidepresivo podía adelantar o incrementar la respuesta al tratamiento. Algunas investigaciones han mostrado que el ácido fólico puede ser un potenciador de la terapia antidepresiva^4,5,35. Además, los niveles bajos de ácido fólico y de vitamina B₁₂, y los altos de homocisteína pueden ser predictores de la respuesta a ciertos antidepresivos^36,37,38. Al final de las 6 semanas de tratamiento pudo observarse una mayor respuesta en los pacientes que recibieron fluoxetina más ácido fólico en relación a los que sólo recibieron fluoxetina más placebo, pero no se apreció aceleración de la misma, esto es, mejoría en el grupo que recibía ácido fólico más tempranamente. Es posible que el tiempo del estudio no haya sido suficientemente largo como para observar diferencias más marcadas entre los grupos, además, la falta de continuación en el protocolo disminuyó el número de pacientes. Esta es una dificultad muy frecuente que se observa cuando se administran tratamientos, por lo general ocurre una pérdida del 50% de los sujetos en el transcurso de las evaluaciones, aun con buena respuesta clínica, con suministro de los medicamentos y sin presencia de reacciones adversas. En cuanto al porcentaje de pacientes que respondieron al tratamiento, los resultados mostrados fueron similares a los reportados en la literatura^39,40,41.

Aunque se ha señalado una disminución de ácido fólico en el plasma de pacientes con depresión mayor, no se observó en este grupo de pacientes, pero sí hubo un incremento considerable y significativo en los suplementados con el ácido  fólico, lo cual corrobora la toma del mismo. A pesar de noobservarse un menor nivel de folato antes del tratamiento, aun podría existir una alteración en la interacción de síntomas depresivos con niveles de folato y neopterinas a nivel celular, con posible aumento de estas últimas en individuos que reciben folato³.

En los linfocitos se han reportado varios neurotransmisores, además de la 5HT^11,48. Ellos contienen la noradrenalina^42,49, la dopamina^50,51 y la acetilcolina⁵², entre otros. Aunque se han observado diversas variaciones en los niveles de 5HT y 5HIAA en la depresión, lo cual incluye aumentos, disminuciones y ausencia de modificaciones, en este grupo de pacientes no hubo diferencias significativas con respecto al control, lo cual no es de extrañar dado la amplitud del compartimiento del sistema serotonérgico y la heterogeneidad del trastorno depresivo. Sin embargo, en un estudio previo (Mata y col., 2008) después de la administración de venlafaxina la disminución significativa de ambas sustancias indica que la falta de protección del metabolismo debida a la inhibición del transporte de 5HT por la venlafaxina hace que permanezca más expuesta a la acción de la mono-amino-oxidasa y así se produce el catabolismo con la subsiguiente eliminación del 5HIAA. Por otro lado, si disminuye la 5HT, la síntesis podría incrementarse sin lograr la elevación de los niveles de la monoamina debido a la liberación y a la persistente inhibición del transporte por un inhibidor del mismo.

Llama la atención la disminución de la síntesis de 5HT a partir de su precursor triptófano en los pacientes antes del tratamiento, lo cual indica una modificación relevante del sistema en la depresión. La ausencia de diferencias en la concentración de 5HT entre los controles y los pacientes deprimidos, a pesar de la menor tasa de síntesis, podría corresponder con una más eficiente conservación intracelular de la 5HT o una disminución en el catabolismo, de manera que permita contar con la 5HT para ser liberada e interactuar con los receptores específicos. Podría ser, además, que el triptófano estuviera destinado a la acción de la 2,3-dioxigenasa de indolamina y no a la formación de 5HT en la depresión. Esta es la enzima inicial en la vía de la kinunerina²², y a su vez está relacionada con procesos inflamatorios^24,25,26. Por otro lado, después de ambos tipos de tratamiento, la disminución de la síntesis es aun de mayor magnitud, lo cual podría corresponder con la utilización del triptófano para otros fines o a algún tipo de modificación en los transportadores del triptófano. La elevación del transportador de 5HT producida por el tratamiento con venlafaxina¹⁸ podría ser parcialmente responsable de la inhibición de la síntesis, ya que entraría más 5HT a la célula y podría actuar sobre la hidroxilasa del triptófano. A pesar de la disminución de la Vmax hubo un incremento de la afinidad por el triptófano en los pacientes, lo que se aprecia por la disminución de la Km con respecto a los controles. Interesantemente, el valor de la Km en los linfocitos de los pacientes tratados con ácido fólico fue menor que en los que recibieron placebo, lo que indica un efecto modulador que podría compensar la baja capacidad de síntesis con el aumento de la afinidad por el sustrato. Es posible que ciertos efectos producidos por el folato sobre la 5HT linfocitaria quedaran enmascarados por la acción de la fluoxetina, debido a la eficiente inhibición del transportador de 5HT y las consecuencias que deriva, sin embargo, en cuanto a los parámetros de síntesis, sí se evidenció una modificación en la afinidad de la enzima por el triptófano debida a la administración de ácido fólico.

Además, los linfocitos expresan la triptófano hidroxilasa en forma diferencial, lo cual hace sugerir un papel particular del sistema de 5HT en subpoblaciones linfocitarias aun no identificadas, así como una regulación determinada debida a modificaciones desencadenadas por la alteración afectiva o como consecuencia de ella. Esto constituye un área de investigación de interés en la depresión mayor, ya que el linfocito cuenta con un sistema serotonérgico complejo que incluye entrada del precursor triptófano, síntesis, almacenamiento, liberación, catabolismo, autorregulación por receptores serotonérgicos, e incluso producción de melatonina¹⁴.

Aparentemente, tal como sucede en el sistema nervioso central, los inhibidores de la recaptura de 5HT, como la fluoxetina, además de elevar las concentraciones sinápticas o circundantes de la indolamina, secundariamente disminuyen las circulantes, así se afectan los sistemas de transducción y de recambio metabólico, lo cual podría ser parte del mecanismo por el que ejercen sus efectos terapéuticos, tal como se ha reportado⁵³.

Agradecimientos. Financiamiento del fondo de Ciencia, Tecnología e Innovación (FONACIT) G-1387. Al Dr. Rafael Apitz y al Dr. Alberto García. A la Sra. Carolina Flores por asistencia secretarial.

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