PSEUDOTROMBOCITOPENIA EDTA-DEPENDIENTE: ROL DEL LABORATORIO CLÍNICO EN LA DETECCIÓN Y EL CORRECTO CONTAJE PLAQUETARIO
M Morales1, A Moreno2, M Mejía2 e Y Bustamante2.
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Escuela de Bioanálisis UCVRESUMEN
La pseudotrombocitopenia EDTA dependiente (PTCP-EDTA) es definida como una falsa disminución del contaje plaquetario producto de un artefacto de laboratorio, que ocurre cuando en muestras sanguíneas extraídas con EDTA y procesadas en un autoanalizador hematológico se produce una agregación plaquetaria progresiva en el tiempo por efecto de la acción de anticuerpos fríos. La falta de reconocimiento de éste fenómeno se traduce en diagnósticos errados, realización de exámenes adicionales y terapias inadecuadas. En este trabajo se estudian casos de PTCP-EDTA en pacientes que asistieron al Servicio de Bioanálisis del Hospital José Gregorio Hernández del I.V.S.S., durante el periodo del 01/01/99 al 31/07/00 proponiéndose diversas alternativas para correctos contajes de plaquetas en las muestras en que se observó este fenómeno. Sangre de cinco pacientes fue tratada con diversos anticoagulantes (EDTA, citrato y oxalato) y se conservaron a temperatura ambiente (T.A.) y 37°C, en tres de ellos se tomaron muestras adicionales en EDTA para suplementarla con Kanamicina a fin de observar los efectos de este antibiótico sobre los parámetros hematológicos. De un total de 25.390 hematologías procesadas se detectaron 9 casos de PTCP-EDTA (incidencia 0,04%). CONCLUSIONES: el citrato no es el anticoagulante recomendado para el correcto contaje plaquetario en estos pacientes; una buena alternativa pudiese ser la incubación inmediata de la muestra, a 37°C, después de ser extraída. La pre-suplementación con Kanamicina, de muestras extraídas con EDTA se presenta como método ideal para el correcto contaje automatizado de plaquetas en casos de PTCP-EDTA conocida, debido a que evita la agregación plaquetaria sin afectar otros parámetros hematológicos, de igual modo el realizar contajes manuales (Unopette), es una buena alternativa para llevar a cabo un correcto contaje de plaquetas en estos pacientes.
]]>Palabras Claves:
Plaquetas, Trombocitopenia, Pseudotrombocitopenia, EDTA.ABSTRACT
Pseudothrombocytopenia is defined as a low platelet count resulting from a laboratory artifact to occur in specimens extract with EDTA and perform in automated cell-count cause progress platelet clumping in the time for effect of platelet cold agglutinins. If you don’t recognize the phenomenon may lead to erroneous diagnosis, unnecessary and costly additional laboratory examinations, and inappropriate medical o surgical therapy. This study marks pseudothrombocytopenia EDTA-induced (PTCP-EDTA) in patients of Bioanálisis Service of "Dr. José Gregorio Hernández" Hospital-IVSS (Venezuelan Institute of Social Security), in the period of 01-01-99 to 31-07-00 propose variety alternative for correct platelet count in specimens with this phenomenon. The blood of five patients was treaty with differents anticoagulants (EDTA, citrate, oxalate) and keep a room temperature and 37°C.The methodology studioused was extract an additional sample with EDTA for supplementary with kanamicin in three of those five patients, to analyze the effect of kanamicin about hematology parameters. Through 25.390 hematology performs was detect nine cases of PTCP-EDTA. Conclusion: The citrate isn´t the anticoagulant recommend for correct platelet count in this patients; other alternative can be keep the specimens to 37°C, right after collect. The supplementary kanamicin in the collect blood sample in EDTA is the ideal method for correct platelet count in automated cell-count in cases of previous diagnostic PTCP-EDTA. Because avoid platelet clumps and it doesn’t show changes hematology parameter. Another method is collect a finger-stick blood by using an ammonium oxalate Unopette and to count the blood cells by phase microscopy.
Key Words: Platelet, Pseudothrombocytopenia, Thrombocytopenia, EDTA.
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INTRODUCCIÓN
La pseudotrombocitopenia es definida como una falsa disminución en el contaje plaquetario producto de un artefacto de laboratorio(1). Entre los factores que pueden ocasionarla se han descrito: coagulación parcial de la muestra(1-5), fallas en la técnica de extracción(1-5), satelitismo plaquetario(6-12), presencia de plaquetas gigantes(1-5) y la existencia de anticuerpos antiplaquetarios en presencia de anticoagulantes(1-5,9,13-20). Las Pseudotrombocitopenias representan aproximadamente el 49% de las trombocitopenias que se presentan en muestras analizadas en autoanalizadores hematológicos. De ellas, el 72% es debido a la agregación por Ácido Etilen-diamino-tetra-acético (EDTA)(5), que es el anticoagulante recomendado por la International Council for Standardization in Haematology (ICSH) para la realización de hematologías(21).
Inicialmente el fenómeno fue reconocido por Gowland et al. en 1969(13) y Watkins y Shulman en 1970(14), quienes describieron un factor en el suero que provocaba aglutinación de las plaquetas in vitro, en presencia de EDTA y a temperaturas menores de 37°C. La formación de estos agregados es dependiente del tiempo por lo que una progresiva reducción del contaje plaquetario puede ser observado al procesar las muestras en distintos momentos.
]]> La presencia de pseudotrombocitopenia EDTA-dependiente (PTCP-EDTA), no se ha relacionado con alteraciones en la morfología y función plaquetaria(1,13). Se ha llegado a afirmar que este fenómeno no está asociado a enfermedades autoinmunes ni hemorrágicas. No existiendo correlación alguna entre la pseudotrombocitopenia EDTA dependiente, el estado salud-enfermedad y la edad(4,5,19,22); curiosamente la pseudotrombocitopenia EDTA dependiente prevalece en las mujeres con un 65%.La detección de este fenómeno es sumamente importante ya que la falta de reconocimiento de este falso contaje plaquetario puede provocar la realización de costosos exámenes adicionales, diagnósticos errados y largas terapias con corticoesteroides, suspensión de tratamientos e incluso un cambio de vida del paciente por temor al sangrado; por todo esto es importante que exista una buena comunicación entre el clínico y el personal del laboratorio para que, en casos de trombocitopenias, sean descartadas y/o detectadas las pseudotrombocitopenias y dentro de éstas las debidas a EDTA.
Hasta ahora no está totalmente dilucidado el mecanismo por el cual se forman los agregados plaquetarios en presencia de EDTA. Diversos estudios demuestran que los anticuerpos en pacientes pseudotrombocitopénicos reconocen un determinante antigénico en la GPIIb de la membrana plaquetaria lo cual es una expresión estrictamente dependiente de la presencia de anticoagulantes quelantes de Ca2+. Otro estudio plantea la posibilidad que la unión anticuerpo-GPIIb provoca la activación y posterior agregación plaquetaria(23).
Sakurai et al.(24) en 1997, propusieron dos nuevas hipótesis para explicar la agregación plaquetaria inducida por EDTA. Ellos observaron que los pacientes que exhibían un contaje normal de plaquetas en la admisión y que luego desarrollaban pseudotrombocitopenia EDTA-dependiente habían recibido tratamiento con antibióticos de 4 a 10 días antes de la detección de pseudotrombocitopenia. Por lo que su hipótesis primaria fue que los anticuerpos antiplaquetario de los pacientes pseudotrombocitopénicos en un principio eran originados contra los antibióticos con los cuales ellos habían sido tratados, sin embargo, en este mismo estudio se observó que no había una relación específica entre los antibióticos usados para el tratamiento del paciente y aquellos que fueron demostrados como efectivos en la prevención de la agregación plaquetaria, sugiriendo que esta hipótesis es improbable. Una explicación alternativa sería que la adición de EDTA previene la agregación en pacientes normales por un incremento de la carga de la superficie plaquetaria; los anticuerpos antiplaquetarios que inducen PTCP-EDTA dependiente pudiesen entonces disminuir la carga de superficie de las plaquetas y antagonizar los efectos anticoagulantes del EDTA, explicando la agregación.
MATERIALES Y MÉTODOS
Del total de hematologías procesadas en el laboratorio del Hospital "Dr. José Gregorio Hernández" del Seguro Social de Caracas, durante el período comprendido entre el 01 de enero de 1999 y el 31 de julio de 2000, se reestudiaron aquellos pacientes a quienes se les había reportado un contaje bajo de plaquetas y en cuyos extendidos sanguíneos mostraban agregados plaquetarios; así como aquellos que en dos o más hematologías se les habían reportado contajes plaquetarios discordantes.
En total se evaluaron cinco (05) pacientes en los que se presumía la existencia de PTCP-EDTA dependiente.
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COMPORTAMIENTO DEL CONTAJE PLAQUETARIO CON DIVERSOS ANTICOAGULANTES Y A DIFERENTES TEMPERATURAS
Se recolectaron las muestras en cuatro (4) tubos al vacío (Vacutainer Systems Becton Dickinson), dos de los tubos contenían 0.057ml de EDTA-K3 al 15% para un volumen total de 5ml, uno se incubó a 37°C durante todo el ensayo yel otro se mantuvo a temperatura ambiente, un tercer tubo con 0.3ml de citrato de sodio dihidratado al 3.8% para un volumen total de 3ml se dejó a temperatura ambiente y de un cuarto tubo sin aditivo se obtuvo suero para la realización de pruebas bioquímicas.
A cada uno de los pacientes se les tomó muestra capilar para el contaje manual por el método de Brecher-Cronkite utilizando Unopette; este contaje se llevó a cabo por triplicado(25).
Cada muestra fue mezclada veinte (20) veces por inversión completa manual y/o en un mezclador de muestras (Coulter Electronic INC Hialeah Florida) antes de ser procesada e inmediatamente se elaboró su respectivo frotis por duplicado, estos frotis sanguíneos fueron teñidos con colorantes tipo Romanoswky
(Giemsa y Wright).Cada 5 minutos, durante una hora se procesaron las muestras en un contador electrónico automatizado Coulter T-890 (Coulter Electronic INC Hialeah Florida), en la siguiente secuencia:
1. Muestra anticoagulada con EDTA-K3 conservada a temperatura ambiente.
]]> 2. Muestra anticoagulada con EDTA-K3 conservada a 37°C.3. Muestra anticoagulada con Citrato de Sodio 3,8% conservada a temperatura ambiente.
En los datos de la muestra citratada se realizó una corrección por la dilución.
Para el análisis de los datos: el contaje de plaquetas y leucocitos se utilizó el programa Excel del Office 98.
EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN DEL EDTA CON KANAMICINA EN LOS PARÁMETROS HEMATOLÓGICOS (suplementación inmediatamente después de extraída la muestra)
En tres de los cinco pacientes evaluados (3, 4 y 5) se tomó una muestra adicional con EDTA-K3 al que se le agregó inmediatamente kanamicina. Estas muestras se mantuvieron a temperatura ambiente y se procesaron paralelamente con las muestras anteriormente señaladas.
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RESULTADOS
De un total de 25.390 hematologías procesadas se detectaron nueve casos (09) de PTCP-EDTA dependiente, siendo la incidencia observada de 0,04%.
De los nueve casos reconocidos en más de año y medio todos fueron del sexo femenino, ocho (08) pacientes ambulatorios y uno (01) se encontraba hospitalizado. De los casos hallados en este período, sólo cinco (05) aprobaron participar en este protocolo con edades comprendidas entre 14 y 63 años (media 43 años).
El comportamiento del contaje de plaquetas y leucocitos, con diversos anticoagulantes y a diferentes temperaturas en uno de los pacientes se observa en la Gráfica 1.
El efecto de la suplementación del EDTA con kanamicina sobre los parámetros hematológicos se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1: Variaciones de los parámetros hematológicos en 3 pacientes del Hosp. JGH, con PTCT-EDTA dependiente en EDTA a diferentes temperaturas y suplementado con kanamicina. Agosto 2000.
| Parámetro | EDTA a Temperatura ambiente | EDTA a 37ºC | EDTA + Kanamicina | ||||||
| Media | *2DS | ]]> %Coeficiente de Variación | Media | *2DS | %Coeficiente de Variación | Media | *2DS | %Coeficiente de Variación | |
| Glóbulos Blancos x109/l | |||||||||
| Paciente 3 | 10.7 | ]]> 1.0 | 4.9 | 9.8 | 0.2 | 1.2 | 9.8 | 0.2 | 1.3 |
| Paciente 4 | 9.5 | ]]> 1.0 | 5.8 | 8.8 | 0.2 | 1.5 | 8.7 | 0.2 | 1.4 |
| Paciente 5 | 8.4 | ]]> 1.0 | 10.3 | 6.9 | 2.1 | 2.1 | 6.0 | 0.2 | 1.9 |
| Coulter T-890 | (4.0-11.5)x109/L | ]]> Coeficiente de Variación = menor o igual al 2% | |||||||
| Glóbulos | |||||||||
| Rojos x109/L | |||||||||
| Paciente 3 | 4.49 | 0.04 | 0.50 | 4.47 | 0.04 | 0.50 | ]]> 4.39 | 0.06 | 0.60 |
| Paciente 4 | 4.80 | 0.04 | 0.50 | 4.80 | 0.06 | 0.70 | ]]> 4.70 | 0.08 | 0.80 |
| Paciente 5 | 4.60 | 0.06 | 0.70 | 4.60 | 0.06 | 0.70 | ]]> 4.50 | 0.04 | 0.50 |
| Coulter T-890 | (3.00-6.00)x109/L | Coeficiente de Variación = menor o igual al 1.5% | |||||||
| Hemoglobina (Gr/Dl) | |||||||||
| Paciente 3 | 11.4 | 0.2 | ]]> 0.7 | 11.4 | 0.2 | 0.7 | 11.1 | 0.2 | 0.6 |
| Paciente 4 | 14.6 | 0.2 | ]]> 0.9 | 14.6 | 0.2 | 0.5 | 14.5 | 0.2 | 0.8 |
| Paciente 5 | 14.5 | 0.2 | ]]> 0.7 | 14.4 | 0.2 | 0.7 | 14.4 | 0.2 | 0.7 |
| Coulter T-890 | (12.0-18.0)Gr/Dl | Coeficiente de Variación = menor o igual al 0.8% | |||||||
| ]]> Hematocrito (%) | |||||||||
| Paciente 3 | 36.6 | 0.4 | 0.7 | 36.6 | 0.6 | 0.9 | 36.0 | 0.8 | ]]> 1.1 |
| Paciente 4 | 45.1 | 0.8 | 0.8 | 45.1 | 1.0 | 1.2 | 44.7 | 1.0 | ]]> 1.2 |
| Paciente 5 | 44.2 | 0.4 | 0.5 | 44.0 | 0.8 | 0.9 | 43.6 | 0.6 | ]]> 0.8 |
| Coulter T-890 | (24.0-70.0)% | Coeficiente de Variación = menor o igual al 1% | |||||||
| Vcm (fL) | |||||||||
| Paciente 3 | 81.7 | 1.0 | 0.6 | 81.8 | ]]> 1.2 | 0.7 | 82.0 | 1.6 | 0.9 |
| Paciente 4 | 94.0 | 0.8 | 0.5 | 94.5 | ]]> 1.6 | 0.8 | 94.6 | 1.6 | 0.8 |
| Paciente 5 | 95.6 | 1.2 | 0.6 | 95.5 | ]]> 1.0 | 0.5 | 96.4 | 1.4 | 0.7 |
| Coulter T-890 | (80.0-100.0)fL | Coeficiente de Variación = menor o igual al 1% | |||||||
DISCUSIÓN
]]>La incidencia de PTCP-EDTA dependiente en este centro asistencial para el lapso comprendido entre 01-01-99 al 31-07-00 fue de 0,04%. Estos resultados están por debajo de los reportados en la literatura mundial que van desde 0.07%(3) hasta 1.9%(1). Se infiere que la causa de esta diferencia puede ser debido a variaciones propias de la población venezolana, ya que no conocemos incidencias de este fenómeno en la comunidad latina; o que se esté presentando un subregistro de casos en este servicio.
Todos los pacientes a quienes se le detectó pseudotrombocitopenia EDTA-dependiente en el presente estudio fueron del sexo femenino, hecho que se corresponde con lo descrito en la literatura(3, 5,19, 26). En ninguno de los casos, el motivo de consulta se relacionó con el desarrollo de este fenómeno. El total de los pacientes no presentaron patologías que se pudiesen asociar con trombocitopenias verdaderas (a excepción de dos (02) casos de síndrome viral), la mayoría de éstos asistieron al laboratorio para exámenes de control o de rutina y sólo uno estaba hospitalizado; encontrándose una mayor prevalencia en pacientes aparentemente sanos. La edad de los pacientes estuvo en un rango amplio de 14 a 63 años, la ausencia de infantes en el presente estudio se explica por el hecho de que en este centro asistencial, se atienden en su mayoría pacientes de edad avanzada y con enfermedades crónicas.
Las muestras analizadas presentaron un contaje inicial de plaquetas dentro del rango de referencia normal (232-336)x109/l(27). En estos pacientes se observó una disminución progresiva en el contaje de plaquetas de las muestras tomadas con EDTA y mantenidas a temperatura ambiente, llegando a ser ésta hasta un 91% más baja que el contaje inicial, a los sesenta (60) minutos después de extraída la muestra. A pesar de que la disminución fue homogénea (77%-91%), la intensidad del decrecimiento a través del tiempo fue diferente en cada uno de los pacientes. Paralelo a la disminución del contaje plaquetario, se observó un aumento en el número de glóbulos blancos registrados por el equipo, llegando a ser este incremento hasta un 130% del contaje inicial.
La observación microscópica de los extendidos sanguíneos de estos pacientes mostraron la existencia de cúmulos plaquetarios que iban aumentando en número y tamaño gradualmente en el tiempo, (Figura 1). La formación de estos cúmulos explicaría la disminución progresiva del contaje plaquetario y el aumento paralelo del contaje leucocitario, ya que los mismos al llegar a tener un volumen mayor de 20fl no son detectados por el autoanalizador como plaquetas, sino que son registrados como leucocitos debido a su similitud con estos últimos, (Figura 2). Estos resultados son compatibles con el diagnóstico de PTCP-EDTA dependiente.
Figura 1: Agragados plaquetarios observados en muestra extraída a los 30 minutos y mantenidas a temperatura ambiente (100x).
Los resultados obtenidos en muestras anticoaguladas con citrato exhibieron un fenómeno similar al observado en las muestras anticoaguladas con EDTA y mantenidas a temperatura ambiente, aunque la disminución del contaje plaquetario se hace menos acentuada a través del tiempo. Llama la atención que en diversos reportes(1,3,15,20,28,29,30,31,32) se ha recomendado el uso del citrato como alternativa para confirmar la existencia de PTCP-EDTA dependiente e incluso lo señalan como el anticoagulante a utilizar para la realización del contaje plaquetario automatizado en pacientes que presentan este fenómeno.
No es recomendable el uso del citrato para confirmar el diagnóstico de PTCP-EDTA dependiente, así como tampoco el anticoagulante alternativo para el contaje de plaquetas en estos casos, debido a que en todos los pacientes el contaje fue disminuyendo en distintas proporciones y el coeficiente de variación de dichos contajes estuvo en un rango de 14% al 49%, lo que resulta poco confiable para el uso en el laboratorio clínico de rutina. A diferencia de los contajes plaquetarios realizados bajo las condiciones antes descrita (EDTA y citrato mantenidas a temperatura ambiente), en los contajes plaquetarios de las muestras extraídas con EDTA y conservadas a 37°C se obtuvieron coeficientes de variación con un rango de 1.7% al 8.8%, aunque éste es mucho menor que los obtenidos en EDTA y citrato mantenidas a temperatura ambiente, la mayoría de los valores no estuvieron dentro del rango establecido por el fabricante del equipo (£ 3%), solo dos (02) pacientes mostraron coeficiente de variación aceptable. Estos resultados indican que el mecanismo por el cual se forman los agregados debe estar relacionado con un tipo de anticuerpo que reacciona a temperaturas menores de 37°C.; debido a que en la mayoría de los laboratorios clínicos de rutina cuentan con baño de María pareciera práctico y de bajo costo la implementación de este protocolo para el correcto contaje de plaquetas, en pacientes a los que se les ha reconocido previamente este fenómeno. Cabe destacar, que en nuestros casos al igual que los reportados por Watkins(14) y Sheiner(15) la agregación plaquetaria no se revertió al ser incubada la muestra a 37°C.
En los experimentos al suplementar inmediatamente con Kanamicina, las muestras de tres (03) pacientes extraídas con EDTA, se observaron contajes plaquetarios que se mantuvieron constantes durante los sesenta (60) minutos de la prueba, correspondiéndose éste resultado con un bajo porcentaje de disminución entre los contajes iniciales y finales (rango: 0-4%) y un coeficiente de variación que se mantuvo entre el 2.2% y el 3.4%, lo que refleja una precisión válida como para que este protocolo sea usado en el laboratorio clínico de rutina.
Al realizar el contaje manual de plaquetas por el método de referencia de Brecher-Cronkite encontramos valores entre 222-305 x109/l, observando un contaje comparable entre éstos y aquellos realizados por el autoanalizador a las muestras suplementadas con Kanamicina (240-290 x 109/l), lo que evidencia la exactitud del protocolo propuesto. Los autores piensan que la suplementación con este antibiótico es efectiva no sólo para evitar la agregación sino, que además, permite realizar contajes plaquetarios exactos y reproducibles a través del tiempo en los pacientes con PTCP-EDTA dependiente. De igual forma se analizaron los posibles cambios que esta suplementación pudiese ocasionar en el resto de los parámetros hematológicos (glóbulos blancos, glóbulos rojos, hemoglobina, hematocrito y VCM), y observando que estos no se alteran, podemos concluir que la suplementación con Kanamicina, sería el método ideal para el correcto contaje automatizado de plaquetas, sin alterar los otros parámetros hematológicos, en pacientes con PTCP-EDTA dependiente previamente diagnosticada.
El mecanismo por el cual este antibiótico es capaz de prevenir los cúmulos plaquetarios es aún desconocido, aunque Sakurai et al.(24) proponen dos hipótesis que explicarían la acción de la Kanamicina sobre los agregados.
Como alternativa factible económica y sencilla, se propone el uso de la Kanamicina para el diagnóstico diferencial de la PTCP-EDTA dependiente. Sin embargo su uso no excluye la posibilidad de que se continúe obviando en algunos pacientes este artefacto de laboratorio; queda de parte del personal del laboratorio el reconocer a tiempo y aplicar las alternativas que tenga a su alcance para elaborar un correcto contaje plaquetario.
En este estudio se propone un método alternativo para detectar la PTCP-EDTA dependiente y como realizar un correcto contaje plaquetario en estos casos.
]]>PROTOCOLO PARA DETECTAR CASOS DE PSEUDOTROMBOCITOPENIA EDTA DEPENDIENTE
En la rutina diaria del laboratorio clínico, al observar contajes plaquetarios por debajo del rango de referencia se debe revisar el extendido sanguíneo, y si éste no se corresponde con el número de plaquetas arrojadas por el equipo y además se observaron agregados plaquetarios, sugerimos citar nuevamente al paciente, para extender el estudio y descartar una PTCP-EDTA dependiente.
Procedimiento
Tomar tres muestras de sangre venosa con anticoagulante EDTA y mantener las siguientes condiciones:
• El tubo N° 1 dejar a temperatura ambiente.
• El tubo N° 2 dejar a 37°C. inmediatamente después de extraída la muestra.
]]> • El tubo N° 3 se suplementará con Kanamicina (20 mg/ml de sangre) inmediatamente después de extraída la muestra.Analizar cada una de estas muestras en el autoanalizador hematológico, cada 10 minutos durante una hora.
Tomar muestra capilar para realizar contaje de referencia, Unopette (Brecher-Cronkite).
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