B Alfonzo1, E Lozada 1, M Correnti 2, ME Cavazza 3, P Michelli 4 y N Salma 2.
1 Organización de Bienestar Estudiantil. Universidad Central de Venezuela.
2 Instituto de Oncología y Hematología. Ministerio de Salud y Desarrollo Social.
3Instituto de Biomedicina. Ministerio de Salud y Desarrollo Social-Universidad Central de Venezuela.
4 Cátedra de Anatomía Patologíca. Escuela de Medicina Luis Razetti. Universidad Central de Venezuela.
RESUMEN: Se hizo detección y tipificación del VPH en 102 estudiantes universitarias que tenían citología o biopsia con cambios relacionados con el virus, mediante la técnica de Reacción en cadena de la polimerasa (RCP) e hibridación. La positividad viral hallada fue del 63,7% con 76,9% de tipos de alto riesgo oncogénico. Un 9,2% de la población presentó infección mixta de alto y bajo riesgo. En el 18,5% de las muestras positivas el tipo de VPH fue indeterminado. Los cambios histológicos por VPH sin atípias se hallaron en el 45%, NIC I en el 20,6%, NIC II en el 5,9%, NIC III en el 1%. A mayor grado histológico se encontró un aumento de muestras positivas para el virus; en cambios sugestivos por VPH fue de 47,8%, en NIC I 80,9%, en NIC II 83,3% y en NIC III 100%; la misma relación se halló con los porcentajes de genotipos de alto riesgo: cambios sugestivos por VPH 34,7%; NIC I 57,1%; NIC II 100%, NIC III 100%. La presencia del virus se observó incrementada en los grupos etareos de mayor edad y también con el mayor número de parejas sexuales.
Palabras Clave: Virus papiloma humano, Neoplasia intraepitelial cervical, RCP.
ABSTRACT: Detection and typification of HPV in 102 female University students with cytological or biopsy changes related to the virus was made by PCR and hybridization. Viral positivity was 63.7% with 76.9% of high oncogenic risk types. Mixed high and low risk types were found in 9.2%. In 18.5% of positive samples, the type was undetermined. Histology of HPV changes without atipias was found in 45% samples, CIN I in 20.6%, CIN II in 5.9%, CIN III in 1%. Viral positivity increases with the histological grade, it was 47.8% in HPV changes, 80.9% in CIN I, 83.3% in CIN II, 100% in CIN III; the same was seen with the high risk types percents: HPV suggestive changes 34.7%, CIN I 57,1%, CIN II 100%, CIN III 100%. Viral positivity was higher at the older age group of patients, the same was found in relation whit the number of sexual partners.
Key Words: Human papillomavirus, Cervical intraepithelial neoplasia, PCR.
]]> INTRODUCCIÓNLa infección por el virus papiloma humano (VPH) es la enfermedad de transmisión sexual más común. Según estudios en países desarrollados el 50% de las mujeres tienen anticuerpos como índice de infección pasada y un 15% presentan evidencia molecular de la presencia del virus(1). Su papel oncogénico se ha establecido sobre todo en relación con el cáncer del cuello uterino(2,3), una patología con elevada frecuencia mundial, mayor aun en los países en vías de desarrollo(4,5,6,7). En Venezuela, el cáncer del cuello uterino ocupa la primera causa de muerte por cáncer en mujeres(8), y se encuentra una fuerte asociación con la presencia de VPH(9,10). Existen más de 100 tipos del virus según la secuencia de su genoma, 45 de ellos se han hallado infectando el tracto genital(11). Los genotipos de alto e intermedio riesgo oncogénico son 14 tipos: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68, capaces de producir lesiones neoplásicas intraepiteliales cervicales (NIC) potencialmente invasivas(12). Los 6 tipos de bajo riesgo 6,11,40,42,43 y 44, producen solo cambios benignos. Las lesiones cervicales intraepiteliales causadas por el VPH según el Sistema de Bethesda de acuerdo al grado de atípias(13), se han clasificado desde Cambios sugestivos de infección por VPH y NIC I, que se consideran lesiones intraepiteliales de bajo grado (LIE-Bg), hasta NIC II y NIC III consideradas de alto grado (LIE-Ag). La infección genital por el VPH es más frecuente en la población de edad joven(14). El objetivo de este trabajo fue detectar y tipificar el virus papiloma humano en estudiantes universitarias que acudieron a la consulta ginecológica del servicio médico de la Organización de Bienestar Estudiantil de la Universidad Central de Venezuela (OBE), para determinar su presencia, los genotipos de riesgo oncogénico y su relación con las lesiones halladas al examen clínico y cito-histológico. El estudio viral se hizo mediante la técnica de la reacción en cadena de polimerasa (RCP)(15), determinándose los tipos virales mediante hibridación molecular.
POBLACIÓN Y MÉTODO
Pacientes
Se seleccionaron 102 pacientes, por tener citología o biopsia sugestiva de cambios relacionados con el VPH, las cuales asistieron a OBE, durante la segunda mitad del año 1997 y la primera de 1998. Las muestras para el estudio molecular viral fueron tomadas con hisopo de dacrón y colocadas en medio de transporte (Viratype-Digene) a temperatura ambiente.
Estudio anatomopatológico
Las citologías se colorearon con Papanicolaou y las biopsias luego del procesamiento histológico usual, fueron coloreadas con H.E.
Estudio viral
El ADN fue extraído según se ha descrito, brevemente: luego de centrifugar por 5 min a 14000 rpm, se agregó Proteinasa K y Buffer de lísis e incubaron por 2-3 hrs a 55°C y despues a 100°C por 15 min para inactivar la proteinasa K. Las proteínas se precipitaron con cloroformo fenol-alcohol isoamílico y luego de centrifugar por 15 min a 14.000 rpm, se agregó cloroformo para eliminar el fenol. Se usó etanol al 100% y acetato de amonio 3 M, para precipitar el ADN, hidratándose luego con etanol al 75%. La concentración del ADN se determinó en un espectrómetro (Gene Quant Pharmacia)(16).
Desarrollo de la RCP
]]> Se utilizó un programa de 40 ciclos(17), en un termociclador PTC-100 (MJ Research inc): 94°C/5 min, 94°C/1min, 55°C/2 min, 72°C/3 min, 72°C/7 min. La mezcla de la reacción fue: dNTPs 200mM 0,8 ml; MgCl2 50mM 2,5 ml; Taq Polimerasa 0,5ml (2,5 U); nucleótidos iniciadores de la región común L1 viral MY09 y MY11B, biotinilados en el extremo 5’ (l ml, 50 pMol de cada uno); un control negativo interno de iniciadores de b-globina 0,8 ml; agua destilada 27,55 ml; aceite mineral 35 ml y buffer 10x, 6,25 ml. El producto de la amplificación fue analizado por electroforésis en gel de agarosa al 2%, teñido con bromuro de etidio y visualizado con un transiluminador mediante luz ultravioleta para su registro fotográfico.Hibridación molecular en placas (Sistema Sharp signal de Digene)
Cada una de las alícuotas del producto amplificado y biotinilado en el extremo 5‘ se hibridó con una mezcla de sondas RNA específicas para dos grupos de tipos virales. La mezcla de sondas de tipos de alto riesgo oncogénico: 16, 18, 31, 33, 45, 51, 52, 53, 56 y 58 y de bajo riesgo: 6, 11, 42, 43, 44. El híbrido resultante ADN/ARN biotinilado, se capturó en placas de polivinilestireno, cubiertas con estreptoavidina. Posteriormente se colocaron 100 ml de anticuerpo anti-híbrido ADN/ARN conjugado con fosfatasa alcalina y se detectó por una reacción colorimétrica con el sustrato adecuado. La intensidad del color generado fue proporcional a la cantidad de producto biotinilado, el cual fue medido en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 450 nm.
Análisis estadístico
El análisis descriptivo para cada una de las variantes estudiadas se estableció a través de porcentajes y frecuencias, debido a que las variables son cualitativas y su nivel de medición es nominal u ordinal. Así mismo se aplicaron medidas de asociación para variables correspondientes. Se aplicó la prueba de Chi-cuadrado para todas las combinaciones de las variables consideradas.
RESULTADOS
Detección y tipificación del VPH
Se observó infección por el VPH en el 63,7% (65/102) de los casos (Gráfico 1) de los cuales el 67,7% (44/65) resultaron de tipo de alto riesgo oncogénico (AR); el 4,6% (3/65) fueron de bajo riesgo (BR); el 9,2% (6/65) presentaron infección mixta con tipos de alto y bajo riesgo oncogénico (MIX); el 18,5% (12/65) fueron positivos para el genoma viral pero no hibridaron con ninguna de las sondas incluidas en las mezclas de hibridación, estos casos se catalogaron de genotipo indeterminado (IND), (Gráfico 2).
Diagnóstico histopatológico
El aspecto morfológico de cambios sugestivos de infección por VPH se halló en el 45% (46/102) de las muestras cervicales evaluadas; NIC I en el 20,6% (21/102); NIC II en el 5,9% (6/102) y NIC III en el 0,9% (1/102). En vulva se presentaron las siguientes lesiones: Condiloma vulvar (CV) en el 25,5% (26/102) y Neoplasia intraepitelial vulvar I (NIV I) en el 1,9% (2/102), (Gráfico 3).
Asociación entre el diagnóstico histopatológico y la infección por VPH
Se detectó la presencia del genoma viral en el 47,8% (22/46) de los pacientes con la lesión Cambios sugestivos de infección por VPH, cuya tipificación mostró 72,7% (16/22) de AR oncogénico; 4,5% (1/22) fueron de tipo de BR (1/22); 4,5% (1/22) MIX y 18,2% (4/22) IND. Los pacientes con diagnóstico de NIC I presentaron VPH en el 80,9% (17/21) detectándose 70,6% (12/17) de AR, 5,9% (1/17) de BR y 23,5% (4/17) de tipo IND. El 83,3% (5/6) de las lesiones NIC II fueron positivos para VPH correspondiendo la tipificación al 100% (5/5) de AR oncogénico. El caso con NIC III resultó positivo para genoma viral y la tipificación fue de AR (Gráfico 4). Existe una dependencia significativa entre la categoría de lesión cervical y la presencia viral, siendo las lesiones de alto grado histológico (NIC II y NIC III) más frecuentes en pacientes positivos para el virus (chi-cuadrado: 8,74; p<0,05).
Relación de la infección por VPH con la edad de las pacientes
El intervalo de edad del grupo estaba comprendida entre los 17 y los 35 años, siendo el promedio de 23,9 con una desviación estandart (± dS) de 4,2. El mayor número de pacientes (62,7%) se ubicó entre los 19 y 24 años (64/102). Con relación a la infección por VPH se encontró en las jóvenes con edad comprendida entre 17-19 años 50% (7/14) de positividad, en las de 20-24 años el VPH se presentó en el 66% (35/53); entre las de 25-29 años en el 61% (14/23), y entre los 30-35 años el 75% (9/12), (Gráfico 5). Con respecto al tipo oncogénico se observó la presencia de virus de AR en un 85,7% (6/7) en el grupo de edad de 17-19 años; en el de 20-24 años: 74,3% (26/35); 25-29 años: 50% (7/14) y 30-35 años: 55,6% (5/9). El Chi-cuadrado de la relación entre edad y virus de alto riesgo fue de p>0.250.
En relación con la edad y el aspecto histológico se observó el mayor porcentaje de LIE-Bg en el grupo de edad de 17-19 años: 66,7% (8/12), mientras que solo 1 caso el 8,3% (1/12) resultó LIE-Ag. En el grupo de edad de 20-24 años el 92,1% (35/38) presentó LIE-Bg y el 7,9% (3/38) correspondió a LIE-Ag. Entre los 25-29 años de edad el 89,5% (17/19) resultó LIE-Bg y 10,5% (2/19) LIE-Ag; en la edad comprendida entre 30-35 años el 87,5% (7/8) fue LIE-Bg y en el 12,5% (1/8) se observó LIE-Ag.
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Relación de la infección por VPH con el número de parejas sexuales
La edad promedio de las primeras relaciones sexuales fue de 19,7 años. El número promedio de parejas sexuales fue de 1,7. La relación entre el número de las parejas y la presencia del genoma viral mostró: Pacientes con 1 pareja: 54,9% (28/51) con infección viral ; con 2 parejas: 73,5% (25/34); con más de 3 parejas 85,7% (12/14), (Gráfico 6).
Asociación del tipo oncogénico con el número de parejas, se observó: Con 1 pareja: 89,5% (17/19) VPH de AR, 10,5% (2/19) de VPH de BR; con 2 parejas 95,2% (20/21) de VPH de AR, 4,8% (1/21) de VPH de BR; con más de 3 parejas 100% (7/7) de VPH de AR, (Gráfico 7). El chi-cuadrado de la relación entre número de parejas y virus de alto riesgo fue de p>0,500.
DISCUSIÓN
En nuestro estudio se determinó una alta prevalencia de infección por VPH (63,7%) en jóvenes de la población femenina estudiantil universitaria sexualmente activa, predominando los tipos de VPH de alto riesgo oncogénico con un total de 76,9% con respecto a un total de 13,8% correspondiente a los de bajo riesgo (incluyendo los de alto, bajo riesgo y las infecciones mixtas de ambos), (p<0,001). Debido al carácter oncogénico de los tipos virales involucrados y la edad juvenil de la población estudiada, la infección constituye un factor de riesgo potencial en la progresión posterior de las alteraciones hacia mayores grados de atipicidad y malignidad(18,19,20).
En el diagnóstico histopatológico de las lesiones cervicales (74/102) se observó que el 62,1% (46/74) presentaban la lesión de Cambios sugestivos de infección por VPH, cabe destacar que el análisis molecular indicó que solo 22/46 (47,8%) de estos casos presentaron genoma viral, encontrándose según esto un sobre-diagnóstico en la apreciación histológica en esta clase de alteración. El 28,3% (21/74) resultaron NIC I, representando junto con las de Cambios sugestivos de infección por VPH, un total de 90,5% (67/74) de lesiones de bajo grado histológico. Se halló un 8,1% (6/74) de casos NIC II y un caso NIC III o sea el 1,3% (1/74), lo que corresponde a un total de lesiones de alto grado de 9,46%. Se encontraron además casos de lesiones del área vulvar constituidas por un 27,4% (28/102) de las cuales el 92,85% (26/28) resultaron condilomas y un 7,1% NIV I (2/28); siendo ambas lesiones de bajo grado histológico.
Al analizar la asociación entre la infección por VPH y las lesiones presentes se observó que el 77,2% (17/22) de las pacientes con lesión de cambios sugestivos de infección por VPH presentaron virus de AR y el 9,09% (2/22) de BR. En las lesiones diagnosticadas como NIC I el 70,5% (12/17) correspondió a tipos de alto riesgo y solo el 5,8% (1/17) fueron de bajo riesgo. Con respecto a las lesiones de alto grado en el 100% (6/6) se detectó virus de alto riesgo oncogénico.
]]> La distribución de los diferentes tipos virales en las lesiones intraepiteliales escamosas, es distinta según las lesiones de bajo grado o alto grado que se presenten. Así en las lesiones de alto grado se observó el 100% de pacientes con virus de alto riesgo oncogénico, mientras que en las de bajo grado la distribución fue más heterogénea. Los resultados indican que existe una dependencia significativa entre las lesiones de alto grado histológico (NIC II y NIC III) y la positividad para el VPH (Chi-cuadrado: 8,74; p<0,05).En cuanto a la edad de las pacientes y su relación con la infección por el VPH, se observó que a medida que aumentó la edad de la población estudiada, se detectó un mayor porcentaje de pacientes positivas para el VPH (Gráfico 5) y mayor presencia de tipos de alto riesgo. El análisis estadístico sin embargo, no mostró que los resultados sean significativos, así para la relación entre edad y positividad viral el valor de chi cuadrado fue p>0.250. Hay que observar que la disminución del número de pacientes en los grupos de edades mayores, afecta el análisis estadístico.
Con relación al número de parejas sexuales se apreció en los grupos de pacientes que habían tenido más parejas, igualmente una aparente tendencia a presentar mayor número de muestras positivas para el virus (Gráfico 6). Con el mayor número de parejas se halló un porcentaje mayor de virus de alto riesgo oncogénico, en comparación con los de bajo riesgo (Gráfico 7). Estadísticamente estos resultados no se pueden considerar significativos, ya que por ejemplo para la relación entre número de parejas y positividad viral el valor de chi cuadrado fue de p>0,500. La disminución de casos en los grupos de mayor número de parejas afecta aquí también el análisis estadístico. En la correlación del número de parejas con el tipo histológico de lesión cervical presente, no se aprecia una proporción definida entre el hallazgo de lesiones más atípicas con el mayor número de parejas, sin embargo el único caso NIC III fue en una paciente que refería haber tenido tres parejas.
Comparando los resultados de prevalencia de la infección hallada en esta investigación, vemos que fue mayor que la observada en trabajo similar de la literatura internacional realizado en estudiantes universitarias (63,7% vs 46%)(14); mientras que la proporción de tipos de alto riesgo es equiparable a la de otras experiencias realizadas con otras series de pacientes de diferentes edades(21,22). En cuanto a trabajos hechos en el país, se citan valores de positividad para el virus que van desde 9,9%, a 65,22%, presentando proporciones variables de tipos de alto riesgo de entre 25,6% y 70%(23,24,25).
En conclusión, los hallazgos epidemiológicos obtenidos en el grupo estudiado de alta prevalencia de la infección y de los tipos asociados a cáncer, hace necesario que se divulge la importancia del problema para su prevención, comenzando con campañas de información, despistaje ginecológico y citológico con toma de biopsia, además de detección viral en algunos casos. También es conveniente realizar el estudio y tratamiento de la infección genital en los pacientes masculinos. Finalmente, aunque es mucho lo que se ha avanzado en la comprensión de los mecanismos oncogénicos básicos del VPH(26,27), hay que promover más su investigación con miras a lograr medidas terapéuticas y preventivas incluyendo el desarrollo de métodos de vacunación.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue realizado con financiamiento del CDCH-UCV, proyecto 09.10.4101.98
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