DESINTEGRINAS EN VENENO DE SERPIENTES: UN NUEVO ENFOQUE EN EL TRATAMIENTO DE LAS ENFERMEDADES CARDIOVASCULARES, CÁNCER, DIÁBETES
EE Sánchez1,².
¹ Natural Toxins Research Center (NTRC), Texas A&M University-Kingsville, Kingsville, TX78363, USA.-
² Immunochemistry Section of the Tropical Medicine Institute,Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela. E-mail: rodriguf@ucv.ve
RESUMEN: Las Integrinas median la adhesión de células a matriz extracelulares, o a células-células a través de ligandos. La adherencia célula a célula puede ser una agregación homotipica de células semejantes o una agregación heterotípica de diversos tipos celulares. Se plantea, que la función de las integrinas implica mucho más que la adherencia celular. Las Integrinas están implicadas en la transducción, la cual desempeña un papel importante en muchos procesos fisiológicos tales como el desarrollo embrionario, diferenciación, migración de la célula, actividades curativas de la inflamación, la coagulación y la tumorigénesis.
Las serpientes de la familia Viperidae tienen una clase de proteínas de bajo peso molecular llamadas desintegrinas, en sus venenos. Estas moléculas han mostrado ser inhibidores potentes de la unión del fibrinógeno a las plaquetas activadas. Se ha demostrado que las desintegrinas se pueden unir a los receptores de las integrinas en las plaquetas y otros tejidos, por ello, podrían tener aplicación potencial en medicina. Las desintegrinas tienen una homología notable con la secuencia y selectividad en sus interacciones con los receptores de las integrinas celulares.
Palabras Clave: Desintegrinas, Integrinas, Serpientes Viperidae, Venenos.
ABSTRACT: Integrins mediate cells adhesion to extracellular matrix, or cells to cells through ligands. The cell adherence can be a homotypic aggregation of similar cells or a hetrotypic aggregation of various cellular types. It is outlined, that the function of the integrins implies much more that the cellular adherence. Integrins are implied in transduction, which plays an important role in many physiological processes such as the embryonic development, differentiation, cellular migration, curative activities of the inflammation, coagulation and tumorigenesis.
Snakes of the Viperidae family have a class of proteins of low molecular weight called disintegrins in their venoms. These molecules have shown be potent inhibitors of the fibrinogen attachment to the platelets. It has been demonstrated that the disintegrins can recognize integrins receptors on platelets and other tissues. Therefore, they could have potential applications in medicine. Disintegrins have a high homology with the sequence and selectivity in their interactions with integrin receptors on cells.
]]> Key Words: Disintegrins, Integrins, Viperidae Snakes, Venoms.Fecha de Recepción: 03/03/2004 Fecha de Aprobación: 13/04/2004
Introducción
El asesino número uno en América es la enfermedad cardiovascular. En 1991, el corazón y las enfermedades vasculares fueron causa de muerte de más de 923.000 norteamericanos. En el resto del mundo, dos de cada cinco personas sufren de enfermedad cardiovascular, con más de 2.500 muriendo de ella cada día. Los accidentes vásculo- cerebrales son la tercera causa de muerte, alineada detrás de las enfermedades del corazón y de todas las formas de cáncer. Los ataques cerebrales matan cerca de 150.000 personas cada año y son la causa principal de incapacidad del adulto, a largo plazo en los Estados Unidos, con cifras muy similares en Latinoamérica(1).
Las serpientes de la familia Viperidae tienen una clase de proteínas de bajo peso molecular llamadas desintegrinas, en sus venenos. Estas moléculas han mostrado ser inhibidores potentes de la unión del fibrinógeno a las plaquetas activadas.
Se ha demostrado que las desintegrinas se pueden unir a los receptores de las integrinas en las plaquetas y por ello, podrían tener aplicación potencial en medicina(2-4). Las desintegrinas tienen una homología notable con la secuencia y selectividad en sus interacciones con los receptores de las integrinas celulares.
Las desintegrinas son moléculas de bajo peso molecular, altas en cisteína y contienen una secuencia RGD (arg, gly, y asp o Arg-Gly-Asp) que actúen como antagonistas de agregación plaquetaria. Estos péptidos se llaman «desintegrinas» porque bloquean la interacción de ligandos adhesivos a los receptores de las integrinas en las células(5). Muchas desintegrinas encontradas en venenos de serpiente son capaces de unirse a las integrinas y de interferir con la función de dicha integrina.
En veneno de serpiente se han aislado y caracterizado alrededor de 60 desintegrinas(1,2,6-12). Generalmente, las desintegrinas contienen una secuencia de RGD en su sitio activo de unión a la cadena β de integrinas. Algunas desintegrinas tienen un sitio obligatorio KGD, MLD, y VGD que contiene una conformación en rizo, apropiada para los puentes disulfuro. Un ejemplo es la desintegrina ebarbourin que tiene un sitio KGD y es un antagonista específico para αIIbβ3(8).
Las desintegrinas se pueden dividir en tres categorías según su tamaño (5 a 9kD). Las desintegrinas de cadena corta, contienen 47 a 51 aminoácidos y cuatro puentes disulfuro; las cadenas medianas contienen 68 a 75 aminoácidos y seis aminoácidos encadenados al puente disulfuro; y los largos contienen 83 a 84 aminoácidos y siete puentes disulfuro(13). Las desintegrinas muestran homología con otras desintegrinas en el arreglo de las cisteínas. Las alineaciones de cisteinas en estos péptidos, son probablemente de una gran significación en su unión a las integrinas, puesto que la actividad de las desintegrinas desaparece después de la unión. Así, la secuencia RGD y los puentes disulfuro parecen ser críticos para la alta afinidad de unión de las desintegrinas a los receptores.
Inicialmente se pensó que las desintegrinas eran inhibidoras de la agregación plaquetaria, bloqueando las integrinas en la superficie de las plaquetas. Sin embargo, se sabe ahora que las desintegrinas se unen a las integrinas en la superficie de muchos tipos de células, incluyendo las células tumorales.
]]> Los estudios in vivo han mostrado que las desintegrinas son eficaces y de utilidad en los desórdenes cardio vasculares, sin efecto perjudicial sobre el paciente(14-16).La capacidad de los venenos de serpiente de causar sangramiento ha conducido a los investigadores a descubrir las proteínas que actúan recíprocamente con la cascada de la coagulación. Teng y Huang, 1991(7) dividieron las actividades biológicas de los venenos de la serpiente en las que aceleran la hemostasis y las que inhiben el proceso de coagulación. La aceleración de la hemostasis incluye los inductores de la agregación de la plaqueta, activadores del factor X, activadores de la protrombina y la trombina. Las proteínas del veneno que inhiben la hemostasis incluyen las enzimas fibrinogenoliticas, el inhibidor que activa la protrombina, inhibidores que activan del factor X, y los inhibidores de la agregación de la plaqueta.
Se han identificado las proteínas del veneno de serpiente que modulan selectivamente la agregación que promueve o que inhibe la función de la plaqueta, de la plaqueta apuntando al GP Ib-IX-V, y GP VI. La glicoproteína αIIbβ3 es una integrina capaz de servir de camino común final que conduce a la agregación de la plaqueta; por lo tanto, el bloqueo de ésta integrina conduce a la inhibición de la agregación plaquetaria sin importar el agente que lo estimula(17). Muchas de las proteínas del veneno de serpiente que afectan la función de la plaqueta son isoformas o derivados que pertenecen a uno de las dos familias importantes de la proteína, de la familia de la lectina del tipo-C y de los metaloproteínas-desintegrinas(12).
Dennis, et al (1989)(6), ha analizado varias desintegrinas del veneno serpentin (kistrin, bitan, tres isoformas de trigramin y una isoforma de echistatin) que inhiben la agregación plaquetaria. La concentración de inhibición 50 (IC50) fue determinada usando éstas desintegrinas del veneno de serpiente y el peptido GRGDS, miembro de los péptidos que contienen RGD que se une a la integrina αIIbβ3, midiendo su capacidad de inhibir la agregación de plaquetas humanas. El valor IC50 en este estudio es la concentración necesaria para inhibir la agregación total de la plaqueta en plasma rico en plaquetas a 50% de la agregación del control. Los valores IC50 para el kistrin eran 2.7 nM, kistrin oxidado 2.4 nM, kistrin reducido > 1500 nM, bitan 1.8 nM, trigramin 3.0 nM, la trigramin-a2 2.3 nM, 2.2 nM trigramin-y, echistain-a2 2.7 nM y GRGDS 205 nM. Los valores IC50 para la inhibición de la agregación plaquetaria que usaba plasma rico en plaquetas humanas, estimulado con el ADP, se extendieron a partir de 110 nM a 550 nM para estas mismas desintegrinas. Estas desintegrinas eran 1000 veces más potentes que el péptido de GRGDS (225,000 nM). Los péptidos sintetizados de RGDS han mostrado que para inhibir el fibrinógeno se une a los receptores asociados a la integrina aIIbb3.
Las concentraciones de estos péptidos necesitaron inhibir el rango de la agregación de la plaqueta a partir de 10 a 200 µM. Las desintegrinas del veneno son cerca de 500-2.000 veces más potentes en el bloqueo de la interacción plaqueta-fibrinógeno y de la agregación fibrinógeno-dependiente de la plaqueta que los péptidos sintetizados(18).
Desintegrinas y Cáncer
Cáncer es la segunda causa de muerte en Venezuela. En Estados Unidos, este año cerca de 552.200 americanos son diagnosticados de cáncer, más de 1.500 personas al día. Casi cinco millones de vidas se han perdido por cáncer desde 1990(19).
Las desintegrinas se están utilizando como antagonista de las integrinas en el estudio de la biología y angiogenesis del tumor maligno(20-22). Cuatro desintegrinas, eristostatina, albolabrina, barbourina y echistatina del veneno de serpiente inhibieron la formación de metastasis experimentales del pulmón, cuando se inyectaban intravenosamente en ratones C57BL/6, conjuntamente con las células murinas del melanoma B16F10(20). La eristostatina era el inhibidor más potente de la colonización del pulmón (la dosis de desintegrina que causa el 50% de inhibición de los metastasis (ID50) = 0.05 µM), seguida por la barbourina (0.09 µM), la albolabrina (1.0 µM) y la echistatina (3.7 µM).
Cuando eran inyectadas 1 hora después de las células tumorales, albolabrina, echistatina y barbourina tenían la misma actividad antimetastásica, mientras que, la eristostatina no era eficaz. La eristostatina era eficaz solamente cuando se inyectaba junto con las células del melanoma. La eristostatina (IC50 = 7-8 nM) era más eficaz que la echistatina (74-75 nM), la barbourina (46-60 nM) y la albolabrina (130-165 nM) como inhibidor de la agregación plaquetaria murina o del tumor, inducida por ADP. El antisuero policlonal contra integrinas del hámster incluyendo la subunidad a1 (anti-GP140) inhibió totalmente la adherencia de la célula a la echistatina y causó la inhibición del 70% de la adherencia a la albolabrina.
Una desintegrina homodimerica, contortrostatina, inhibe la agregación de la plaqueta y la adherencia de la célula a las proteínas extracelulares de la matriz bloqueando integrinas. Ritter & Markland (2000)(21), identifican a la contortrostatina como un reactivo útil para el estudio de la función de la integrina avb3, e identifica un mecanismo mediado por integrina que inhibe el movimiento de la célula tumoral. La contortrostatina inhibió el movimiento de la célula tumoral más potentemente que la desintegrina monomerica flavoridina, la cual fue agregada en concentración doble, para igualar el número de sitios de RGD de integrinas presentes. Este estudio sugirió que actividad adicional que posee la contortrostatina no estaba presente en desintegrinas monovalentes. Zhou et al., 2000(24) demostraron que la contortrostatina se une a las integrinas y bloquea la adherencia de las células humanas del cáncer de mama (MDA-MB-425), a las proteínas extracelulares de la matriz (ECM), incluyendo fibronectina, y vitronectina, pero no tenían ningún efecto en la adherencia de las células a la laminina y al Matrigel. La contortrostatina también previno la invasión de las células MDA-MB-435 a través de la membrana artificial del Matrigel. En este estudio, las inyecciones locales diarias de la contortrostatina (5 µg/ratón/día) inhibieron 74% del crecimiento del tumor MDA-MB-435 en un modelo de ratón desnudo. Esta desintegrina redujo el 68% del número de metastasis pulmonares del cáncer de mama, y del 62.4% de las micro-metastasis. La contortrostatina no fue citotóxica para las células de cáncer, y no inhibió la proliferación de la célula del cáncer de mama in vitro. La contortrostatina inhibió la angiogenesis inducida por el cáncer de mama. Otra desintegrina (salmosina), aislada del veneno de la serpiente coreana (Agkistrodon hayls brevicaudus) inhibió el crecimiento sólido de tumores en ratones(25).
]]> La actividad antimetastatica de la salmosina resultó del bloqueo de la adherencia mediada por integrina y la αvβ3 integrina medió la proliferación de las células de melanoma. Una salmosina recombinante expresada en E. coli que contenía la secuencia RGD inhibió la adherencia de la célula del melanoma a las proteínas extracelulares de la matriz, así como la invasión de la célula del melanoma B16F10 a través del filtro revestido de Matrigel.Desintegrinas en la diabetes
Una desintegrina heterodimerica (EC3) aislada de Echis carinatus suchoreki suprimió el desarrollo de la insulinitis y del sialoadenitis(26). Los ratones diabéticos sin obesidad, desarrollan espontáneamente la infiltración linfática relativa de los islotes de Langerhans y de las glándulas salivales, que se asemeja a la alteración patológica en páncreas humano, en el curso de diabetes tipo 1 y en glándulas salivales durante el desarrollo del síndrome de Sjogren. Los T-linfocitos de estos animales parecen prevalentamente estar implicados en la infiltración. Los T-linfocitos esplénicos pueden transferir la diabetes en ratones sin diabetes(27). Brando et al. (2000)(26) mostraron que EC3 compite con los anticuerpos monoclonales que reconocen las integrinas α4 y β7. EC3 también bloquea la agregación de las células de Jurkat y de los linfocitos esplénicos murinos al VCAM-1.
Desintegrinas en pérdida del hueso
El receptor de vitronectina, integrina αvβ3, se expresa altamente en los osteoclastos, las células que reabsorben el hueso(28). Estos receptores en la superficie de la célula del osteoclasto, desempeñan un papel importante en la conexión de los osteoclastos a la superficie de la resorción. Los osteoclastos son células multinucleadas de 400 µm de diámetro, de origen hemopoyetico, que absorben el hueso, uniéndose a la superficie del hueso, vía una estructura altamente especializada y polarizada. Las enzimas proteoliticas, los ácidos orgánicos y los protones, se secretan en un compartimiento sellado, formado entre la membrana de la célula y la matriz del hueso y el osteoclasto activado, donde se forma una laguna, un hueco, en la superficie del hueso(29,30). La integrina αvβ3 une muchas proteínas que contienen RGD incluyendo osteopontina, que es un ligando encontrado en hueso. La deficiencia del estrógeno causa la pérdida del hueso debido a una resorción osteoclastica creciente del hueso en los seres humanos y los animales de experimentación(31-33). Las desintegrinas del veneno tales como echistatina, kistrina y contortrostatina evidenciaron, que inhibian la resorción del hueso in vitro e in vivo.
La echistatina (una desintegrina derivada del veneno de E. carinatus) causa la contracción del osteoclasto, así como la inhibición de la formación del hueco en preparaciones de hueso(34). La echistatina sintetizada (s-echistatina), inhibió la excavación de las preparaciones de hueso por los osteoclastos de la rata. Otros tetrapeptidos (RGDS) inhibieron la resorción por los osteoclastos de la rata o del pollo con un IC50 de 0.1mM y una echistatina modificada (ala24-echistatina) no fue eficaz. Fisher et al. (1993)(35), fueron los primeros en demostrar in vivo que la echistatina inhibia la resorción del hueso en ratas tiroides-paratiroidectomizadas (TPTX). En este experimento, los efectos de las hormonas calciotropica endógena, la hormona paratiroides y la calcitonina, fueron eliminadas por la extracción quirúrgica de las glándulas tiroides y paratiroides.
Veinte horas después de TPTX y de ayunar, los niveles del calcio del suero cayeron a 50-70% de los niveles básicos, durante los cuales se inyectaron ratas anestesiadas con bPTH o la combinación de bPTH y de la s-echistatina. La infusión de bPTH dio lugar a un aumento en calcio del suero a los niveles de pre-TPTX dentro de 4-6 horas la s-echistatina y la combinación de bPTH bloquearon totalmente el ascenso del calcio sérico, inducida por la hormona. La inhibición de la s-echistatina del aumento del calcio sérico hueso-dependiente dependió de la dosis, donde 20 µg/kg/min inhibieron perceptiblemente el ascenso del calcio sérico, 6 µg/kg/min tenía un efecto inhibitorio intermedio y 2 µg/kg/min eran ineficaces.
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