EL PRODUCTO DE EXCRECIÓN DE SHIGELLA DYSENTERIAE INDUCE CARIÓLISIS Y CALCIFICACIÓN EN EL TEJIDO HEPÁTICO DE EMBRIÓN DE POLLO. "EX VIVO" E "IN VITRO".

Marco Alvarez¹, Gidalia Urbina², Claudia Müller¹, Lourdes Perdomo³, Andrés Ruiz. 

¹Sección de Microscopia Electrónica, Instituto Anatómico "José Izquierdo", Facultad de Medicina. UCV. 

²Cátedra de microbiología, Escuela de Bionálisis, Facultad de Medicina UCV. 

³Coordinación de Informática Médica. Facultad de Medicina. UCV.

Objetivos: el objetivo de este estudio fue caracterizar histológica y morfométricamente alteraciones "ex vivo" e "in vitro" del tejido hepático de embrión de pollo causadas por el producto de excreción de Shigella dysenteriae.

Métodos: el tejido hepático de embrión de pollo de 8 días de desarrollo, "ex vivo", y las células hepáticas cultivadas por la técnica de gota pendiente, "in vitro", fueron utilizados. Ambos sistemas fueron sumergidos en el producto de excreción obtenido a partir del sobrenadante del cultivo de la cepa Shigella dysenteriae tipo I. Tres controles fueron definidos: a) solución Tyrode, b) caldo de infusión de cerebro-corazón (CCC), c) producto de excreción no toxigénico de la bacteria E. coli O157:H7. Después de una hora de tratamiento los tejidos y las células fueron fijadas en formol zinc. Los hallazgos histológicos fueron obtenidos en cortes teñidos con hematoxilina eosina y Von Kossá. Para llevar a cabo el análisis morfométrico se hizo uso de técnicas de morfología microscópica de análisis de imágenes con el programa ImagenJ versión 1.36.

Resultados: el tejido hepático de embrión de pollo "ex vivo" tratado con el producto de excreción de Shigella dysenteriae mostró, respecto al control: la pérdida en el arreglo de las células endoteliales, núcleos con pérdida del contenido nuclear, espacios sinusoidales de mayor tamaño y presencia de fosfatos de calcio sobre la región de las células endoteliales que recubren a la vena central. Las células hepáticas tratadas "in vitro" mostraron: forma estrecha, abundancia de vesículas de lípidos de mayor tamaño, reducción significativa del número de pixels por área nuclear sobre la escala de grises entre 85 y 168 e incremento de la región de los blancos sobre la escala de grises 169-255, respecto al control CCC, evidenciado a través del histograma. Conclusiones: el producto de excreción de Shigella dysenteriae induce vaciado del contenido nuclear y deposición de fosfatos de calcio, lo cual se traduce en un fenómeno de cariólisis y formación de centros de calcificación respectivamente. Ambos fenómenos pudieran ser definidos como signos de hepatotoxicidad inducidos por el producto de excreción de Shigella dysenteriae.

Objective: The aim of this study was to characterize, histologicaly and morphometricaly the chick embryo hepatic tissue alteration caused by the action of excretion products of Shigella dysenteriae "ex vivo" and "in vitro".

Methods: Hepatic tissue of 8 day-old chick embrion development, "ex vivo", and hepatic cell culture "in vitro" in Hanging-drop techniques were used. Both systems were embedded in the excretion products of Shigella dysenteriae obtained from the supernatant of Shigella dysenteriae Type I. Three controls were defined: a) Tyrode solution, b) brain-heart broth infusion (CCC), c) supernatant of E. coli 0157:H7, not toxigenic. After 1 h of treatment, the tissue and cells were fixed in formol-zinc. Histological findings were obtained with hematoxylin eosin and Von Kossá staining. In order to carry out the morphometricaly examination, an imagen analysis in microscopic morphology techniques with ImagenJ 1.36 version was applied.

Results: The embryonic hepatic tissue treated, "ex vivo", with excretion products of Shigella dysenteriae show: a loss in the arrangement of the endothelial cells, sinusoidal space was more open, nucleus with loss of the nuclear content and presence of calcium phosphates on the endothelial cells that covered the central vein, with regard to controls groups. The hepatic cells treated "in vitro" showed: narrow forms, abundance of lipid vesicles of great size, significantly reduction of pixels per nuclear area on grey scale between 85-168 and increase of the white region on grey scale between 169-255, when compared to control groups.

Conclusions: The excretion products of Shigella dysenteriae induced karyolysis and calcified center formation. Both phenomena probably defined signs of excretion product of Shigella dysenteriae injury on embryonic hepatic tissue.

Key words: Excretion, Ehigella dysenteriae, Hepatic tissue, Karyolysis, Calcification, Chick embryo.

El enteropatógeno Shigella dysenteriae produce componentes estructurales durante su proceso de crecimiento y libera al medio exterior un producto que contiene una variedad de sustancias entre las cuales se destaca la exotoxina de tipo shiga (Stx)(1). La presencia de esta exotoxina en el producto de excreción explica, en parte, la acción patógena de este microorganismo porque promueve la inhibición de la síntesis de proteínas y severas complicaciones sobre varios órganos y tejidos del hospedador vertebrado; tales como: intestino, riñón, cerebro, endotelio e hígado(2). Particularmente el tejido hepático constituye un centro principal de captación de sustancias químicas y biológicas. Pese a estas características es poco lo que se conoce acerca de la acción de la exotoxina de tipo shiga producida por Shigella dysenteriae en este tejido, debido en parte a la carencia de modelos experimentales que expliquen la expresión tisular y celular de los daños producidos. Sin embargo, un estudio experimental en monos Rhesus Macaques tratados con extracto crudo de toxina de Shigella dysenteriae por vía intravenosa o en aerosol ha demostrado alteraciones cardiohepáticas(3). Cabe resaltar que como en todo proceso de daño tisular producido por agentes exógenos estos desencadenan una serie de eventos celulares entre los cuales se destacan: a) la condensación de la cromatina nuclear en forma de grumos o gruesos fragmentos adosados a la membrana nuclear y alrededor del nucléolo, así como la disolución del contenido nuclear, b) la acumulación de calcio sobre las membranas de tejidos adulto y fetal, ricas en fosfatidilserina, c) alteraciones en el contenido de inclusiones en el citoplasma, tales como excesivas vacuolas y gotas de lípidos (4,5). Si alguno de los eventos celulares como los antes descritos, constituyen una expresión de la acción tóxica del producto de excreción de Shigella dysenteriae sobre el tejido hepático, hasta donde conocemos no se encuentra claramente establecido. Siendo el tejido hepático un principal centro de captación de sustancias químicas, tanto endógenas como exógenas, cabría indagar entonces sobre las características nucleares de los hepatocitos y sobre la condición del ión Ca++ bajo la acción del producto de excreción de Shigella dysenteriae. El presente trabajo hace uso de preparaciones experimentales "ex vivo" e "in vitro" de tejido hepático de embrión de pollo de 8 días de desarrollo, así como técnicas de morfología microscópica para describir señales de daño tisular y celular inducidos por el producto de excreción del cultivo de Shigella dysenteriae.

Producto de excreción de Shigella dysenteriae:

El producto de excreción de Shigella dysenteriae utilizado fue obtenido a partir del sobrenadante del cultivo de la cepa de Shigella dysenteriae Tipo 1. La cepa fue sembrada en Agar-sangre e incubada a 37º C por 24 horas. Seguidamente fue inoculada en los medios diferenciales para la confirmación bioquímica del género. Para la determinación del serotipo se utilizó antisuero monovalente A1 (Marca FUVESIN). Posteriormente, varias colonias fueron seleccionadas y resuspendidas en caldo de infusión de cerebro-corazón (BIH, Difco), hasta alcanzar una densidad de 0,5 McFarland (1x 10⁸ células/mL). El cultivo fue incubado a 37º C durante 48 horas y posteriormente centrifugado a 4.000 r.p.m, a 4ºC durante 30 minutos. El sobrenadante fue filtrado con filtro milipore de 22 µm y distribuido en alícuotas de 1 mL para ser utilizados inmediatamente en los diferentes ensayos.

El embrión de 8 días de desarrollo fue expuesto mediante técnicas convencionales de manipulación embrionaria⁽⁶⁾. La preparación "ex vivo" consistió en obtener por disección, el órgano hepático embrionario localizado a nivel de la pared ventral del intestino y posterior a la porción gástrica. Las muestras fueron divididas en tres grupos de controles: a) Solución Tyrode, porque es un componente del cultivo celular; b) Medio de cultivo cerebro-corazón (CCC), pues es el medio de crecimiento de Shigella dysenteriae; c) Filtrado de la cepa E. coli O157:H7, porque representa un elemento no toxigénico debido a que en su producto de excreción no está presente la toxina shiga. Las del grupo tratado fueron expuestas directamente al filtrado de cultivo de Shigella dysenteriae serotipo A1 (tratamiento agudo). Todos los grupos fueron incubados durante 1 hora a temperatura de 37º C. Transcurrido el tiempo del tratamiento, las respectivas soluciones fueron removidas con solución Tyrode fresca y se procedió a cortar la región del lóbulo hepático derecho de mayor tamaño para ser fijado en solución formol-zinc durante dos horas. Un total de 30 muestras de tejido hepático por grupo, fueron procesadas para histología convencional con inclusión en bloques de parafina y cortadas en secciones de 5 µm y teñidas con hematoxilina eosina⁽⁷⁾. Con la finalidad de determinar la deposición de calcio en forma de fosfato de calcio, otra serie de cortes fueron sometidos a la reacción histoquímica de Von Kossá. Estos fueron colocados en una solución de nitrato de plata al 5 %, durante 30 minutos en oscuridad⁽⁸⁾.

Una vez extraído el órgano hepático del embrión de pollo de 8 días de desarrollo, la porción del lóbulo derecho fue seccionado en pequeños fragmentos de tejido de igual tamaño para los explantes. Estos fueron colocados en un medio compuesto por extracto embrionario y plasma de pollo adulto, en una proporción 1:1, en una cámara de intercambio gaseoso, sellados con parafina e incubados a 37º C durante 24 horas de acuerdo al método de cultivo de gota pendiente⁽⁹⁾. El sistema "in vitro" consistió en la obtención de hepatoblastos de 24 horas de cultivo a partir de los fragmentos hepáticos. Transcurrido este tiempo, aquellos cultivos que desarrollaron un área de crecimiento regular y homogéneo de hepatoblastos, fueron seleccionados y divididos en grupos controles (a) y tratados (b). Los del grupo control fueron clasificados de la misma manera que en el sistema "ex vivo" y los del grupo tratado fueron incubados directamente con el producto de excreción. Todos los grupos fueron incubados durante 1 hora a temperatura de 37º C. Transcurrido el tiempo de tratamiento, las muestras fueron fijadas con formol-zinc, teñidas con azul de toluidina 0,5 % y observadas en un microscopio NIKON.

Un equipo de análisis de imágenes para morfometría asistida por ordenador⁽¹⁰⁾, permitió determinar la apariencia del tejido hepático, control y tratado. Se realizó una descripción microscópica convencional sobre las imágenes digitalizadas obtenidas de cortes histológicos con histoquímica de hematoxilina eosina (H-E), de las distintas preparaciones "ex vivo". Para ello se procedió a: 1) transformar imágenes originales a escala de blanco y negro para determinar densidad del contenido nuclear de los hepatoblastos en función del número de píxeles en el histograma de grises de la imagen transformada. Sobre las imágenes se determinó la densidad del material cromogénico, circunscrito al área nuclear como una función i = f (x, y) entre los valores mínimos (negro) y máximo (blanco) que resulta equivalente a definir el valor de gris que posee cada píxel que conforma la imagen digitalizada. Los datos fueron obtenidos a partir del análisis de 200 células por tratamiento, y fueron representados por un histograma del valor medio y desviación estándar (x ± de), del número de píxeles en función de la escala de grises en el rango 1-255. Se aplicó el ANOVA para comparación de la media.

La región lobular derecha del tejido hepático embrionario control CCC, se representa con una porción de la placa hepática (Figura 1a), en donde se destacan espacios sinusoidales (cabeza de flecha), células endoteliales (flechas) y hepatocitos con núcleos redondeados de denso material nuclear y evidentes nucléolos. En contraste, la porción lobular hepática tratada con el producto de excreción de Shigella dysenteriae (Figura 1b), muestra ampliación del espacio sinusoidal (cabeza de flecha) con aparente ruptura de uniones entre las células endoteliales de recubrimiento y hepatocitos con pérdida o vaciado de contenido nuclear (flechas). Otro componente de la placa hepática como es la vena central (vc) se resalta en un corte histológico del control, teñido con la reacción de Von Kossá (Figura 1c), en donde no se observan precipitados de plata en la porción del endotelio que recubre dicha región (flecha). En contraste con el control, en el tratado con el producto de excreción de Shigella dysenteriae (Figura 1d) el precipitado de plata en la porción endotelial de la vena central (vc) resulta evidente (flecha). Cuantitativamente, el porcentaje de hepatocitos con pérdida o vaciado del contenido nuclear en el tejido hepático tratado con el producto de excreción de Shigella dysenteriae representa un 70,02 % con respecto a los distintos controles, entre los cuales no se observan diferencias significativas (Tabla 1).

Porción de la placa hepática del lóbulo derecho de embrión de pollo de 8 días de desarrollo, "ex vivo". Tinción hematocilina eosina (H-E). a) control caldo cerebro corazón (CCC). Se resalta nucléolos bien definidos, núcleos densos, espacios sinusoidales (cabeza de flecha) y células endoteliales de recubrimiento (flechas). b) Tratado con sobrenadante de Shigella dysenteriae, se resalta el desarreglo de la placa hepática, el desensamblaje de las células endoteliales, apertura de los espacios sinusoidales (cabeza e flecha) y presencia de núcleos con vaciado del contenido nuclear (flechas). La histoquímica de Von Kossá muestra diferencias en cuanto a la presencia de precipitados de plata entre el control (c) y el tratado (d), en la porción del endotelio que recubre la vena central (vc) de la placa hepática (flechas). Barra= 7,6 µm.

Porcentaje de hepatocitos con vaciado nuclear en tejido hepático de embrióm de pollo de 8 días de desarrollo "ex vivo. Controles y tratados. Pruebas de ANOVA

*P<0,05 N=200

CCC = caldo cerebro corazón

Tratados = sobrenadante de cultivo de Shigella tipo I Página

E. coli O157:H7 = producto de excreción de E. coli O157:H7

En el control CCC (Figura 2a), las células hepáticas embrionarias provenientes del explante se presentan como una capa confluente formada por hepatoblastos con núcleos visibles (n), de simple o doble nucléolos inmersos en material nuclear uniforme (Figura 2a'). El histograma (Figura 2a") muestra la distribución de las tonalidades de grises entre 0 y 255 de todos los pixels contenidos en el área nuclear. La mayor cantidad de pixels contenidos en el área nuclear de los hepatoblastos poseen valores en la escala de grises comprendida entre 85 y 168, y el resto se distribuye entre 0-84 (negros) y 169-228 (blancos). Cabe destacar que los valores comprendidos entre 228 y 255 no están presentes en el control (flecha). Las células hepáticas embrionarias provenientes del explante tratadas con el producto de excreción de Shigella dysenteriae (Figura 2b), a diferencia del control, se presentan también como una monocapa confluente de células con núcleos y nucléolos visibles (Figura 2b'), sin embargo, los núcleos presentan áreas de vaciado del contenido nuclear (flecha). Esto se traduce en el histograma (Figura 2b") como una reducción en el número de pixels que presentan valores de grises en la escala 85-168 (flecha) y un incremento en el rango de blancos correspondiente al intervalo 169-255. Cabe destacar que los valores comprendidos entre 228 y 255 están presentes en el tratado (flecha). Cuantitativamente los valores de densidad nuclear promedio se traducen en 30,86 pixels para el control y 18,90 pixels para el tratado en la escala de grises 85-168; y de 7,74 a 18,93 en la escala de blancos (Tabla 2), siendo estas diferencias estadísticamente significativas. Por otra parte las células ubicadas en la periferia del explante control CCC (Figura 2c) muestran gotas de lípidos (flechas); a diferencia de las tratadas que presentan citoplasma estrecho y gotas de lípido con mayor tamaño (Figura 2d, 2d’).

Registro fotográfico de la población de células provenientes de explante (ex) de thepático de embrión de pollo de 8 días de incubación, fijadas con formol-zinc y teñidas con azul de toluidina. a)Control caldo cerebro corazón (CCC). a') Población celular con nucléolos claramente definidos y núcleos prominentes (n). a'') Histograma. Representa la escala de grises para los pixels contenidos en el área nuclear, para un total de 20 células en 10 cultivos, N= 200. b) Tratado con sobrenadante de Shigella dysenteriae. b') Población celular con nucléolos bien definidos y núcleos prominentes con aspecto de vaciado nuclear (flecha). b'') Desplazamiento del histograma hacia la escala de grises correspondiente al rango de los blancos, respecto al control. Se destacan las características de células de la periferia control (c,c') y tratadas (d,d'). Las tratadas muestran un acentuado entrechamiento así como un aumento en el tamaño de las gotas de lípidos (flecha). Barra= 8,33 µm

Valores densitométricos del contenido nuclear en hepatoblastos "in vitro". Control y trato. Prueba de ANOVA

CCC= caldo cerebro corazón

Tratados= sobrenadante de cultivo de Shigella tipo I

De los resultados obtenidos en el presente trabajo, se resaltan dos aspectos importantes para la discusión sobre la expresión de los daños tisulares y celulares causados por el producto de excreción de Shigella dysenteriae en el tejido hepático embrionario "ex vivo" e "in vitro". Respecto a los daños tisulares se destacan: a) el vaciado del material nuclear de los hepatocitos y b) la presencia de precipitados de plata en la región del endotelio que recubre la vena central del tejido hepático embrionario. En relación con el vaciado del material nuclear cabe señalar que como en muchos procesos de daño celular causados por sustancias tóxicas⁽¹¹⁾, la cromatina sufre ataques enzimáticos disolviéndose completamente en etapas avanzadas del daño celular, debido a la acción combinada entre las enzimas proteolíticas y la desoxirribonucleasa⁽¹²⁾. Particularmente la toxina Shiga y otras proteínas con características similares presentan actividad RNA-nucleosidasa, lo que le permite la remoción de una adenina en posición 4324 del terminal 5’ en el ARN ribosomal 28S y de esta manera inhibir el enlace entre el amino-acil RNA de transferencia en la subunidad ribosomal 60S⁽¹³⁾. A pesar que el trabajo no muestra evidencia respecto a los marcadores nucleares antes referidos, si resulta evidente que el vaciado nuclear evaluado cualitativa y cuantitativamente en el presente trabajo, podría ser explicado como una fragmentación inespecífica del DNA que se traduciría en la atenuación de la cromatina o fenómeno de cariólisis. En cuanto a la presencia de fosfatos de calcio, evidenciados como precipitados de plata, cabe mencionar que la calcificación ha sido reconocida, en relación con los mecanismos de toxicidad celular^(14,15), como un proceso que resulta de la degradación celular en casos de lesiones tisulares irreversibles. Por otra parte, el producto de degradación celular sirve como centro de acumulación de los iones calcio sobre superficies de membranas ricas en fosfatidilserina y es responsable de la formación de complejos fosfatidil-serina-ion calcio extracelular⁽¹⁶⁾. Ni la formación de dichos complejos, ni la irreversibilidad del daño tisular se demuestran con nuestros resultados. Sin embargo, la demostración histoquímica de un proceso de calcificación inducido por el producto de excreción de Shigella dysenteriae, resulta evidente. Respecto a los daños celulares causados por el producto de excreción de Shigella dysenteriae, los resultados obtenidos "in vitro", corroboran, las ya discutidas, alteraciones nucleares obtenidas "ex vivo". Particularmente en las células tratadas con el producto de excreción de Shigella dysenteriae, el vaciado nuclear caracterizado morfométricamente por una pérdida de grises y una ganancia de blancos, se traducen en una reducción significativa de la densidad nuclear, reforzando así la hipótesis referida a que el exoproducto de este microorganismo pueda inducir cariólisis como posible mecanismo patogénico de su acción tóxica. También, hay que señalar que el producto tóxico bacteriano induce lesiones celulares que se traducen en cambios morfológicos⁽¹⁷⁾, y en la acumulación de algunas sustancias tales como lípidos, carbohidratos y proteínas como resultado de un desequilibrio metabólico. Particularmente, los cambios de forma han sido asociados con la actividad de la enzima 3’5’ ciclico-adenosin-monofosfato-fosfodiesterasa⁽¹⁸⁾. Por otra parte, la presencia de triglicéridos en forma de gotas citoplasmáticas, visibles al microscopio se considera en general un evento patológico que puede ser entendido como un desequilibrio entre el consumo y la degradación de estos lípidos. Es obvio que en nuestros resultados no fueron evaluados cambios cuantitativos en la actividad metabólica del tejido hepático embrionario tratado con el producto de excreción de Shigella dysenteriae. Sin embargo, resulta evidente el cambio cualitativo evidenciado a través de la modificación de la forma y el del contenido de lípidos en los hepatoblastos. Como conclusión la presente investigación destaca que tanto la cariólisis como la calcificación son eventos patológicos que pudieran contribuir a explicar posibles mecanismos involucrados en la acción tóxica de este importante agente enteropatógeno.

Recursos financieros provenientes del Proyecto CDCH Nº09-30-5409.2004.

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DIRECCIÓN

Dr. Marco Álvarez. Sección de Microscopia Electrónica, Instituto Anatómico "José Izquierdo", Facultad de Medicina, UCV. Telf: 0212-605-3439. Fax: 0212-605-3449. E-mail: alvarezm@ucv.ve. http://www.med.ucv.ve/IA/SecMicElec.htm