Felix Tejero 1, Susana Brun 1, Antonio Roschman Gonzalez 2, Elena Velasco 3, Pedro M Aso 4, Hector J Finol 2
1 Laboratorio de Biologia Funcional de los Kinetoplastida. Instituto de zoologia Tropical, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela.
2 Centro de Microscopia Electronica. Escuela de Biologia. Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela.
3 Laboratorio de Microscopia Electronica. Escuela de Medicina "Jose Maria Vargas". Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela.
4 Laboratorio de Bioquimica e Inmunologia de Hemoparasitos. Departamento de Biologia Celular, Universidad Simon Bolivar. Caracas. Correspondencia: Dr. Felix Tejero. Apartado 66291 Plaza Las Americas. Caracas 1061.Venezuela. Tlf. +58(212)6051647; email: felixtejero@gmail.com
RESUMEN
Infecciones murinas experimentales con un aislado venezolano de Trypanosoma evansi ocasionan cambios ma - cros copicos y ultraestructurales en el rinon de los ratones. La modificacion macroscopica se restringe a palidez progresiva del organo. Por su parte, las alteraciones ultraestructurales incluyen incremento del grosor de la membrana basal glomerular, asi como del espesor de la membrana basal de los tubulos contorneados proximales, cambios en la colocacion y el agrupamiento de las mitocondrias asociadas a la lamina basal, asi como extenso deterioro epitelial. Los tripanosomas intravasculares fueron detectados en la circulacion renal a partir de dia 9 post-infeccion. Se discute al respecto del dano glomerular, sugiriendo que las alteraciones submicroscopicas debilitarian la funcion tubular, contribuyendo mediante un proceso nefritico al desarrollo de una falla renal aguda que culminaria con la muerte del hospedador experimental. La significancia de los cambios ultraestructurales fue corroborada estadisticamente.
Palabras clave: Trypanosoma evansi, ultraestructura, rinon.
Renal ultrastructure in experimental murine infections with a Venezuelan isolate of Trypanosoma evansi
]]> SUMMARYMurine experimental inoculations with a Venezuelan isolate of Trypanosoma evansi cause macroscopic and ultrastructural changes in the kidney of the infected animals. The macroscopic modifications are restricted to the progressive paleness of the organ. By its part, the ultrastructural alterations include thickness enlargement of the glomerular basal and the proximal tubule basal membranes, changes in the mitochondrial grouping and layout close to the basal membrane, as well as extensive epithelial damage. Intra vascu - lar trypanosomes were seen in the renal circulation from day 9 post-infection and on. The glomerular injury is discussed, suggesting that submicroscopic alterations could weaken the tubular function contributing through a nephritic process with the development of an acute renal failure culminating in the experimental host¡¦s death. The significance of the sequential increasing ultrastructural changes was statistically corroborated.
Key words: Trypanosoma evansi, ultrastructure, kidney.
Recibido: 23 de septiembre de 2008 / Aprobado: 12 de diciembre de 2008
INTRODUCCIÓN
La tripanosomosis equina, denominada vernaculamente ¡§derrengadera¡¨ es una enfermedad significativa en Los Llanos venezolanos que se caracteriza por fiebre, anemia, edema, emaciacion progresiva y debilitamiento generalizado que culmina con la muerte del equino. La afeccion, por lo tanto, representa un menoscabo importante en la ganaderia bovina extensiva, ya que los caballos salvajes domesticados son empleados profusamente en dichas actividades.
T. evansi es un hemoflagelado que causa enfermedad en diversos hospedadores mamiferos. Si bien, dife - ren tes autores (1) (2) (3) (4) (5) explican algunos cam bios funcionales y estructurales ocasionados por el parasito, las descripciones de modificaciones ultraestructu rales de - sencadenadas por aislados venezolanos de T. evansi son insuficientes (6) (7) (8). En consecuencia, la patogenesis de la "derrengadera" local es poco conocida.
Este estudio explora la secuencia del proceso de cambio ultraestructural en las celulas renales de ratones infectados experimentalmente con un aislado venezolano de T. evansi.
MATERIALES Y MÉTODOS
Tres grupos de diez Mus musculus hembra NMRI de 20 gr de peso corporal cada uno, se inocularon en el estrato hipodermico profundo de la piel con 20 tripomastigotes contenidos en 100 ml de solucion salina isotonica esteril (0,85% NaCl + 1% glucosa). El aislado de T. evansi empleado, denominado MEQD/VE/99/Trino (9), se obtuvo de un Equus asinus infectado de manera na tural en el "Hato Terecay" (Estado Guarico, Vene zue la). Los integrantes del grupo control (diez Mus musculus hembra NMRI de 20 gr de peso corporal cada uno) se inyectaron del mismo modo con solucion salina isotonica esteril libre de parasitos. Los experimentos se repitieron tres veces.
]]> A partir del tercer dia post-infeccion e interdiariamente hasta la muerte de todos los animales infectados, se selecciono aleatoriamente un raton que se sacrifico en atmosfera de eter. Mediante ablacion quirurgica se extirpo el rinon izquierdo y se fracciono en porciones de 2mm3.Los controles se manejaron identicamente. La investigacion cumplio con las normas de cuidado y uso de animales de laboratorio (10).
Las muestras se fijaron con solucion de Karnovsky (2,5% glutaraldehido + 3,7% formaldehido) y tetroxido de osmio (1%) en solucion amortiguadora de Millonig (pH 7,4; 320 mOsm/l)(11). Inmediatamente despues los fragmentos se deshidrataron en bateria de etanol de concentraciones crecientes (50-100%), se infiltraron con resina LX-112-oxido de propileno (1:1) y se incluyeron en LX-112 pura durante 48 horas a 60oC. Los bloques de resina polimerizada se tallaron, se hicieron cortes ultrafinos (60 nm de espesor) y se contrastaron con acetato de uranilo (12) y citrato de plomo (13). Los cortes se observaron en un microscopio electronico de transmision Jeol JEM-1011 (80 kV); el registro permanente se hizo en negativos de 8,3 x 10,2 cm.
En cada rejilla de cobre (200 mesh) cubierta de colodion se escogio subjetivamente el area mejor coloreada y contrastada. La zona seleccionada se muestreo sistematicamente y se hicieron registros micrograficos permanentes. Los negativos se imprimieron en papel brillante y se digitalizaron. Sobre las imagenes digitalizadas se determinaron los grosores de la membrana basal glomerular (EMBG) y de los tubulos contorneados proximales (ETCP). Los datos numericos derivados se evaluaron mediante Analisis de la Varianza (ANOVA) y Regresion Lineal Simple (RLS). Todas las pruebas se ajustaron a a £ 0.05.
RESULTADOS
La primera aproximacion al entendimiento del cambio renal consistio en observaciones macroscopicas. El color del rinon izquierdo de los animales infectados experimentalmente palidecio progresivamente en la medida que la infeccion avanzo. Por el contrario, la coloracion del rinon izquierdo de los animales control no experimento cambio durante el mismo periodo de tiempo.
El enfoque cualitativo se centro en las membranas basales glomerulares y en los tubulos contorneados proximales, notandose aumento progresivo de grosor a partir del dia 5 post-infeccion (figura 1: sin mayores cambios; figura 6).
Figura 1. Aspecto de la ultraestructura renal en los estadio iniciales de la infeccion. La micrografia muestra un capilar fenestrado (cabezas de flecha) alineado entre dos celulas tubulares (asterisco), asi como dos prominentes estratos densos (triangulos) y una membrana que pudiera ser la lamina lucida (flechas pequenas). 72000X.
Adicionalmente, la tipica disposicion mitocondrial en la interdigitacion de la membrana basal se observo claramente (figura 2). No obstante, la secuencia micrografica hace patente la perdida progresiva de la disposicion mitocondrial, asi como su aspecto oblongo. Mas aun, las microgra - fias evidencian la presencia de mitocondrias polimorficas sin disposicion especifica (figura 3).
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Figura 2. Morfologia ultraestructural del tubulo contorneado proximal baja la accion de la infeccion experimental por Trypanosoma evansi siete dias post-infeccion. A. Un corte oblicuo del tubulo contorneado proximal muestra la estrecha asociacion que existe entre la mitocondria y la membrana plasmatica de las muy plegadas celulas epiteliales. 26000X. B. La micrografia muestra las interdigitaciones propias de las membranas basales (flechas) y la disposicion caracteristica de las mitocondrias (mit). El asterisco evidencia una prominente lamina densa. 46000X.
Figura 3. La ilustracion presenta las microvellosidades y las particularidades mitocondriales durante la infeccion murina experimental por Trypanosoma evansi nueve dias post-infeccion. A. La micrografia revela microvellosidades apicales (doble cabeza de flecha), disposicion mitocondrial (mit), gotas lipidicas (circulos) y el lumen de un tubulo contorneado. 27000X. B. En la lamina se observan microvellosidades apicales (doble cabeza de flecha) y se pone en evidencia la presencia de mitocondrias polimorficas (mit) y la perdida total de interdigitacion. 15000X.
Si bien la presencia de tripomastigotes intravasculares es evidente a partir del dia 9 post-infeccion (figura 4), no se observaron parasitos intratisulares o intracelulares.
Figura 4. Tripomastigotes intravasculares en el tejido renal de ratones infectados experimentalmente con Trypanosoma evansi. A. La micrografia muestra un glomerulo con un podocito (estrella), pedicelo (signo mas), membrana basal (triangulo), fenestra (cabeza de flecha), eritrocitos (e) y un tripanosoma (rayo). 27000X. B. La imagen evidencia la disposicion mitocondrial (mit), gotas lipidicas (circulos negros) y tripanosomas (rayos). 27000X. C. En este caso se revela la presencia de un tripomastigote intravascular (rayo), la membrana basal (triangulo) y gotas lipidicas (circulos negros). 35000X.
A partir del dia 11 post-infeccion se observan gotas lipidicas en los glomerulos y tubulos contorneados proximales (figura 5).
Figura 5. Ultraestructura renal bajo estres experimental por Trypanosoma evansionce dias post-infeccion. El glomerulo presenta un podocito (estrella), pedicelos (signo mas), membrana basal (triangulo) y gota de lipidos (circulo negro). 27000X.
]]> El enfoque estadistico del cambio renal en infecciones experimentales por T. evansi se centro en el EMBG y el ETCP. El ANOVA demuestra cambios significativos tanto en EMBG como en ETCP. Es recomendable prestar atencion particular a los valores de "p", p << 0,05 (tabla 1).Tabla 1 Cuadro resumen del Analisis de la Varianza sobre el espesor de la membrana basal glomerular (EMBG) y el grosor del tubulo contorneado proximal (ETCP). SC: Suma de cuadrados; GL: Grados de libertad; SM: Suma de medias; F: F de Fisher; p: Nivel de probabilidad.
La figura 6 muestra la representacion bidimensional de los resultados del ANOVA mediante un grafico de cajas y bigotes. Adviertase la posicion de las medias (cajas), la amplitud de los errores estandar (bigotes) y la diferencia manifiesta con respecto a los controles.
Figura 6. Representacion grafica del Analisis de la Varianza de cambio dimensional en rinon de raton infectado experimentalmente con Trypanosoma evansi. A. La figura evidencia el cambio de media y el error estandar (bigotes) del grosor de las membranas basales glomerulares a lo largo del tiempo de infeccion en los grupos experimentales (cajas negras) y los controles (cajas blancas). B. El grafico muestra el cambio en la media y el error estandar (bigotes) del espesor de los tubulos contorneados proximales a lo largo del tiempo de infeccion en los grupos experimentales (cajas negras) y los controles (cajas blancas).
Por su parte, los resultados de RLS demuestran que las magnitudes numericas del EMBG y el ETCP no solo cambian, sino que aumentan en el tiempo. Es mas, la RLS prueba que el proceso es mas rapido en las membranas basales glomerulares que en los tubulos contorneados proximales (figura 7).
Figura 7. Representacion grafica de la Regresion Lineal Simple. A. Modelo de cambio de grosor de las membranas basales glomerulares. Las linea continua con cajas negras corresponden a los grupos experimentales y linea discontinua con cajas blancas corresponden a los grupos control. Los intervalos de confianza estan indicados. B. Modelo de cambio de espesor de las membranas basales de los tubulos contorneados proximales. Las linea continua con cajas negras corresponden a los grupos experimentales y linea discontinua con cajas blancas corresponden a los grupos control. Los intervalos de confianza estan indicados.
Los cambios descritos cuantitativamente en las membranas basales glomerulares y los tubulos contorneados proximales constituyen una progresion caracterizada cualitativamente por acumulacion creciente de daño.
]]> DISCUSIÓNLas investigaciones histologicas y ultraestructurales referentes al rinon de animales infectados con T. evansi son escasas. No obstante, un par de autores indican que las alteraciones renales en perros podrian ser el resultado de toxinas parasitarias y/o de la actividad del propio T. evansi (14) (15). Otras publicaciones informan de glomerulonefritis ligera, degeneracion tubular y necrosis en camellos (16), asi como accion directa del hemoflagelado en combinacion con la respuesta inmune desencadenada por hospedadores lagomorfos (17).
De acuerdo a estos trabajos la muerte subita deber ser el resultado de falla renal. Tales argumentos serian causa de muerte mas importante en ratones que padecen la fase aguda de la infeccion por T. evansi.
En el riñon el endotelio capilar y la membrana de las celulas epiteliales estan separados por un soporte extracelular laminar de 50-100 mm de grosor denominado membrana basal o lamina basal. Incrementos de espesor en la lamina basal no son eventos comunes y estan relacionados a la reduccion o al colapso de los glomerulos, tal cual se aprecia en procesos isquemicos o hipertensivos (18). En este trabajo se describen cambios cualitativos en las singularidades de la lamina basal (figura 1-5) que, ademas, se caracterizan en terminos cuantitativos (figura 6-7).
Los tubulos contorneados proximales presentan caracteristicas particulares. La microscopia electronica de transmision evidencia invaginaciones laterales con interdigitaciones profundas (19). Estos pliegues internos estan asociados a mitocondrias oblongas que yacen ortogonales a la membrana basal. Tales invaginaciones basales incrementan el area superficial facilitando, en consecuencia, el transporte desde los tubulos contorneados proximales al liquido extracelular y, subsecuentemente, hasta los capilares mediante la bomba Na+-K+, Mg+-dependiente (20). La abundancia de mitocondrias en las inmediaciones de membrana celular lateral garantiza el suministro del ATP requerido por el transporte (21), revelando adicionalmente las enormes de mandas energeticas del proceso (22). Tal arreglo mitocondrial no se observa en el modelo experimental descrito en este trabajo. Una condicion renal similar ha sido descrita en ratones emponzonados experimentalmente con el veneno de Crotalus vegrandis (23).
Los resultados sugieren disminucion progresiva de la funcion mitocondrial, ya que el transporte ionico se de terioraria concomitantemente. Esta perdida de conexion funcional implicaria el debilitamiento gradualmente creciente de la funcion tubular.
Tal cual se ha demostrado en este trabajo las lesiones renales debidas a T. evansi estan asociadas a glomerulonefritis y atrofia tubular. El mecanismo de estas patologias esta relacionado a depositos del componente 3 del complemento (C3)(24)(25). El dano glomerular podria disminuir la funcion tubular, permitiendo en consecuencia, el desarrollo de nefritis, condicion que fa ci - litaria la entrada de toxinas y/o complejos inmunes via tu bulos contorneados proximales. Tal especulacion estaria sustentada por las observaciones ultraestructurales, ya que el dano epitelial en este modelo murino es extenso. De este modo, la infeccion murina experimental por T. evansi induciria el desarrollo de una falla renal aguda que evolucionaria hacia la muerte del animal.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen la asistencia tecnica de la Srta. Yoryimar Azuaje y del Sr. Edgard Mejias. Esta investigacion ha recibido apoyo economico de FONACIT (Proyecto G98-03462).
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