Karina I Zago G 1, María Y García F 1, María L Di Bernardo 1, Patricia Vit 2, José R Luna 1 , María Gualtieri 3
1 Universidad de Los Andes, Facultad de Farmacia y Bioanálisis, Grupo de Investigación en Toxicología Analítica y Estudios Farmacológicos (GITAEF), Departamento de Toxicología y Farmacología, Urbanización Campo de Oro, Calle Principal, Edificio Carlos Edmundo Salas. Mérida, Venezuela. Telf. 0274-2403484 e-mail: migarcia@ula.ve
2 Universidad de Los Andes, Facultad de Farmacia y Bioanálisis, Apiterapia y Bioactividad, Departamento Ciencia de los Alimentos.
3 Universidad de Los Andes, Facultad de Farmacia y Bioanálisis, Departamento de Farmacognosia y Medicamentos Orgánicos.
RESUMEN
En este trabajo se ha determinado el contenido de Vita mina C en mieles de abeja de la región andina venezolana. La Vitamina C pertenece junto con la Vitamina B al grupo de las hidrosolubles. Ayuda en el desarrollo de huesos, cartílagos, a la absorción del hierro, a la producción de colágeno (actuando como cofactor en la hidroxilación de los aminoácidos lisina y prolina). La propiedad química antioxidante es la más importante de la vitamina C; esto ayuda a prevenir la oxidación de las vitaminas A y E, y de algunas vitaminas del grupo B, tales como la riboflavina, tiamina, ácido fólico, y ácido pantoténico. Desarrolla acciones anti-infecciosas y actúa como un desintoxicante ya que puede reducir la toxicidad de metales pesados como el plomo, mercurio y arsénico. La Vitamina C no es sintetizada por el hombre, por esta razón debe ser ingerida en la dieta, los alimentos más ricos en Vitamina C son vegetales verdes, frutas cítricas y papas, entre otros. La Vitamina C esta presente en la miel en bajas concentraciones, el HPLC es la técnica más apropiada para su cuantificación, pero es una técnica costosa y de difícil acceso. Se propone una metodología más sencilla basada en volumetría de óxido-reducción, ya que la Vitamina C se oxida a ácido dehidroascórbico, por reacción con 2,6-diclorofenolindofenol el cual se reduce mediante una reacción redox a una solución incolora. Los valores encontrados, reportados en mg vit C/100 g miel, oscilan entre 12.74 y 40.13, con una media de 20.982 ± 2.8896
Palabras clave: Vitamina C, miel, REDOX.
Determination of the vitamin C content in honey of Venezuelan bees by oxide-reduction volumetry
ABSTRACT
]]> This study has determined the content of Vitamin C in honey bee in the Andean Venezuelan region. The Vitamin C be - longs together with vitamin B to the group of water-soluble. Assists in the development of bones, cartilage, the absorption of iron, the production of collagen (acting as a cofactor in the hydroxylation of amino acids lysine and proline). The chemical antioxidant property is the most important of vitamin C. This helps prevent the oxidation of vitamins A and E, and some B vitamins such as riboflavin, thiamin, folic acid and pantothenic acid. Develops anti-infectious actions and acts as a detoxifying because it can reduce the toxicity of heavy metals like lead, mercury and arsenic. Vitamin C is not synthesized by man, for this reason should be eaten in the diet, foods rich in Vitamin C are green vegetables, citrus fruits and potatoes, among others. Vitamin C is present in honey in low concentrations, the HPLC technique is best suited to their quantification, but is a costly and difficult to access. It proposes a simpler method based on oxide-reduction volumetric, as the Vitamin C is oxidized to dehidroascorbic acid, a reaction with 2.6-dichlorophenolindophenol which is reduced by a redox reaction to a colourless solution. The values found, reported in mg vit C/100 g honey, ranging between 12.74 and 40.13, with an average of 20,982 ± 2.8896.Key words: Vitamin C, honey, REDOX.
Recibido: 10 de enero de 2008 / Aprobado: 23 de junio de 2008
INTRODUCCIÓN
Según las normas COVENIN, en Venezuela la miel es: "la sustancia dulce sin fermentar, producida por abejas obreras, a partir del néctar de las flores o de exudación de otras partes vivas de las plantas, que las abejas recogen, transforman y combinan con sustancias específicas, almacenan y maduran en panales". El proceso de conversión del néctar en miel implica dos procesos di fe rentes. Uno químico, en el cual la sacarosa es des - do blada en glucosa y fructosa (azúcares simples) por acción de la enzima invertasa, presente en la saliva de las abejas pecoreadoras. Estas, al llegar a la colmena, transfieren el néctar a otras abejas, quienes lo regurgitan junto a su saliva (agregándole más invertasa) en las celdas de los panales destinados a su almacenamiento. El segundo proceso consiste en crear corrientes de aire caliente que deshidratan el néctar, reduciendo el contenido de agua a menos de 20%, produciéndose finalmente la miel. Este proceso, de orden físico, se logra a través de la ventilación y evaporación, producto del calor generado por el movimiento de los músculos toráxicos y las alas de las abejas (1). Es un producto complejo, rico en azúcares, vitaminas, sales minerales y enzimas (sustancias de naturaleza proteica que actúan en procesos vitales). La composición, el aspecto, el sabor, el color, etc. varían mucho dependiendo de las flores de las que proviene. El color varía desde los tonos blancos hasta los pardos oscuros; existiendo mieles rojizas, amarillentas o verdosas, aunque predominan los tonos castaño-claros o ambarinos (2). Se sabe que cuanto más oscura es la miel, más rica es en fosfato de calcio y en hierro. La miel de color claro es más rica en vitamina A. Las mieles oscuras son más ricas en vitaminas, B1 y C. La composición de la miel es variable (3,4), pero el rango de esta variación es pequeño, tanto respecto a los elementos componentes como a sus proporciones. Se han encontrado: magnesio, azufre, yodo, cloro, potasio, y un conjunto extraordinario de oligoelementos esenciales para el organismo tales como: manganeso, silicio, boro, cromo, aluminio, litio, níquel, plomo, estaño, titanio, zinc, cadmio. El complejo vitamínico se centra en las vitaminas: A (antixeroftálmica), E (antioxidante) y K (antihemorrágica). También se han encontrado trazas de vitamina C, B1 (tiamina), B3 (ácido nicotínico) y vitamina B2 (riboflavina) (5). Conociendo la importancia de las funciones biológicas que desempeñan estos elementos minerales y orgánicos, no es de extrañar que se recomiende como sustituto de otros azúcares refinados, que sólo poseen valores energéticos (6).
La vitamina C (7) tiene varios nombres por los que se la conoce: ácido ascórbico, ácido hexurónico, factor antiescorbútico, o antiescorbutina (Figura 1). Esta vitamina está implicada en la síntesis de colágeno y en varias funciones inmunológicas y antibacterianas. El ácido ascórbico se describe como un polvo blanco, cristalino, muy soluble en agua, con un sabor muy similar al del zumo de naranja cuando se encuentra en solución. El ácido ascórbico se denomina, también, ácido L-ascórbico, existiendo el ácido D-ascórbico que es imagen especular del anterior pero que no tiene la actividad de la vitamina C.
Figura 1: Estructura Química de la Vitamina C.
Son muchas las características y propiedades de la Vitamina C debidas, principalmente, a que es muy termosensible y lábil a la acción del oxígeno y a las radiaciones ultravioletas, potenciándose sus propiedades en presencia de bioflavonoides, calcio y magnesio. La vitamina C corresponde al grupo de las vitaminas hidrosolubles, y como la gran mayoría de ellas no se almacena en el cuerpo por un largo período de tiempo y se elimina en pequeñas cantidades a través de la orina. El ácido ascórbico tiene la estructura de una lactona con una configuración enodiol; su acidez se deriva del carácter enólico de los grupos hidroxilos en C2 y en C3; el hidroxilo en C3 es el más ácido. La característica más importante del ácido ascórbico es su oxidación reversible para formar ácido deshidroascórbico. En presencia de oxígeno, el ácido ascórbico se degrada fundamentalmente, vía su monoanión, a ácido deshidroascórbico. Este último compuesto posee actividad completa de vitamina C. Las fórmulas estructurales (Figura 2) del ácido ascórbico y del ácido deshidroascórbico son las siguientes:
La Association of Official Analytical Chemist (AOAC) ha recomendado la determinación de vitaminas mediante métodos microbiológicos, espectrofotométricos y fluorométricos (8). La cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) ha sido la principal vía de análisis de las vitaminas (9). Los detectores flluorométricos y espectrofotométricos acoplados a HPLC se han usado para el análisis de las vitaminas tanto en preparaciones farmacéuticas como en fuentes naturales; la cromatografía de fase reversa también la han aplicado mucho en el estudio de estos compuestos. Los métodos rutinarios de volumetría igualmente pueden ser empleados y permiten su aplicación en un laboratorio de control de calidad de productos de la colmena, constituyéndose en un método alternativo válido en situaciones en que no se dispone de equipamiento de última generación (10). Todas estas técnicas mo dernas nos permiten determinar el contenido de vitamina C en mieles. El método volumétrico recomendado por la AOAC es la titulación con el indicador redox 2,6-diclorofenolindofenol (8). El análisis implica la oxidación del ácido ascórbico con un colorante redox, como el 2,6-diclorofenolindofenol (azul en medio básico y rojo en me dio ácido), el cual se reduce en presencia del ácido (Figura 3). El contenido de ácido ascórbico es directamente proporcional a la capacidad de un extracto de la muestra para reducir una solución estándar determinada por titulación.
Figura 3: Reacción de oxidación del ácido ascórbico.
La cuantificación de vitamina C, por el método del 2,6-diclorofenolindofenol, es un método rutinario de titulación con 2,6-diclorofenolindofenol en el cual sólo se determina la forma reducida; sin embargo, rinde buenos resultados en el análisis de frutas e incluso en el extracto de vegetales no sometidos a tratamientos térmicos, porque toda la vitamina C presente en ellos se encuentra en la forma reducida (11).
MATERIALES Y MéTODOS
La determinación de Vitamina C se realizó por volumetría de oxido-reducción. Se utilizó como agente valorante una solución de 2,6-diclorofenolindofenol, previamente estandarizada. Todos los reactivos empleados (Ácido Ascórbico y/o Vitamina C, el 2,6-diclorofenolindofenol, Ácido clorhídrico, Ácido oxálico, Acido nítrico) fueron de grado analítico (Merck-Alemania).
Las muestras analizadas, provenientes de abejas Apis mellifera, fueron suministradas por diferentes apicultores de los Andes Venezolanos, específicamente del Estado Mérida, trabajando sobre 9 de ellas (identificadas con números del 1 al 9), las cuales se conservaron refrigeradas hasta su análisis.
La evaluación estadística de los datos para un nivel de confianza del 95% se realizó en el STATISTIX 7.0. Los resultados experimentales están expresados como media ± desviación estándar (DS), con sus respectivos rangos máximos y mínimos, varianzas, desviación están dar relativa (% RSD) y mediana, los mismos se resumen en la Tabla 2.
Tabla 1 Concentración de vitamina C en miel de abejas
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Tabla 2 Estadísticas descriptivas para los valores de Vit C.
Para la preparación de soluciones y lavado del material de laboratorio se empleó agua desionizada de alta pureza Milli-Q (18 MW cm-1 de resistividad). Todo el material utilizado fue lavado y luego fue sumergido en una solución de HNO3 al 20% v/v durante por lo menos 12 horas y se mantuvo en la solución ácida hasta que se utilizó. Al momento de utilizar el material, éste se enjuagó con agua desionizada y se curó con la solución a utilizar.
Preparación de la solución de 2,6-diclorofenolindofenol (DCIP)
Se pesaron 62.5 mg de 2,6-diclorofenolindofenol y se disolvieron en 50 ml de agua destilada con 52.5 mg de NaHCO3 (bicarbonato de sodio), se agitó hasta disolución y se enrasó con agua destilada hasta 250 ml. La normalización de la solución de 2,6-diclorofenolindofenol se realizó utilizando una solución patrón de acido ascórbico (Vit C), preparada con 50 mg de acido ascórbico disueltos en 50 ml de una solución de ácido oxálico 1 g/100ml, enrasando con agua destilada hasta 100 ml. La estandarización se llevó a cabo tomando 10 ml del pa trón de Vitamina C y titulándolo con la solución de 2,6-diclorofenolindofenol, hasta que un color ligeramente rosado persistiera por 20 segundos.
Preparación de las muestras
Las muestras de miel se prepararon por dilución de 5 g de miel hasta un volumen de 20 ml con agua desionizada y a la cual se le añadieron 2 ml de HCl 1M.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El diseño experimental se realizó con tres repeticiones por muestra. La comparación de medias se hizo con la prueba de ANOVA (p=0.05). Los resultados obtenidos para el contenido de vitamina C en las muestras, referidos a 100 g de miel, se indican en la Tabla 1, los cuales variaron entre 12.74 y 40.13 mg vit C/100 g miel
]]> El contenido de vitamina C en la muestra referidos a 100 g de miel.En Venezuela no existen trabajos publicados sobre contenido de Vitamina C en mieles, aunque la Guía de Referencia del Nacional Honey Board (USA), en su información nutricional declara un contenido promedio de 0.5 mg/100 g miel. Las concentraciones obtenidas muestran una variación en cuanto al contenido de Vitamina C, aunque no se observan valores discrepantes (p=0,32). Esta diversidad puede ser debida a la distinta composición de las mieles, lo que presupone fuentes florales diferentes. Sin embargo, nuestros resultados se encuentran por encima de los reportados en la Guía de Referencia del Nacional Honey Board (USA), coincidiendo con lo reportado por Tauguinas, Alicia L y col. (12), con valores entre 58-90 mg/100g; y Nicoleta Matei y col. (13), con valores en - tre 2.26-3.64 mg/g; ellos asumen que estos valores, fue ra de los reportados, se deben a la procedencia de las mieles y la época de recolección, también válido para nuestro trabajo. Las normas venezolanas para el control de calidad de la miel de abejas (14), no incluyen análisis especiales y por lo tanto no hay rangos de variación sugeridos para el contenido de Vit C. La única referencia ve nezolana para el contenido de Vit C en miel de abejas, se encuentra en la tabla de composición de alimentos elaborada por el Instituto Nacional de Nutrición (14), la cual sugiere que una miel debe aportar diariamente, como requerimiento nutricional, 4 mg vit C/ 100 g miel.
La estadística descriptiva se muestra en la Tabla 2.
Al aplicar la estadística Gaussiana a este conjunto de datos se aprecia una tendencia de los mismos a distribuirse normalmente con un sesgo positivo. En el Diagrama de Caja ilustrado en la Figura 4, se pueden apreciar los parámetros estadísticos mostrados en la Tabla 2.
Figura 4: Vitamina C en muestras diluidas de mieles.
CONCLUSIONES
La determinación de Vitamina C por esta metodología nos permite estimar niveles de concentración, suficientemente confiables y simples en mieles. Resultando un método útil en los laboratorios de control de calidad de mieles cuando no se dispone de un equipamiento de última generación. Sin embargo seria aconsejable poder cotejar los resultados obtenidos con otro método instrumental como el HPLC y realizar pruebas de validación del mismo, lo cual no fue objeto de estudio en este trabajo. Sin embargo, resultó ser un método preciso observándose buena reproducibilidad en las medidas entre sí y en días sucesivos.
Las mieles analizadas por contener valores de Vitamina C altos, también deben presentar adecuados valores de Vitamina A y E, ya que la vitamina C por su actividad antioxidante previene la perdida de estas (15), con virtiendo estas mieles en un buen complemento nutricional. Además este trabajo podría dar inicio a una revisión más profunda, con mayor cantidad y variedad de mieles, que permitiese la creación de rangos para la Vitamina C en mieles venezolanas que pudiesen incorporarse en la tabla de composición de alimentos elaborada por el Instituto Nacional de Nutrición.
AGRADECIMIENTO
]]> Los autores agradecen al CDCHT-ULA-Mérida por su apoyo y aporte financiero con el proyecto FA-361- 05-03-F.REFERENCIAS
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9. Gennaro A R, et.al., 2003. Farmacia Remington. 20 Ed., Edi torial Médica Panamericana, Buenos Aires. [ Links ]
10. Vivas D, Hoyos S, Ramírez S, Aztarbe M, Cravzov A, Avallone C, Montenegro S, Grzynski A, Baez M. Rele vamiento de técnicas analíticas para la investigación de vitamina C en mieles. En Jornadas de Comunicaciones Científicas y Tecnológicas. UNNE 2003. [ Links ]
11. Tauguinas AL, Hoyos S, Cravzov AL, Avallone CM. 2004. Análisis de niveles de concentración de vitamina C en mieles de la provincia del Chaco. Comunicaciones Científicas y Tecnológicas, T-044:1-4. [ Links ]
12. Nicoleta Matei, Semaghiul Birghila, Simona Sobrinas, Petre Capota. 2004. Determination of C Vitamin and Some Es sential Trace Elements (Ni, Mn, Fe, Cr) in Bee Products. Acta Chim. Slov. 51: 169-175. [ Links ]
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14. Instituto Nacional de Nutrición. 2001. Tabla de Composición de alimentos para uso práctico. Publicación No. 54. Serie Cuadernos Azules; Caracas, Venezuela; 97p. [ Links ]
15. Tolonen M. 1995. Vitaminas y minerales en la salud y la nu - trición. Ediciones Acribia. Zaragoza, 159-162. [ Links ] ]]>