Clinical and epidemiological and molecular study of human metapneumovirus in patients with acute respiratory infections (ARI) in Venezuela

Cerraf E Tovar H¹, Alessandra Moncho S¹, David Fernandez S¹, Marwan S Aguilar M¹, Dulce Morón².

¹ Departamento de Virología del Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel” (INHRR). Teléfono: 0212.219.1702. email: cerraf.tovar@inhrr.gob.ve

² División de Diagnóstico y Vigilancia Epidemiológica. del Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel” (INHRR). Teléfono: 0212.219.1702. email: dulce.moron@inhrr.gob.ve

Autor de correspondencia: Cerraf E. Tovar H. Teléfono: 0212.219.1702/0426-8108444, email: cerraf.tovar@inhrr.gob.ve / cerrafth@gmail.com

Resumen

El Metapneumovirus Humano (MPVh) ha sido asociado con Infecciones Respiratorias Agudas (IRA) en pacientes de todas las edades. Estudios epidemiológicos indican la prevalencia del MPVh alrededor del mundo, sin embargo, en Venezuela poco se conoce sobre su comportamiento en la población. Este estudio pretende describir el comportamiento epidemiológico de la infección  por MPVh en pacientes venezolanos. Se evaluaron por RT-PCR multiplex 1812 hisopados nasales (HN) provenientes de pacientes con diagnóstico de IRA e IRA grave (IRAG) con resultados negativos a virus Influenza, referidos al INHRR entre los años 2010 y 2013. De los Virus Respiratorios no Influenza (VRnI), el MPVh resultó ser el cuarto virus mas detectado con una frecuencia de 9,1%. El 42,02 % de los casos positivos a MPVh fueron niños ≤ 5 años con 29 casos (29/69). Los pacientes positivos a MPVh cursaron IRA alta con fiebre, tos, congestión nasal, disnea/tiraje/rinorrea, malestar general y estridor; e IRAG con hospitalización (58%), neumonía (36,2%), bronquitis aguda (10,1%), bronconeumonía (2,8%), rinofaringitis y laringotraqueobronquitis en el 1,4%. El análisis filogenético de los MPVh demostró la aparente relación de los genotipos A2 y B2  con IRAG. Este estudio permite demostrar la importancia de la detección de otros agentes virales respiratorios y su posible relación con el desarrollo de IRA/IRAG, así como fortalece la vigilancia epidemiológica de las enfermedades respiratoria en Venezuela.

Palabras claves: Metapneumovirus humano, Infecciones Respiratorias Agudas Graves, Virus Respiratorios, Vigilancia Epidemiológica.

Summary

Keywords: Human metapneumovirus, Severe Acute Respiratory Infections, Respiratory Viruses, Epidemiological Surveillance.

Recibido: 30 de abril de 2015 Aprobado: 15 de septiembre de 2015

Introducción

El Metapneumovirus Humano (MPVh) es un virus envuelto que pertenece al género Metapneumovirus, subfamilia Pneumovirinae y familia Paramixoviridae; descrito por vez primera en niños Holandeses en el año 2001, quienes cursaban un cuadro clínico de Infecciones Respiratorias Agudas (IRA) con distintos grado de compromiso (1).

El genoma del MPVh está constituido por una cadena de ARN sentido negativo de 13kb el que codifica para 8 proteínas: Matriz (M), Nucleoproteína (N), Fusión (F), Glicoproteína (G), Fosfoproteína (P), Polimerasa (L), Proteína SH y Proteína M2. Análisis filogenéticos del gen de la nucleoproteína N, Proteína F y glicoproteína G han revelado hasta la fecha 2 genotipos del MPVh; genotipo A y genotipo B; y dentro de ellos se encuentra los subtipos A1, A2, B1 y B2. Ambos genotipos han sido asociados a IRA graves (IRAG) en niños y en algunos casos en adultos y aunque pueden co-circular generalmente sólo uno de ellos es el responsable de los episodios de brotes o epidemia (2, 3).

El MPVh se encuentra distribuido a nivel mundial de forma estacional igual que el Virus Influenza (VI) y Virus Respiratorio Sincitial (VRS). Presenta un pico a finales de invierno y principio de primavera (4). La transmisión del MPVh ocurre por contacto directo con secreciones contaminadas que involucran saliva, moco y grandes cantidades de partículas aerosoles y el periodo de incubación del virus varía entre 4 a 6 días. Las infecciones por MPVh se han incrementado en los últimos años especialmente en niños y adultos inmunocomprometidos, causando impacto en la salud y en la economía de los países en desarrollo (5).

Desde su descubrimiento, el MPVh ha demostrado ser capaz de provocar cuadros clínicos de IRA similares a las provocadas por el Virus Respiratorio Sincicial (VRS) (4), afectando tanto las vías respiratorias superiores, produciendo: tos, fiebre, dificultad respiratoria, sibilantes, crepitantes, disnea-tiraje, rinorrea, expectoración, como las inferiores, causando: bronquitis aguda, neumonía y en algunos casos bronconeumonía y asma (2, 6, 7, 8).

En Venezuela, poco se conoce sobre el comportamiento del MPVh y la relación con el desarrollo de IRA e IRAG, por lo tanto este estudio tiene como objetivo demostrar la circulación de MPVh en pacientes con diagnóstico de IRA e IRAG referidos al INHRR entre los años 2010 y 2013, así como describir las características clínicas-epidemiológicas y los genotipos asociados pacientes Venezolanos.

Materiales y Métodos

Muestras. Las muestras empleadas en el estudio consistieron en 1812 hisopados nasales (HN) tomadas en medio de transporte viral (Sigma virocult^®) de pacientes con diagnóstico de IRA y/o IRAG (con resultado negativo a virus Influenza A y B por la técnica de RT-PCR en tiempo real) y referidas al INHRR como parte de la Vigilancia Epidemiológica de IRAs del Ministerio del Poder Popular para la Salud, República Bolivariana de Venezuela, período 2010- 2013.

Procesamiento de la muestra: La detección molecular fue realizada basándose en el protocolo previamente desarrollado y publicado (9, 10). Todas las muestras fueron procesadas para la detección del genoma de 13 virus respiratorios no Influenza (VRnI) (Adenovirus (ADV), Enterovirus (EntV), Rinovirus (RNV), Coronavirus OC43 y 229E (CoVh), Parainfluenza 1,2,3 y 4 (PIVh), VRS A y B, MPVh y Bocavirus(BoVh). 140 ul de HN de cada paciente fue utilizado para la extracción del ARN viral mediante el kit comercial QIAamp Viral Mini kit (Qiagen^®, Hilden-Germany). 5ul del ARN extraído fue amplificado por RT-PCR en una mezcla de reacción con un volumen de 45ul conteniendo: 10ul de buffer enzimático, 10pmol de cebadores sentido y antisentido dirigidos al gen que codifica para la proteína matriz (cuadro n°1). 0,4mM de dNTPs, 1,5mM de MgSO4 y 2ul de mezcla de enzimas conteniendo 10U de enzima GoTaq Flexi DNA polimerase y GoScript Reverse transcriptase (cat#M8295 y cat#A5000 de Promega, respectivamente), la reacción se llevó a cabo en un termociclador marca Applied Biosystems bajo las siguientes condiciones: 45°Cx45 min, 95°Cx5 min, luego 45 ciclos a 95°Cx30seg, 53°Cx2min, 68°Cx1min y una extensión final a 68°Cx10min. Para el segundo ciclo de amplificación (NESTED-PCR), 2ul del producto del 1er ciclo fueron añadidos a una mezcla de reacción con un volumen de 48ul conteniendo: 10ul de buffer enzimático, 10pmol de cada cebador descrito en la cuadro n°1; 1,2mM de dNTPs; 5mM de MgCl2 y 2,5 U de GoTaq Flexi DNA Polimerase (Promega, Cat#M8295). La reacción se realizó bajo las siguientes condiciones: 95°Cx5min, 35 ciclos a 95°Cx30seg, 55°Cx2min y 72°Cx1min, con una extensión final a 72°Cx5min. 10ul del producto del 2do round fue combinado con 1ul de buffer se carga, corrido en un gel de agarosa al 2% bajo un voltaje de 125 voltios y vizualizado en un transiluminador de UV. Las muestras positivas se determinaron porque mostraron la banda esperada de 486pb.

Cuadro n°1: Cebadores empleados para la detección de MPVh en muestras de HN. (9, 10)

Secuenciación de la proteína Matriz y Análisis Filogenéticos: Para este análisis fueron seleccionados cinco productos de amplificación de muestras de pacientes con desarrollo de IRAG. La banda de 486pb fue cortada del gel de agarosa y purificada mediante un kit comercial (FavorPrep™ Gel/PCR Purification Kit. Favorgen^® Biotech Corp), obteniendo 40ul del producto amplificado. Dicho producto fue cuantificado con el uso de un espectrofotómetro marca eppendorff y posteriormente secuenciado en un equipo Aplied Biosystems 3500 Hitachi. La secuencia obtenida junto con los electroferogramas fueron revisados en el software BioEdit v.1.0 y posteriormente la secuencia consenso fue alineada con 36 secuencias parciales de la proteína matriz y completas de MPVh obtenidas del National Center for Biotechnology Information (NCBI) y del European Bioinformatics Institute (EBI) (números de acceso KJ627397.1, KC562231.1, JQ309663.1, JQ309660.1, JQ309647.1, JQ309646.1, JN184399.1, JN184400.1, JN184402.1, EF535506.1, JN184401.1, AF371337.2, KJ627432.1, HM197719.1, AY145263.1, KJ627414.1, KF530155.1, KC562237.1, KC562230.1, KC562226.1, KC562219.1, KC562236.1, KC403980.1, KJ627435.1, EF081359.1, FJ168778.1, FJ168779.1, AY297748.1, AY297749.1, KJ627400.1, DQ843658.1, DQ843659.1, JQ309661.1, AY525843.1, AY530589, GQ153651.1). Las muestras fueron enviadas a la Unidad de Estudios Genéticos y Forenses del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (UEGF-IVIC), y el análisis filogenético del segmento de 486pb de la proteína matriz de MPVh se realizó con el empleo del programa MEGA versión 6.0, con el método de Neinghbor-Joining.(11)

Variables: En cada caso se analizaron las variable: Grupo etario, genero, procedencia, características clínicas, genotipo circulante y frecuencia en año.

Instrumento de recolección de datos: Para el análisis de las variables clínico-epidemiológico se empleó la ficha de investigación de Infecciones Respiratorias Agudas del Ministerio del Poder Popular para la Salud (MPPPS), la cual acompaña la toma de la muestra de HN y es llenada por el médico tratante o por el personal de los servicios de epidemiología regional y los datos fueron obtenidos del Sistema automatizado de registro de pacientes (EVAL)de la Gerencia de Diagnóstico y Vigilancia Epidemiológica del INHRR.

Resultados

Con la finalidad de conocer las características de la población de estudio, se elaboró una tabla (tabla n°1) donde se muestra la distribución de los pacientes incluidos en el estudio según grupos etarios, género, procedencia y diagnóstico clínico. Luego de la clasificación de acuerdo a estos parámetros, se puede decir que la población fue bastante heterogénea ya que se incluyeron muestras de todas las edades, desde 0 años a adultos mayores de 60 años. En cuanto al género, se evaluaron 961 (53%) pacientes del género femenino y 851 (47%) pacientes del género masculino y se incluyeron muestras de todos los estados del país. Referente al diagnóstico clínico y morbilidades, el 69,2% de pacientes requirieron hospitalización asociado a bronconeumonía y/o neumonía, mientras que el 4,2% fueron diagnosticado con bronquitis aguda, el 2,2% con asma bronquial y 18,9% presentaron factores de riesgo tales como: embarazo, cardiopatía, VIH, síndrome coqueluchoide/tos ferina, anemia, diabetes, Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC), antecedentes de asma, hábito tabáquico y obesidad. El MPVh fue detectado en 19 estados de Venezuela durante todas las temporadas del estudio.

Tabla N°1: Distribución de las muestras de estudio según edad, sexo, ubicación geográfica y diagnóstico clínico. Venezuela 2010 y 2013.

¹El N° difiere del total debido a que en algunas historias evaluadas no se encontraba la edad del paciente.

El MPVh fue detectado en todos los años de estudio y el porcentaje de positividad fue 9,1% (69/759) representando el cuarto virus más frecuente. Se detectaron también otros VRnI como el VRS (37,7%), RNV en el 22,2%, PIVs en el 13,2%, AdV en el 8,2%, EntV en el 3,8%, BoVh en 3,3% y CoVh en 2,8%. En menos del 1% de los casos se encontraron más de un VRnI. El año donde se encontró mayor frecuencia del MPVh fue el 2010 con 10,8% y la menor frecuencia fue en 2011 con 4,5%; esto podría deberse a que el número de muestras analizadas por la técnica de PCR multiplex varía en cada año (Tabla n° 2).

Tabla n°2: Virus Respiratorios no Influenza (VRnI). Caracas. Venezuela. 2010 y 2013.

A pesar de que en todos los grupos etarios analizados se detectó la presencia del MPVh (figura nº1), el grupo etario con mayor frecuencia fue de 0- 5 años con (42%) seguido por el grupo de adultos de 21-40 años con 23,2%. (Figura n°1).

En la figura n°2 de describen los signos y síntomas y el diagnóstico clínico más común desarrollado por pacientes positivos a MPVh. El 85,5% de los pacientes positivos a MPVh presentaron fiebre y tos, seguido por congestión nasal con 62,3%, disnea/tiraje/rinorrea el 58% y malestar general y estridor con 46,4%. Luego cefalea (44,9%), mialgias (39,1%), estornudos (34,8%), crepitante (33,3%), dolor torácico (30,4%), sibilantes (29%), taquipnea/dolor de garganta/artrialgias (23,2%), astenia (21,7%) y odinofagia/fatiga/nauseas/vomito en 20,3%. En general, la gran mayoría de los pacientes presentaron más de uno de estos signos y síntomas o condición clínica a la vez, desarrollando así un cuadro clínico complejo.

Con relación al diagnóstico clínico, el 92,8% de los pacientes presentaron IRA baja asociada principalmente a neumonía (36,2%), bronquitis aguda (14,5%), bronconeumonía (2,4%) y en algunos casos rinofaringitis, amigdalitis aguda (4,3%) y laringotraqueobronquitis en 1,4%. El 58% requirieron hospitalización y 2,9% presentaron asma bronquial. En niños menores de 1 año se encontró que el 90% presentaron fiebre y tos; y el 70% presentaron IRA bajas asociadas a bronconeumonía y neumonía, de los cuales el 100% de los mismos requirieron hospitalización. Solo dos (2) pacientes fallecidos con co-morbilidad resultaron positivos a MPVh. Un pequeño porcentaje (5,8%) de pacientes con factores de riesgo y que desarrollaron una enfermedad de base como cardiopatías, Asma, Obesidad, VIH-EPOC, síndrome coqueluchoides y/o hábito tabáquico, Artritis reumatoide y postración resultaron positivos a MPVh. Igualmente, nueve (9) mujeres embarazadas resultaron positivas a MPVh (13%) presentando los mismos signos y síntomas (figura n°3)

Tabla n° 4: Pacientes con IRAG vs. Genotipos de MPVh

Leyenda: F: fiebre; T: tos; E: escalofrío; R: rinorrea; C: cefalea; M: mialgia; T: tiraje; TQ: taquipnea; UCI: unidad de cuidados intensivos; EST: estornudo; CN: congestión nasal; D: diarrea; DIS: disnea; DG: dolor de garganta; MG: malestar general; AS: astenia.

Discusión

En el presente estudio se determinó la frecuencia y se describieron las características clínicas y moleculares del MPVh en muestras de pacientes que cursaban IRA e IRAG. Para ello se evaluaron por RT-PCR multiplex 1812 HN durante 4 años (2010-2013) procedentes de todo el territorio nacional, ambos sexos y de cualquier grupos etario, condición inmunológica y con resultados negativos a virus Influenza A y B. El MPVh se detectó en el 9,1% de los pacientes con infecciones por VRnI ocupando el cuarto lugar. Estos datos, son similares a otros estudios donde reportan una prevalencia igual de 9% (12), mientras que es levemente mayor a otros estudios donde reportan 8,5% (2), 7,2% (13, 14) y 6,9% (4). La presencia de otros agentes virales no influenza como VRS (A y B), Adenovirus, Rinovirus, Enterovirus, Bocavirus, Coronavirus (229E y OC43) y Parainfluenza 1, 2, 3 y 4 también fue comprobada en el 41,7% de los pacientes, demostrando la complejidad etiológica del las IRA en nuestro país.

Se encontró la presencia del MPVh en 19 de 24 estados del país y en todos los grupos etarios con una frecuencia que oscila entre 7,2% (mayor de 60 años) hasta 42,2% (0-5 años) de los casos. En la población de niños ≤ 5 años, el MPVh se detectó en 29 casos (42,02%), un dato mucho a los reportados por Quan Tan et al. en 2014 (15) de 2,9% y de 3,7% (16); 4%(5) y 5,1% (17). Estos datos son similares a los estudios que asocian al MPVh e IRAG en niños de esta edad. Estudios serológicos indican que antes de los 5 años se tiene contacto con el MPVh, adquiriendo una inmunidad relativamente parcial ante el genotipo involucrado en la infección (17, 18).

Estos resultados son cónsonos con distintos estudios hallados en la literatura, recalcando una mayor frecuencia del MPVh en niños menores a 5 años, y también en adultos jóvenes. Según otros estudios se ha logrado determinar que MPVh produce entre 5-35% de los cuadros respiratorios en niños donde otro agente viral no ha podido ser reconocido (2, 5, 7, 18, 19).

Existe una población entre 21-40 años y de 41-60 años con una frecuencia importante de MPVh (23,2% y 13%, respectivamente), la cual es superior a los encontrados por otros estudios donde indican una frecuencia entre 3% y 14% en la misma población (18, 19). Esto podría deberse a la gran cantidad de factores de riesgo a los que se encontraba gran parte de la población de adultos analizadas en este estudio. Sin embargo hacen falta otros estudios para comprobar esta hipótesis.

Los signos, síntomas y el diagnóstico clínico observado en los pacientes con MPVh son de espectro amplio y muy similar a las reportadas en la literatura de infecciones con VSR, con alteraciones a nivel de vía respiratoria alta y baja, produciendo cuadros desde leves a graves, y en algunos casos requiriendo manejo hospitalario. El 85,5% de los pacientes +MPVh poseían diagnóstico de neumonía con hospitalización, siendo un porcentaje mayor al encontrado en otros estudios similares, donde reportan un 60% de probabilidad de desarrollar IRA o IRAG cuando hay infección por MPVh (5). Con referente a las características clínicas en adultos con MPVh, algunos reportes indican enfermedad leve tos, ronquera, dolor de garganta, congestión nasal y rinorrea y presentar desde infecciones asintomáticas hasta presentar neumonía (11); otros mencionan pacientes con bronconeumonía, bronquitis aguda y hospitalización entre el 4,3 al 13,2% (5, 18). Adicionalmente, se encontró un número importante (5,8%) de pacientes con “otra condición” clínica que resultaron positivos a MPVH, hallazgo que es respaldado por estudios donde se ha encontrado el agente en el 2% de muestras de pacientes con exacerbaciones de Asma y EPOC.

El análisis filogenético de la secuencia de 489pb de la proteína matriz del MPVh llevado a cabo en cinco pacientes con IRAG, demostró la presencia de ambos linajes genéticos del virus (genotipos A y genotipo B). Los pacientes con subtipo A2 presentó bronquitis (Pac.2 INHRR-VE); y neumonía con hospitalización (Pac.5 INHRR-VE); los pacientes con genotipo B2 presentaron neumonía con hospitalización (Pac.1, Pac.3 y Pac.4). Este hallazgo evidencia la posible asociación del MPVh con los casos de IRA e IRAG. Los estudios de análisis filogenéticos del MPVh emplean los genes F y genes G, los cuales arrojan 2 linajes genéticos (A y B) y 4 sublinajes (A1, B1, A2, B2), no obstante nuestro estudió con la proteína matriz del virus, confirma el reporte realizado por estudios filogenéticos previos donde también hallan ambos genotipos de MPVh en pacientes con IRAG (17, 20, 21). Este es el primer análisis que emplea la proteína matriz del MPVh y con resultados muy alentadores, no obstante hacen falta estudios filogenéticos empleando otros marcadores para confirmar de manera más precisa la presencia de ambos genotipos.

El MPVh figuró como un agente etiológico causante de un cuadro clínico característico de IRA grave en niños, adultos y mujeres embarazadas, con una frecuencia importante tanto en niños como en adultos. Existe una probabilidad relevante de padecer IRAG con neumonía y bronquitis aguda al ser infectado con MPVh. Este primer reporte de MPVh en Venezuela muestra la relevancia que en salud pública tiene la detección de agentes virales a través del Programa de Vigilancia Epidemiológica de IRA e IRAG del Ministerio del Poder Popular para la Salud. A su vez, estudios como este permiten una aproximación a la comprensión del comportamiento, evolución y emergencia de patógenos virales asociados a enfermedades respiratorias Este estudio evidencia la importancia de la detección de agentes virales en la Vigilancia Epidemiológica y conlleva al estudio del comportamiento de virus emergentes en nuestro país, para la comprensión de la complejidad de las enfermedades respiratorias.

Agradecimientos: El desarrollo de esta investigación contó con la valiosa ayuda del personal de la Unidad de Atención al Paciente, de la División de Vigilancia Epidemiológica y de la Sección de Aislamiento Viral.

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