Adriana Vasconcellos Costa, Néstor Sepúlveda Becker, Carolina Pacheco Córdova y Werner Miska*

Centro Biotecnológico de la Reproducción (CEBIOR), Facultad de Medicina, Universidad de la Frontera, Temuco, Chile.

*Justus Liebig Universität Giessen, Alemania. E-mail:avascon@ufro.cl

RESUMEN

Los receptores esteroidales sexuales del tracto genital de la hembra tienen importancia dado que, a través de ellos, actúan las hormonas responsables de su desarrollo y de sus cambios morfofuncionales. En su mecanismo, uno de los factores a considerar son las posibles diferencias entre las distintas especies. El objetivo del presente estudio fue evaluar, en la especie canina (N=8), la presencia de receptores de estrógenos (RE), progesterona (RP) y la presencia de proteína ligadora de corticosteroides (CBG) en ovario, oviducto y útero de 3 hembras prepúberes (N=3) y 5 hembras adultas (N=5). La evaluación morfológica se realizó con tinción de hematoxilina-eosina (H-E) e inmunocitoquímica, según la técnica de Sternberger (1979). Los resultados revelaron en animales ciclando, inmunorreactividad (IR) positiva, RE en útero, oviducto y ovario siendo marcada en oviducto. La IR para RP fue leve y variá según el estadio del ciclo. En hembras prepúberes, los RE y RP no fueron evidenciados. La CBG mostró positividad en el tracto durante el ciclo y fue negativa en prepúberes. Se concluye que la presencia de RE y RP es detectable en útero, oviducto y ovario de la hembra canina adulta habiendo variaciones de concentración según el estadio del ciclo estral, siendo su presencia en las preúberes no evidenciable, a diferencia de otras especies (oveja), donde son detectables en este estadio del desarrollo. La presencia de CBG constante durante el ciclo estral y variable en los otros estadios indica su posible participación en los procesos reproductivos.

Palabras clave: Perros, receptores de estrógenos, receptores de progesterona, CBG, inmunocitoquímica.

Detection of Estrogen, Progesterone Receptors and Corticosteroid Binding Globulin in the Canine (Cannis Familiaris) Reproductive Female Tract. Immunohistochemistry Study.

ABSTRACT

The sexual steroid receptors of the genital tract of the female have significant importance since though them the hormones responsible acting. In their mechanism one of the factors to be kept in mind is the possible differences among the diverse species, the objective of this study was to evaluate in canine (N= 8) the presence of receptors of estrogens (ER), progesterone (PR) and the presence of corticosteroid binding globuline (CBG) in ovaries, oviduct and uterus of prepuberal female (N=.3) and matures: (N=5) It was used H-E and immunohistochemical study according to the technique of Stenberger (1979). The results during the oestrus showed: Immune reactivity (IR) positive, ER in uterus and ovary being much stronger in oviduct. The PR varied according the stage of oestrus cycle. In puberal female dog ER and PR were undetectable. The CBG revealed positive in reproductive tract of cycling females but negative in prepubertal. It was concluded that the presence of ER and PR are detectable in uterus, oviduct and ovary of mature female dogs varying their concentration according to the cycle. In prepuberal, its presences come undetectable differing from other species (ovine), in which they are detected at this stage of development. The constant of CBG presence during oeustrus cycle and such variation in other stages of the cycle, it might suggest its participation in the several reproductive activities.

Recibido: 10 / 05 / 2006. Aceptado: 09 / 07 / 2007.

INTRODUCCIÓN

Las hormonas esteroidales son esenciales en la reproducción de los mamíferos, las grandes diferencias entre los géneros son principalmente el resultado de los efectos de la testosterona en machos y de los estrógenos y progesterona en hembras [2].

Los estrógenos y la progesterona, se unen a sus receptores específicos para desencadenar una respuesta biológica. Indiscutible es la importancia de éstos durante el período reproductivo de la hembra, ya que interviene en los cambios cìclicos que se producen en el tracto genital durante el ciclo estral [2, 3, 5, 11, 13]. Ellos presentan un complejo mecanismo de control en el cual es necesario tener en cuenta diversos factores, entre ellos la especie.

Garfolo y Tasende [1] y otros autores [5-7, 13, 16] observaron la presencia de receptores de estrógenos y progesterona en el endometrio de ovejas prepúberes, sin embargo, en caninos prepúberes, la presencia de los receptores de progesterona en endometrio fueron muy bajos o indetectables [4].

Según Slayden [12], en primates y roedores la expresión de los receptores en el endometrio y oviducto es dependiente directamente de las hormonas circulantes.

Para que se produzca el efecto de las hormonas sobre el receptor, éstas van previamente unidas a una proteína ligadora generalmente una globulina. Entre éstas se encuentra la proteína ligadora de corticosteroides (CBG), que une, tanto progesterona como corticoides. La CBG es una molécula que ha sido reconocida en el tracto genital del hombre y de algunas especies [8-10, 16] y está involucrada en mecanismos que llevan a la fecundación en humanos y por lo tanto, podría estarlo también en los fenómenos reproductivos de la especie canina.

El objetivo del presente estudio fue determinar en hembras caninas mediante estudio inmunocitoquímico, la presencia de receptores de estrógenos (RE), progesterona (RP) y la presencia de CBG en ovario, oviducto y útero de hembras prepúberes y adultas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para IHQ, los cortes histológicos obtenidos se procesaron siguiendo el método inmunohistoquímico de Peroxidasa anti peroxidas (PAP) descrito por Sternberger [14], según técnica del segundo anticuerpo. En la serie para los receptores estrogénicos se utilizó como anticuerpo primario o específico, un monoclonal (Dako, M7047), como anticuerpo secundario: anti IgG ratón obtenido en conejo (Dako, Z0109) y el PAP fue PAP-ratón (Dako, P0850). En la serie para los receptores de progesterona se utilizó como anticuerpo primario, un policlonal (Dako, A0098), como anticuerpo secundario: anti IgG conejo obtenido en cerdo (Dako, Z0196) y el complejo PAP desarrollado en conejo (Dako, Z0113). El revelado se hizo con 3,3’- diaminobenzidina (Dako, S-3000 ó Sigma) y H2O2 por 1-5 min., para luego ser deshidratados y montados en Entellan (Merck). Para CBG, el anticuerpo específico fue un policlonal anti h CBG, obtenido en conejo (Biogénesis Inc, EUA; y de propia producción), anticuerpo secundario: Dako, Z0109 y PAP conejo: Dako, Z0113. El revelado se hizo con 3,3’- diaminobenzidina (Dako, S-3000 ó Sigma) y H2O2 por 1-5 min., para luego ser deshidratados y montados en Entellan (Merck). Una vez finalizada la reacción, los preparados fueron teñidos con Hematoxilina, por 10-30 segundos, como tinción de contraste.

Las incubaciones de los anticuerpos primarios y PAP fueron de una hora y su dilución de 1/50. La incubación de los anticuerpos secundarios fue de toda la noche y su dilución 1/50. Los lavados fueron de 10 minutos por tres veces.

Según la intensidad de la tinción se usó la clasificación de positividad fuerte o marcada (+++), moderada (++), débil o leve (+) y negativa (-). La intensidad de reacción de las muestras fue evaluada comparándola con controles negativos, siendo éstos, cortes de los mismos tejidos tratados con sueros no inmunes.

El estudio morfológico (con H-E y la IHQ) y las fotografías se realizaron con un microscopio Carl Zeiss, Axiolab, c/cámara MC80 DX., Alemania.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El tracto genital es muy sensible a la acción de las hormonas sexuales, las que responden por medio de sus receptores específicos modificando sus características estructurales [2, 3, 11, 13]. La respuesta celular depende de distintos factores que afectan la sensibilidad y función de los tejidos como son: el número y afinidad a sus receptores (tipos y subtipos de ellos), el estado hormonal, la expresión selectiva en los órganos diana, la etapa del desarrollo y el estadio reproductivo en que se encuentre el animal y la diferencia entre las diversas especies [5]. La presencia de receptores de estrógenos RE y receptores de progesterona (RP) ha sido estudiada en el tracto genital de distintas especies. En las ovejas se estudió y demostró la presencia de RE y RP en el útero y oviducto de animales prepúberes y en ciclo [1, 5-7, 15].

En perras, según Lessey [4], los receptores de progesterona fueron en este estadio del desarrollo bajos o indetectables en el útero.

Vermeirsch y Simoens [17], Vermeirsch y cols. [18, 19] Estudiaron la presencia de receptores de estrógeno y progesterona en útero y oviducto de perra y observaron que su fluctuación fue más pronunciada en el estroma endometrial que en el epitelio glandular, concluyendo que el papel de las células estromales en la regulación de los cambios cíclicos endometriales normales como patológicos, no debe ser subestimado, ya que ellas podrían mediar la acción de varias hormonas esteroidales sobre el epitelio.

Los resultados del presente estudio mostraron para los receptores de estrógenos (RE) durante el ciclo estral, inmunorreactividad positiva moderada en el estroma y el epitelio glandular endometrial (FIG 1) y marcada en epitelio superficial y estroma del oviducto (FIG 2). Los RE mostraron inmunorreactividad leve o negativa en perras anéstricas.

Los RP presentaron en los 3 órganos inmunopositividad leve, en animales cíclicas (proestro y estro) e inmunorreactividad leve o negativa en acíclico.

Los RE y RP fueron indetectables en perras prepúberes.

Un hecho llamativo fue la presencia de receptores de estrógeno comparativamente alta, respecto al endometrio, en estroma y epitelio de oviducto de perra en proestro.

Para que se produzca el efecto de las hormonas sobre el receptor, éstas, son transportadas hasta él por una proteína ligadora que generalmente es una globulina. Entre éstas la CBG une, tanto a la progesterona como a los corticoides y su presencia en el oviducto crearía un ambiente adecuado para la fecundación [10]. Su función respecto al ovario mismo es aún desconocida, sin embargo, su relación con vasos sanguíneos sugiere que su secreción podría tener una función integradora alcanzando el lecho vascular y actuando en forma paracrina o endocrina logrando otros objetivos como el transporte de esteroides a distancia en el sistema reproductor.

Al igual que en un estudio previo en ovejas [16], para el rastreo de CBG se utilizó anticuerpo policlonal comercial (y otro de producción propia) elaborado contra CBG humana pura.

Trabajos del grupo de autores (aún no publicados) indican, que la CBG humana es una molécula proteica (globina) cuyas especificidades podrían presentar reacción cruzada con estructuras moleculares de naturaleza estrechamente relacionadas. Este fundamento apoya los resultados obtenidos [10], en que si bien es un anticuerpo relacionado por la reactividad cruzada, tanto los sitios de reacción como la intensidad de las marcas son similares a los resultados obtenidos en la especie humana con anticuerpos mono y policlonales, y por lo tanto, constituye una buena aproximación al rastreo de esta molécula en otras especies mamíferas.

La inmunorreactividad para CBG en endometrio y en oviducto fue moderada en perras en ciclo estral y negativa en prepúberes y anéstricas. En ovario se observó durante el ciclo reacción inmunopositiva a la CBG en células foliculares, en el fluido folicular (FIG 3) y en células estromales diseminadas, aisladas o en grupos, siendo llamativa su presencia asociada con vasos sanguíneos (FIG 4).

La inmunoreactividad fue negativa en prepúberes.

CONCLUSIONES

• La presencia de RE y RP es detectable en útero, oviducto y ovario de la hembra canina adulta variando sus concentraciones según el estadio del ciclo estral, siendo su presencia no evidenciable en las hembras prepúberes.

• La presencia de CBG constante en los órganos estudiados durante el ciclo estral sugiere su participación en los fenómenos reproductivos de esta especie.

AGRADECIMIENTO

Este estudio fue financiado por la Dirección de Investigación y Desarrollo Universidad de la Frontera (DIUFRO) (proyecto Nº 107-0017).

1. GARFOLO, E.G.; TASENDE, C. Uterine estrogen and progesterone receptors in prepuberal ewe distribution in myometrium, endometrium, and caruncles. Vet Res. 27:177-3. 1996.        [ Links ]

2. HAFEZ, E.S.E.; HAFEZ, B. Fisiología de la reproducción Reproducción e Inseminación Artificial en Animales. Interamericana. 7ma Ed. McGraw-Hill. Madrid. España. 31-68pp. 2002.        [ Links ]

3. KIMMINS, S.; MAC LAREN, L.A. Oestrous cycly and pregnancy effects on the distributionoestrogen and progesterone receptors in bovine endometrium. Placenta. 22:742-48. 2001.        [ Links ]

4. LESSEY, B.A.; WAHAWISAN, R.; GORELL, T.A. Hormone regulation of cytoplasmic estrogen and progesterone receptors in the beagle uterus and oviduct. Moll. Cell. Endocrinol. 21(2):171-80. 1981.        [ Links ]

5. MEIKLE, A.; TASENDE, C.; RODRÍGUEZ, M.; GARÓFALO, E.G. Effects of estradiol and progesterone on the reproductive trac and on uterine sex steroid receptors in female lambs. Theriogenol. 48:1105-113. 1997.        [ Links ]

6. MEIKLE, A.; GARÓFALO, E.G.; RODRÍGUEZ-PIÑON, M.; TASENDE, C.; SAHLIN, L. Regulation by gonadal steroids of es trogen and progesterone receptors along the reproductive trac in lambs. Acta Vet. Scand. 42:131-39. 2001.         [ Links ]

7. MEIKLE, A.; TASENDE, C.; SOSA, C.; GARÓFALO, E.G. The rol of sex steroid receptors in sheep female reproductive physiology. Reprod. Nutr. Dev. 16:385-94. 2004.        [ Links ]

8. MISAO, R.; HORI, M.; ICHIGO, S.; FUJIMOTO, J.; TAMAYA, T. Corticosteroid-bindinglobulin mRNA levels in human uterine endometrium. Steroids. 59:603-7. 1994.        [ Links ]

9. MISKA, W.; FEHL, P.; HENKEL, R. Biochemical and immunological characterzation of the acrosome reaction-inducing substance (ARIS) of hFF. Biochem. Biophys. Res. Commun. 199(1):125-129. 1994.        [ Links ]

10. PEÑA, P.; VASQUEZ, B.; VEUTHEY, C.; RISOPATRÓN, J.; SÁNCHEZ, R.; MISKA, W. Evidencias inmunocitoquímicas sobre la presencia de la serpina CBG-símil en el sistema reproductor de la hembra en bovinos. Rev. Chil. Anat. 14: 97-203. 1999.        [ Links ]

11. ROBINSON, R.S.; MANN, G.E.; LAMMING, G.E.; WATHES, D.C. Expression of oxytocin, oestrogen and progesterone receptors in uterine biopsy samples through the oestrus cycle and early pregnancy in cows. Reprod. 122:965-79. 2001.        [ Links ]

12. SLAYDEN, O.D.; HIRST, J.J.; BRENNER, R.M. Estrogen action in the reproductive tract rheus monkeysduring during antiprogestin treatment. Endocrinol. 132:1845-56. 1993.        [ Links ]

13. SPENCER, T.E.; BAZER, F.W. Temporal and spatial alterations in uterine estrogen receptor and progesterone receptor gene expression during the estrous cycle and early pregnancy in the ewe. Biol. Reprod. 53:1527-43, 1995.        [ Links ]

14. STERNBERGER, L.A. The unlabled antibody (PAP) method, introduction. J. Histoch Cytoch. 27(12):1657-65, 1979.        [ Links ]

15. VASCONCELLOS, A.; PEÑA, P.; SEPÚLVEDA, N. Estudio histomorfológico comparativo del endometrio de la oveja prepúber y en anestro bajo influencia hormonal cíclica. Rev. Científ FCV-LUZ. XV (4):334-337. 2005.        [ Links ]

16. VASCONCELLOS, A.; PEÑA, P.; SEPÚLVEDA, N.; MISKA, W. Presencia de CBG y receptores de estrógeno, fracción alfa, y progesterona en el sistema reproductor de ovejas en distintos estadios del ciclo reproductivo. Estudio inmunocitoquímico. Rev. Científ FCV-LUZ. XVI(6):655-661. 2006.        [ Links ]

17. VERMEIRSCH, H.; SIMOENS, P. Variation in the estrogen receptor content of canine uterine tissue throughout the estrous cycle. Ital. J. Anat. Embryol. 103 (4 Suppl 1): 267-75. 1998.         [ Links ]

18. VERMEIRSCH, H.; SIMOENS, P.; HELLEMANS, A.; CORYN, M.; LAUWERS, H. Immunohistochemical detection of progesterone receptors in the canine uterus and their relation to sex steroid hormone levels. Theriogenol. 53(3):773-88. 2000.        [ Links ]

19.  VERMEIRSCH, H.; SIMOENS, P.; LAUWERS, H.; CORYN, M. Immunohistochemical detection of estrogen receptors in the canine uterus and their relation to sex steroid hormone levels. Theriogenol. 51(4):729-43. 1999.        [ Links ] ]]> 1 1996 27 177-3 2 7ma 31-68 3 2001 22 742-48 4 1981 21 2 2 171-80 5 1997 48 1105-113 6 2001 42 131-39 7 2004 16 385-94 8 1994 59 603-7 9 1994 199 1 1 125-129 10 1999 14 97-203 11 2001 122 965-79 12 1993 132 1845-56 13 1995 53 1527-43 14 1979 27 12 12 1657-65 15 2005 XV 4 4 334-337 16 2006 XVI 6 6 655-661 17 1998 103 4^s1 4^s1 1 267-75 18 2000 53 3 3 773-88 19 1999 51 4 4 729-43