Cecilia Lara Mantilla*, Luis E Oviedo Zumaqué y César A. Betancur Hurtado
GRUBIODEQ. Grupo de Biotecnología, Universidad de Córdoba, Km 3 vía Cereté. Montería, Córdoba, Colombia. *Correo electrónico: clara@sinu.unicordoba.edu.co.
RESUMEN
Con la finalidad de encontrar cepas eficientes en la producción de la fitohormona a partir de aislados de los géneros Azotobacter sp y Azospirillum sp nativos de la zona San Carlos y San Pelayo ubicados en el Valle del Sinu medio, Departamento de Córdoba, Colombia, se aislaron 90 microorganismos a partir de suelos de la rizosfera de cultivos de plátano, maíz, pastos, yuca, algodón y rastrojos (área sin cultivar). Las poblaciones fueron evaluadas en la producción del ácido indolacético (AIA) en presencia de triptófano, obteniéndose concentraciones en el rango de 3,0 a 45, 0 ppm; la determinación se realizó por técnica colorimétrica utilizando el reactivo de Salkowski. La técnica fue modificada, adaptada y estandarizada. Se encontró que un aislado del género Azotobacter hallado en zonas de rastrojos produjo la mayor concentración de la auxina: 44,726 ppm. Se realizó un ensayo preliminar inoculando semillas de pastos Angleton (Dychanthium aristatum) con diferentes concentraciones bacterianas: 106, 107 y 108 UFC y se comparó con un testigo sin inóculo. Los resultados mostraron un mayor promedio de la longitud del tallo y longitud de hojas de las plantas muestreadas.
Palabras clave: Azotobacter sp, Azospirillum sp, Auxina: AIA, reactivo de Salkowski, pastos Angleton, Dychanthium aristatum.
Strain native with potential in the acetic acid production indol to improve the grass
ABSTRACT
In order to find efficient strains in the production of phytohormone from genera Azotobacter sp and Azospirillum sp native to the Zone of the Sinu in the Department of Cordoba, Colombia, 90 microorganisms of the strains were isolated, from grounds of the rizosfera of cultures of banana, maize, grass, yucca, cotton and field of stubble. The populations were evaluated in presence of Tryptophan and the production of indolacético acid (AIA) was obtained a ranging from 3,0 to 45, 0 ppm; the determination was realised by colorimetric technique using Salkowski`s reagent. The technique was modified, adapted and standardized. One of the isolates of the Azotobacter found in zones of left-overs concentrated the greater ampunt of the auxin: 44,726 ppm. A preliminary test was realized inoculating seeds of Angleton grass (Dychanthium aristatum) with different bacterial concentrations: 106, 107 y 108 UFC and were compared with a witness without inoculate. The results showed to a greater average of the length of the stem and length of leaves of the sampled plants.
Keyworks: Azotobacter sp, Azospirillum sp, Auxin: AIA, reagent of Salkowski, grass, Dychanthium aristatum.
]]> Recibido: 23/09/10 Aceptado: 18/05/11INTRODUCCIÓN
El Departamento de Córdoba es considerado una importante zona ganadera de Colombia y la alimentación para los animales se basa principalmente en las especies forrajeras existentes como la gramínea Dichanthium aristatum (Angleton). Las áreas de cultivo de estas pasturas, se ven sometidas a un uso irracional de agroquímicos y de alta mecanización, lo cual influye en la desestabilización ecológica del suelo afectando negativamente la fertilidad y limitando los nutrientes disponibles para las plantas.
El uso indiscriminado de productos fertilizantes, ha ocasionado un desequilibrio de la microbiota nativa que cumple con funciones importantes, provocando bajos rendimientos y aumento en los costos para el agricultor y el ganadero. Una alternativa para promover el crecimiento rápido de raíces y tallos es el uso de inoculantes microbianos (biofertilizantes), que contribuyen a la recuperación de las poblaciones existentes en el suelo y con ello a mejorar la fertilidad de los mismos (Sarmiento, 2006; Vessey, 2003).
Entre los microorganismos, las bacterias tienen especial importancia en la relación suelo-planta y son responsables del incremento o disminución en el suministro de nutrientes como también en la producción de factores de crecimiento (fitohormonas); las bacterias pertenecientes a los géneros: Azotobacter sp, Azospirillum sp, Pseudomonas sp, Xantomonas sp, Enterobacter sp, Arthrobacter sp, Bacillus subtilis, se destacan por su potencial como biofertilizantes e inciden grandemente en el rendimiento y en la calidad de los cultivos (Glick, 1995; Bashan y Holguin, 1997; Dobbelaere et al., 2003).
Los estudios realizados con microorganismos de los géneros Azospirillum sp y Azotobacter sp han demostrado que estas poblaciones además de fijar nitrógeno en forma asimbiótica, también segregan sustancias promotoras del crecimiento (auxinas, giberelinas, citoquininas), las cuales benefician a la planta de una forma multidimensional (Sarmiento, 2006; Halda-Alija, 2003; Pedraza, 2004).
La auxina: ácido indolacético (AIA), induce la deformación y aumento de pelos radiculares, logrando con esto una mayor captación de nutrientes y promoviendo en consecuencia el crecimiento y rendimiento de los cultivos (Okon y Vanderleyden, 1997). Se ha establecido que las rizobacterias promotoras del desarrollo vegetal (plant-growth promoting rhizobacteria, PGPR), juegan un papel primordial en los cultivos permitiendo disminuir la utilización de fertilizantes químicos, aumentar el rendimiento, acortar ciclos y por consiguiente, reducir la contaminación ambiental (Park et al., 2005).
Las bacterias representan una alternativa para mejorar el aporte nutricional de las plantas; dentro de los efectos benéficos se destacan, la secreción de reguladores de crecimiento (auxinas), mejorando los procesos de germinación de semillas, nutrición, desarrollo de raíces, entre otros. En este sentido, el objetivo del presente trabajo fue evaluar la producción AIA a partir de aislados de los géneros Azotobacter sp y Azospirillum sp nativos de la zona San Carlos y San Pelayo ubicados en el Valle del Sinu medio (Departamento de Córdoba), para hallar cepas eficientes en la producción de la fitohormona.
MATERIALES Y MÉTODOS
Sitios de muestreo
]]> El muestreo se realizó en los municipios San Carlos y San Pelayo, zona agrícola del Valle del Sinú Medio en el Departamento de Córdoba (Colombia); ésta región posee las siguientes características: altura promedio 20 m.s.n.m., temperatura 28ºC, precipitación 1200-1300 mm, humedad relativa 80- 90% y ecológicamente la zona corresponde a bosque seco tropical. Se escogieron al azar lotes sembrados con cultivos de plátano, maíz, algodón y pastos; además, zonas sin cultivar (rastrojos).Toma de la muestra
En cada lote de cultivo y rastrojo se efectuó un recorrido en zig-zag abarcando la máxima extensión; en cada uno de los sitios de muestreo se tomó una cantidad de suelo de los primeros 15 cm de la superficie de la rizósfera. Al finalizar el recorrido se hizo una mezcla de todas las muestras tomadas por lote y se realizó un cuarteo para obtener 1000 g de suelo representativo de cada cultivo y de rastrojo. Las muestras estuvieron constituidas por raíces y suelo adheridas a ellas.
Aislamiento e identificación de los microorganismos nativos
Una vez colectadas las muestras, se determinó el pH en relación 2:1; luego se pesó un gramo y se diluyó en 99 mL de agua. Se realizaron diluciones seriadas de 1:10 y las dos últimas fueron sembradas en caja petri con medios apropiados e incubadas a una temperatura de 28ºC durante 3 días; se revisaron las cajas petri y se observaron las colonias típicas (Aguilar et al., 1995; Park et al., 2005; Tejera, 2005; Dobereiner et al., 1995). También se realizaron siembras de muestras directas (Aquilanti et al., 2004). Los ensayos se efectuaron por triplicados.
Se utilizaron medios líquidos, sólidos y semisólidos:
-Género Azotobacter spp: Medios utilizados: Burk´s y Jensen¨s
-Género Azospirillum spp: Medios utilizados: Burk´s, NFB -azul de bromo timol y NFB -rojo congo.
Para la identificación de los microorganismos a nivel de género, se realizaron ensayos por triplicado, mediante observaciones macroscópicas, microscópicas con coloración y pruebas bioquímicas examinados de acuerdo a los métodos descritos en el manual de Bergey´s (Buchanan y Gibbonns, 1994).
Cuantificación química de la auxina: ácido indol acético (AIA)
]]> Se utilizó el medio de cultivo líquido Burk´s libre de nitrógeno, preparado a base de glucosa como fuente de carbono, sales minerales y agua destilada, (Park et al., 2005). El pH fue ajustado a un valor de 6,8 y esterilizado a 121 °C durante 15 minutos.La determinación de la producción del AIA se llevó a cabo por método colorimétrico utilizando el reactivo de Salkowski preparado a partir de cloruro férrico en ácido sulfúrico (Glickmann y Deessaux, 1995; Mayer, 1958). Se empleó un Espectrofotómetro Lambda 11 y la técnica fue modificada adaptada y estandarizada; luego de múltiples ensayos se escogió como mejor longitud de onda de trabajo 527,9 nm y un rango de 1,9 hasta 45,00 ppm teniendo en cuenta la producción de la auxina por los aislados (Lara et al., 2006). Ensayos por triplicado.
Ensayo preliminar en pastos Angleton, (Dychanthium aristatum)
La cepa fue producida a pequeña escala empleando el medio de Burk´s y bajo condiciones de temperatura, oxigeno y tiempo de incubación hasta obtener las concentraciones deseadas: 1x106; 1x107; 1x108 UFC/ mL.
Las semillas de pastos angleton (Dychanthium aristatum), fueron previamente lavadas en solución de hipoclorito de sodio al 5% y luego con agua, para ser inoculadas con las diferentes concentraciones de bacteria; se empleó como testigo, semillas sin inocular. Se tomaron datos del crecimiento longitudinal hasta el ápice y largo del tallo a los 21 días de corte. Los datos se sometieron a un análisis estadístico de varianza y de regresión lineal con un intervalo de confianza del 95% (Analyse – it Microsoft Excel, 2009); también se utilizó el método de ANOVA y regresión múltiple.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La determinación de la auxina se llevó a cabo utilizando el reactivo de Salkowski, que permite la oxidación del compuestos indólicos por sales férricas (Mayer, 1958); cuando la respuesta es positiva se obtiene una coloración que va desde el rosa claro a intenso dependiendo de la concentración del AIA presente. Existen numerosas formas de preparar el reactivo de Salkowski, unas utilizan ácido sulfúrico otras ácido perclórico; las relaciones de reactivomuestra también han sido variadas (1:1; 1:4, 2:1; 1:5; 1:1 y otras), para evaluar la sensibilidad de la prueba (Bernal et al., 2000; Halda-Alija, 2003; Pedraza et al., 2004; Crozier et al., 1998).
En la presente investigación se preparó el reactivo de Salkowski con ácido sulfúrico y se probó a diferentes relaciones reactivo-muestra estableciéndose la 2:1 como la de mejor sensibilidad para la determinación de las concentraciones de AIA producidos por las bacterias aisladas.
Cabe destacar que al medio de cultivo utilizado para determinar la auxina, se le adicionó triptófano que induce a la producción de ésta; numerosos estudios han demostrado que el AIA es sintetizado a partir del triptófano y el proceso es llevado a acabo por microorganismos a través de una conversión oxidativa (Müller y Weiler, 2000).
En la presente investigación se evaluó la producción de AIA a 90 microorganismos aislados, encontrándose que 45 produjeron la auxina en el rango de concentración de 3,0 a 45, 0 ppm; sus valores promedios se relacionan en los Cuadros 1 y 2.
]]> Cuadro 1. Concentración promedia de ácido indolacético (AIA) producidos por los géneros Azotobacter sp y Azospirillum sp. aislados de suelos del municipio de San Carlos.
Cuadro 2. Concentración promedia de ácido indolacético producidos por los géneros Azotobacter sp y Azospirillum sp aislados de suelos del municipio de San Pelayo.
Los resultados mostraron que las bacterias más eficientes fueron aisladas de rastrojo y por género correspondieron a: a) tres bacterias Azotobacter sp: cepa A14 de la zona de San Carlos con el mayor valor en la producción de AIA, 44,276 ppm; cepas, S,N1 y S3,2 de la zona de San Pelayo, 39, 342 ppm y 37,209 ppm, respectivamente; b) una bacteria Azospirillum spp: cepa S4,1PAM2 de la zona de San Pelayo (29,653 pm). Como se indica, los mejores resultados en la producción de la auxina se obtuvieron a partir de aislados provenientes de rastrojos; dentro de las posibles razones se debe tener en cuenta que la alta fertilización utilizada en la producción de las cosechas en la región de Córdoba, pueden estar afectando negativamente el mecanismo de secreción de la auxina que llevan a cabo los microorganismos aislados de la zona en estudio.
La producción máxima de AIA obtenida (44,276 ppm), fue superior al valor reportado en un trabajo similar (32,200 ppm (mg/L), realizado en la zona de Espinal (Tolima, Colombia) utilizando microorganismos nativos de igual género (Bernal et al., 2000); se observó que los microorganismos de la zona del Valle del Sinu Medio se extienden en un rango mayor en producción de la auxina. En los trabajos realizados sobre la microbiota nativa de la caña de azúcar (Rodríguez et al., 2005 ), se evaluaron aislados provenientes del interior de este cultivo, en la producción del AIA; se obtuvo como resultado que 6 de ellos, produjeron la auxina en el rango de 1,7 a 2,5 (μg/mL). En este estudio no se reporta evaluación de AIA con los géneros analizados en la presente investigación.
Es importante anotar, que aunque las investigaciones sobre evaluación de la producción de AIA arrojen valores altos o bajos si se comparan entre si, está demostrado que bajas concentraciones de fitohormona son capaces de estimular el desarrollo vegetal y altas concentraciones inhiben y reducen la zona de alargamiento (Rodríguez et al., 2005; Hernández, 2002); teniendo en cuenta que los microorganismos nativos están adaptados a condiciones y ambientes propios, sólo realizando bioensayos “in vitro” se podrá encontrar la dosis adecuada y comprobar el efecto ejercido sobre los cultivos a aplicar.
En éste sentido, se llevó a cabo un ensayo preliminar con la bacteria que mostró la mejor producción de auxina y que correspondió a la Azotobacter A14 de la zona de San Carlos (44,276 ppm); se probaron las diferentes concentraciones de inóculo (1x106; 1x107; 1x108 UFC/mL) y se midió longitud del tallo y longitud de hojas de las plantas muestreadas. Los resultados se observan en las Figuras 1 y 2.
Figura 1. Promedio de Altura de los tallos. ]]>
T 1: Tratamiento 1: testigo sin microorganismo.
T 2: Tratamiento 2: Inóculo 1x106 UFC de Azotobacter A14
T 3: Tratamiento 3: Inóculo 1x107 UFC de Azotobacter A14
T 4: Tratamiento 4: Inóculo 1x108 UFC de Azotobacter A14.
Figura 2. Promedio de Longitud de Hoja.
T 1: Tratamiento 1: testigo sin microorganismo.
T 2: Tratamiento 2: Inóculo 1x106 UFC de Azotobacter A14.
T 3: Tratamiento 3: Inóculo 1x107 UFC de Azotobacter A14.
T 4: Tratamiento 4: Inóculo 1x108 UFC de Azotobacter A14.
Cuadro 3. Datos estadísticos de promedio de altura de los tallos.
P<0,05 diferencias significativa.
Letras iguales no presentan diferencias significativas.
Cuadro 4. Datos estadísticos de Promedio de Longitud de Hoja.
P<0,05 diferencias significativa.
Letras iguales no presentan diferencias significativas.
El AIA es la auxina más ampliamente distribuida en las plantas; los efectos demostrados en investigaciones llevadas a cabo, contemplan, entre otras, la elongación, aumento en la respiración celular, promoción del crecimiento en raíces o incremento en la división celular, factores que favorecen el desarrollo vegetal.
]]> Las aplicaciones de inoculantes microbianos (biofertilizantes), en los cultivos cada día van en aumento debido a que sustituya en parte o totalmente la utilización de fertilizantes para disminuir los problemas ambientales y aprovechar los productos que conserven los ecosistemas naturales.La utilización de microorganismos con potencial biofertilizante productores de AIA ha demostrado ser eficientes gracias a que pueden aumentar los rendimientos y la calidad de las cosechas; así lo han demostrados los trabajos en campo realizado en Colombia (Moreno et al., 2006; Montoya, 2004), en los cuales se reporta rendimientos en pastos de un 80% con respecto al testigo, aplicando biofertilizantes a partir de microorganismos nativos y a las condiciones propias de la zona.
Los resultados de esta investigación contribuyen al conocimiento de microorganismos autóctonos, con potencial en la producción de la fitohormona, AIA; se espera que a futuro, éstas bacterias pueden ser utilizados en la preparación de productos biofertilizantes, para mejorar la productividad de los cultivos, especialmente pasturas, acorde con las necesidades del sector agropecuario de Córdoba, sustituyendo ó minimizando la utilización de productos químicos. El uso de bacterias productoras de AIA traería como beneficio un mejoramiento en la economía regional contribuyendo a recuperar la fertilidad del suelo y conservando el ambiente.
CONCLUSIÓN
Los resultados obtenidos en la presente investigación permitieron identificar microorganismos nativos de la zona agrícola del Valle del Sinu medio en el departamento de Córdoba, que presentan un gran potencial en la secreción de ácido indolacético; la actividad y eficiencia de los microorganismos de vida libre de los géneros: Azotobacter sp y Azospirillum sp, que tienen la capacidad de producir sustancias promotoras de crecimiento (auxinas), es de gran interés para la explotación agrícola y ganadera de la región.
AGRADECIMIENTO
A la Universidad de Córdoba por financiar el presente proyecto de investigación.
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