Método para contagem de células somáticas do leite bovino para imagens capturadas do microscópio óptico
Method for somatic cell count in bovine milk images captured from optical microscope
Método de recuento de células somáticas de la leche de vaca para las imágenes capturadas del microscopio óptico
Gabriel Jesus Alves de Melo1*,Viviani Gomes3, Luiz Alberto Luz de Almeida2, Antônio Cezar de Castro Lima1,Camila Costa Baccili3
1 Universidade Federal da Bahia (UFBA), Bahia, Brasil. *Correio eletrônico: gabrieluesc@gmail.com
2 Universidade Federal do ABC (UFABC), São Paulo, Brasil.
3 Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ), São Paulo, Brasil.
RESUMO
Este trabalho apresenta um método de segmentação para a contagem de células somáticas em imagens do leite bovino, destinadas a detectar uma infecção conhecida como mastite, que é a maior causa de perda na pecuária leiteira. Através do processamento de imagens e, utilizando o padrão morfológico das células, um algoritmo foi criado para detecção e contagem das células. A segmentação é realizada utilizando um novo procedimento de limiarização de histogramas para eliminar o fundo das imagens. As células restantes ligadas são separadas na etapa fi nal através da transformada de watershed. Os resultados experimentais foram obtidos utilizando um conjunto grande de imagens de diferentes fontes. Uma comparação entre o desempenho da contagem manual e o método proposto indica que este método é uma solução promissora para automatizar sistemas para detecção da mastite bovina através de microscopia óptica.
]]> Palavras-chave: processamento de imagens, vídeo microscopia, transformada de watershed, células somáticas.ABSTRACT
This work presents a hybrid segmentation method for counting somatic cells in bovine milk images, intended to detect an infection known as mastitis, which is the major cause of loss in dairy farming. By applying image processing techniques that use cell morphology it was possible to develop an algorithm capable of detecting and segmenting those cells. The segmentation is accomplished employing a new thresholding procedure to eliminate background and other residues. The remaining connected cells are separated in the fi nal segmentation step, by the use of the watershed transform. The experimental results were obtained using a large set of images from different sources. A performance comparison between the manual counting and the proposed method indicates that the later one is a promising solution to automate systems for detection of bovine mastitis via optical microscopy.
Key words: image processing, microscopy video, watershed transform, somatic cells.
RESUMEN
Este trabajo presenta un método de segmentación para el conteo de células somáticas en imágenes de la leche de bovino, destinadas a detectar una infección conocida como mastitis, que es la mayor causa de pérdida en la ganadería lechera. A través del procesamiento de imágenes y, utilizando el patrón morfológico de las células, un algoritmo fue creado para detección y conteo de las células. La segmentación es hecha por el uso de un nuevo algoritmo de umbralización de histogramas para eliminar el fondo de las imágenes. Las células restantes conectadas son separadas en la etapa fi nal a través de la transformada de watershed. Los resultados experimentales fueron obtenidos por la utilización de un gran conjunto de imágenes de diferentes fuentes. Una comparación entre el desempeño del conteo manual y el método propuesto indica que este método es una solución prometedora para automatizar sistemas para detección de mastitis bovina a través de microscopía óptica.
Palabras clave: procesamiento de imágenes, microscopía de vídeo, transformar watershed, células somáticas.
Recibido: 15/04/14 Aprobado: 21/11/14
INTRODUÇÃO
As células somáticas fazem parte do mecanismo natural de defesa do animal e são representadas basicamente por leucócitos e células epiteliais. Um aumento do número destas células no leite é um indicativo do estado imunológico da vaca frente alguma uma infecção (Tangorra et al., 2010). Do total de células somáticas presentes no leite, 75 a 98% correspondem a células de defesa (leucócitos) e 2 a 25% compreendem células epiteliais provenientes da descamação natural do tecido de revestimento e secretor da glândula mamária (Ribas, 2001).
]]> A contagem de células somáticas pode ser realizada indiretamente, avaliando-se a viscosidade do leite após adição de um reagente próprio, ou diretamente, contando-se as células através do microscópio ou por meio de equipamentos eletrônicos (Richter et al., 2013).Os analisadores eletrônicos são mais precisos e baseiam-se em diferentes técnicas de análises. Dentre os mais utilizados, destacam-se os aparelhos FossomaticTM (Foss, Dinamarca) e SomacountTM (BentleyInstruments, USA) (Silveira et al., 2005). No entanto, devido ao alto custo destes equipamentos, a contagem manual das células somáticas por meio do microscópio ainda se faz necessária (Melo et al., 2014). Por outro lado, a contagem realizada através da microscopia óptica é o método de referência adotado pela Federação Internacional do Leite (FIL) e é utilizado, inclusive, para calibração de contadores eletrônicos mais modernos (Berry e Broughan, 2007).
Diversos softwares baseados em técnicas de processamento de imagens são utilizados para contagem de alguns tipos de células, partículas e objetos. No entanto, como estes softwares possuem funções para aplicações específi cas,o surgimento de novos problemas requer o desenvolvimento de novos algoritmos (Melo et al.,2014). Por exemplo, novos algoritmos de processamento de imagens para contagem de células do sangue humano foram propostos por Sadeghian et al. (2009), Hiremath et al. (2010) e Arslan et al. (2014).
No campo da biologia e da medicina, o processamento de imagens baseado em técnicas de limiarização de histogramas é um tema comum e muito utilizado para o reconhecimento de células e outros tipos de partículas (Wu et al., 2000; Qian et al., 2009; Moo, 2013). Por outro lado, técnicas de limiarização para segmentação de células somáticas do leite é um tema novo e ainda não discutido na literatura.
Existem diversas técnicas de limiarização desde asbaseadas em critérios entrópicos ou estatísticos da imagem (Jawahar et al., 2000) até as que utilizam sofi sticados mecanismo de busca mais avançados (Yin, 2002). Segundo Gonzalez et al. (2004), a limiarização é o estágio primário em problemas de segmentação de imagens e, devido à simplicidade destes algoritmos, outras técnicas devem ser tentadas quando esta não apresentar resultados satisfatórios.
Devido à importância do desenvolvimento de novas tecnologias para contagem de células somáticas (CCS) no leite, o objetivo desta pesquisa é apresentar um método para contagem de células somáticas em imagens digitais por meio do algoritmo de limiarização de Rosin (2001) combinado com a transformada dewatershed (Edinns, 2002). Para verifi car a efi ciência da técnica, o método proposto (modelo híbrido) foi comparado ao método de limiarização de Otsu (1975).
MATERIAIS E MÉTODOS
No estudo realizado, procedeu-se a análise de 400 imagens provenientes de amostras de leite dos quartos mamários de duas vacas da raça Holandesa oriundas de propriedade localizada no estado de São Paulo (Brasil). Inicialmente foi realizada a higienização dos tetos com solução clorada, secagem com papel toalha individual e antissepsia com álcool 70%. Após o descarte dos primeiros jatos de leite, as amostras foram colhidas em tubos de vidro com capacidade para 5mL, imersos em gelo triturado e encaminhados ao laboratório em caixa de material isotérmico. Em seguida, os esfregaços lácteos foram confeccionados e examinados via microscopia óptica de acordo com os procedimentos descritos Berry e Broughan (2007).
O sistema para captura e contagem de células somáticas presentes nos esfregaços lácteos (Figura 1) foi constituído por uma câmera fotográfi ca digital (CoolSnap Color, Media CyberneticsTM, USA) acoplada ao microscópio óptico (Eclipse 800, Nikon®,Japan) no aumento de 1000x e um computador que executa o algoritmo desenvolvido em linguagem Matlab® , versão 7.8 (licença concedia ao Instituto Federal de Educação da Bahia).
RESULTADO E DISCUSSÃO
A Tabela mostra os resultados para contagem do número total de células,correlação e taxa de acertoutilizando o método propostoatravés da limiarização de Rosin (2001) algoritmo da Figura 2 e de Otsu (1975).A correlação de Pearson foi obtida através da relação entre a contagem por imagem de células somáticas realizadas pelo especialista e pelo método proposto. A precisão é definida por 
, onde Ne representa o número total de células somáticas contadas pelo especialista e Np o número de células contadas por meio da metodologia proposta. O número de células contabilizadas pelo especialista após analisar 400 imagens foi 1316 células.
De acordo com a Tabela, o método de limiarização Otsu (1975) foi ineficiente para esta aplicação com correlação não aceitável de 0,16. Segundo NG (2006) a técnica de limiarização de Otsu (1975) é muito utilizada e proporciona resultados satisfatórios para limiarização de imagens com histograma de distribuição bimodal podendo falhar se o histograma for unimodal ou perto de unimodal. Portanto, como nesta aplicação uma proporção maior de apenas uma classe de pixels (por exemplo, o fundo) está presente na imagem formando histogramas predominantemente unimodal, justifi ca-se a limitação do algoritmo de Otsu (1975) para limiariazação de células somáticas.
A correlação entre a contagem manual realizada por imagem e o método proposto foi de 0,96, com taxa de acerto de 99,77%. A escolha do algoritmo de Rosin (2001) para esta aplicação se justifi ca, pois as imagens com células somáticas produzem histogramas que apresentam distribuição predominantemente unimodal, conforme aplicação semelhante apresentada por Vallotton e Olivier (2013). O método de Rosin (2001) assume que existe uma população dominante na imagem (background), que produz um pico principal único, localizado no extremo inferior do histograma relativo à população secundária (células). O limiar escolhido por este método é o valor do histograma que maximiza a distância perpendicular entre a curva que representa distribuição de frequência dos níveis de cinza da imagem e a reta que passa pelo valor mínimo e máximo do histograma.
As células que permanecem conectadas em aglomerações após a limiarização de Rosin (2001), tal como aparece en la Figura 2, foram separadas por meio da transformada de watershed apresentado por Eddins (2002).Esta ferramenta determina as linhas que delimitam a transição entre os vales de uma imagem representada na forma topográfi ca e tem sido amplamente utilizada em muitos campos de processamento de imagem para separação de objetos conectados, tais como, apresentado por Tulsani (2013) para segmentação de células do sangue humano e Grau et al. (2004) para segmentação imagens do cérebro. O resultado da transformada de watershed aplicado sobre a imagem binária para separação das células conectadas pode ser verifi cado na Figura 2.
O parâmetro adotado para classificar e contar os objetos resultantes da segmentação final (objetos coloridos) como célula somática (Figura 2) foi o tamanho espacial de cada objeto por meio do algoritmo de contagem de Gonzalez et al. (2004) seguindo as orientações para identificação morfológicas das células somáticas apresentadas por (Berry e Broughan, 2007).
CONCLUSÃO
]]> Os resultados demonstram que o método desenvolvido é capaz de identificar células somáticas presentes em imagens capturadas por meio da microscopia direta. Portanto, o algoritmo apresentado pode ser parte integrante de um sistema de vídeo microscopia baseado em processamento de imagens para contagem de células somáticas do leite bovino. Comoisso, busca-se minimizar os erros causados pela fadiga do técnico responsável em realizar a contagem manual através do microscópio.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelos financiamentos necessários para execução desse trabalho.
LITERATURA CITADA
1. Arslan, S., E. Ozyurek and C. Gunduz-Demir. 2014. A color and shape based algorithm for segmentation of white blood cells in peripheral blood and bone marrow images. Cytometry Part A, 85(6), 480-490. [ Links ]
2. Berry, E. and J. Broughan. 2007. Use of the DeLaval cell counter (DCC) on goats’ milk. Journal of dairy research, 74(03): 345-348.
3. Eddins, S. 2002. The watershed Transform: Strategies for Image Segmentation. The Mathworks Journal, Matlab®, News and Notes, 47-48.
4. Gonzalez, R. C., R. E. Woods and S. L. Eddins. 2004. Digital image processing using MATLAB®. Ed. Pearson Education, Índia.
5. Grau, V., A. U. J. Mewes, M. Alcaniz, R. Kikinis and S. K. Warfi eld. 2004. Improved watershed transform for medical image segmentation using prior information. Medical Imaging, IEEE Transactions on, 23(4): 447-458.
]]> 6. Hiremath, P. S., P. Bannigidad and S. Geeta. 2010. Automated identifi cation and classifi cation of white blood cells (leukocytes) in digital microscopic images. IJCA special issue on “recent trends in image processing and pattern recognition” RTIPPR, 59-63.7. Jawahar, C. V., P. K. Biswas and A. K. Ray. 2000. Analysis of fuzzy thresholding schemes. PatternRecognition, 33(8):1339-1349.
8. Melo, G. J. A., B. A Melo Neto, V. Gomes, L. A. L. Almeida and A. C. C. Lima. 2014. Method thresholding automatic for somatic cell count in microscopic images.Revista Geintec: gestão, inovacão e tecnologias, v. 4, p. 1283-1291.
9. Moo, E. K., Z. Abusara, N. A. Abu Osman,B. Pingguan-Murphy and W. Herzog. 2013. Dual photon excitation microscopy and image threshold segmentation in live cell imaging during compression testing. Journal of biomechanics, 46(12), 2024-2031.
10. NG, H. F, 2006. Automatic thresholding for defect detection. Pattern Recognition Letters, 27: 1644-1649. Otsu, N. 1975.A threshold selection method from gray-level histograms.Automatica, 11(285): 23 - 27.
11. Qian, X., C. Peng, X. Wang and D. Ye. 2009. Selforganizing map-based multi-thresholding on neural stem cells images. Medical &biologicalengineering&computing, 47(7): 801-808.
12. Ribas, N. P. Valor e uso da contagem de células somáticas no manejo de rebanhos leiteiros. 2001. Congresso holstein de lasamericas, São Paulo, São Paulo. 110 p.
13. Richter, E. M., T. Melo, M. Ruoso, N. Zeolla e V. Groenwold. 2013. Ações de manejo e sanitárias no controle de CCS em rebanhos leiteiros agroecológicos. Cadernos de Agroecologia, 8(2).
14. Rosin, P. L. 2001.Unimodal thresholding. Pattern Recognition, 34(11): 2083-2096.
15. Sadeghian, F., Z. Seman, A. R. Ramli, B. A. Kahar and M. I. Saripan. 2009. A framework for white blood cell segmentation in microscopic blood images using digital image processing. Biological procedures online, 11(1): 196 - 206.
]]> 16. Silveira, T. M., L. M. Fonseca, T. B. Lago e D. R. Veiga. 2005. Comparação entre o método de referência ea análise eletrônica na determinação da contagem de células somáticas do leite bovino. Arquivo Brasileiro Medicina Veterinária e Zootecnia, 57(1): 128 -132.17. Tangorra, F. M., M. Zaninelli, A. Costa, A. Agazzi and G. Savoini. 2010. Milk electrical conductivity and mastitis status in dairy goats: Results from a pilot study. Small ruminant research, 90(1): 109-113.
18. Tulsani, H. 2013. Segmentation using morphological watershed transformation for counting blood cells. IJCAIT, 2(3): 28-36.
19. Vallotton, P. and S. Olivier. 2013. Tri-track: Free Software for Large-Scale Particle Tracking. Microscopy and Microanalysis, 19(02): 451- 460.
20. Wu, H. S., J. Berba and J. Gil. 2000. Iterative thresholding for segmentation of cells from noisy images. Journal of microscopy, 197(3), 296-304.
21. Yin, P. Y. 2002.Maximum Entropy-Based Optimal Threshold Selection Using Deterministic Reinforcement Learning With Controlled Randomization.Sinal Processing, 82:993- 1006.
]]>