Preliminary phytichemical study and bioactivity of the plant Melochia Villosa from Amazonas State, Venezuela

Haydelba Trinidad D’Armas¹, Fátima Rodríguez², José Salazar¹

1 Universidad de Oriente, Núcleo de Sucre, Escuela de Ciencias, Departamento de Química, Laboratorio de Productos Naturales, Cumana, Venezuela,

2 Universidad de Oriente, Núcleo de Monagas, Unidad de Estudios Básicos, Departamento de Ciencias, Sección de Química, Maturín, Venezuela E-mail: htrinidad86@hotmail.com

RESUMEN

Se realizó un análisis fitoquímico preliminar para los extractos crudos de tallo, hojas y flores de Melochia villosa (Plantae: Sterculiaceae), recolectada en los alrededores de Puerto Ayacucho, estado Amazonas, Venezuela, así como también se aplicaron pruebas de actividad antimicrobiana y de letalidad contra Artemia salina. Las pruebas fitoquímicas evidenciaron la presencia de esteroles insaturados y triterpenos pentacíclicos en todos los extractos, con excepción del extracto alcohólico de las hojas (EALH); flavonoides solo en los extractos alcohólicos y fenilpropanoides en los extractos alcohólicos de las hojas y tallo (EALT). El extracto etéreo del tallo (EET) mostró actividad antibacteriana leve (halo de 7 mm) contra Staphylococcus aureus, mientras que el extracto etéreo de las flores (EEF) fue activo contra la misma cepa (halo de 9 mm), además de mostrar actividad leve contra Micrococcus luteus (halo de 8 mm) y moderada contra Enterobacter cloacae y Bacillus subtilis (halo de 10 mm). El EALH fue activo contra Escherichia coli, Acinetobacter calcoaceticus, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa. En las pruebas de actividad antifúngica, solo el EALT mostró actividad inhibiendo levemente la cepa de Fusarium poae. El EET exhibió una excelente actividad letal con una concentración letal media (CL50) de 2,06 μg/mL, seguido del EEF y el EALT con una CL50 de 10,00 μg/mL para ambos; el EALH tuvo una CL50 de 74,68 μg/mL y el extracto etéreo de las hojas con una CL50 de 169,10 μg/mL. Estos resultados permiten inferir, que esta planta es una fuente promisoria de metabolitos secundarios bioactivos.

Palabras clave: Sterculiaceae, actividad antimicrobiana, letalidad, metabolitos secundarios.

ABSTRACT

A preliminary phytochemical analysis was conducted of crude extracts of stem, leaves and flowers of Melochia villosa (Plantae: Sterculiaceae), collected in Puerto Ayacucho, Amazonas state, Venezuela, and antimicrobial activitytest and lethality test against Artemia salina were applied. Phytochemical tests showed the presence of unsaturated sterols and pentacyclic triterpenes in all extracts, with the exception of the alcoholic extract of the leaves (EALH), flavonoids only in the alcoholic extracts, and phenylpropanoids in the alcoholic extracts of the leaves and stem (EALT). The stem ether extract (EET) showed mild antibacterial activity (halo of 7 mm) against Staphylococcus aureus, whereas the ether extract of flowers (EEF) was active against the same strain (halo of 9 mm) besides of showing slight activity against Micrococcus luteus (halo of 8 mm), and moderate against Enterobacter cloacae and Bacillus subtilis (halo of 10 mm). The EALH was active against Escherichia coli, Acinetobacter calcoaceticus, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. Only EALT showed slightly antifungal activity against Fusarium poae strain. The EET exhibited excellent lethal activity showing a mean lethal concentration (LC50) of 2.06 μg /mL, followed by the EEF and EALT with a LC50 of 10.00 μg /mL for both; the EALH had a LC50 of 74.68 μg/mL and the leaves ether extract a LC50 of 169.10 μg/mL. These results allows to infer that this plant is a promising source of bioactive secondary metabolites.

Recibido: julio 2013. Aprobado: septiembre 2013. Versión final: octubre 2013.

INTRODUCCIÓN

Los productos naturales originados de las plantas pueden ser considerados como una fuente incalculable de nuevos compuestos químicos de uso potencial en la medicina (Compagnone et al. 1999).

Se ha reportado que los extractos de muchas plantas pertenecientes a la familia Sterculiaceae son usadas en la medicina tradicional. La familia comprende aproximadamente 68 géneros y 1.000 especies (Reid et al. 2005). Entre los géneros se encuentran: Waltheria, Melochia, Sterculia, Helicteres y Theobroma entre otros (Rondón y Cumana 2006).

Las plantas de esta familia son reconocidas por ser ricas en alcaloides y han sido usadas en la medicina tradicional para aliviar la inflamación de la cavidad orofaríngea, como agentes antitumorales, y para el tratamiento de la distensión abdominal, disentería y mordedura de serpientes (Dias et al. 2007). Melochia es uno de los géneros de esta familia, que está extendido en todo el trópico, entre éstos, Melochia corchorifolia y Melochia tomentosa, han sido las más investigadas, reportándose algunos flavonoides y alcaloides ciclopeptídicos para ambas especies (Tschesche y Reutel 1968, Kapadia et al. 1977, 1980, Bhakuni et al. 1986). Además, en otra investigación el extracto de la raíz de M. tomentosa, resultó ser cancerígeno, donde fueron reportados un alcaloide quinolinolico y una cumarina (Shukla et al. 1976).

En otro estudio reciente realizado a las hojas de M. tomentosa, proveniente de la localidad de Tocuchare, estado Sucre, Venezuela, se detectó la posible presencia de flavonoides y esteroles insaturados en los extractos metanólicos de las hojas y el tallo, así como también se detectaron saponinas, polifenoles y taninos en el extracto del tallo. El extracto de las hojas presentó actividad letal moderada y resultó inactivo frente a hongos y bacterias, mientras que el extracto del tallo presentó actividad contra varias cepas de bacterias y hongos, y una buena actividad letal, caracterizándose por primera vez un derivado amino y otro derivado acetilado de un esterol (Espinoza 2010).

Otra de las especies que ha sido estudiada fitoquímicamente, es la Melochia chamaedrys, la cual es usada en la medicina tradicional para el tratamiento de varias enfermedades como el cáncer y como agente anti–hipertensivo, donde se reportó el aislamiento de chamaedrina, un alcaloide ciclopeptídico de la raíz de esta especie (Dias et al. 2007). Melochia villosa es una hierba que se conoce comúnmente como “malva” o “hierba de San Juan”, y la decocción de su raíz se usa como desinfectante, para lavar la boca y recuperar el apetito luego de fiebres y resfriados (Rondón 2009). Dicha planta no ha sido estudiada químicamente, por tal motivo, se decidió realizar el estudio fitoquímico de la misma y evaluar su posible actividad biológica, aportándose así información valiosa al campo de los productos naturales.

MATERIALES Y MÉTODOS

Recolección de la muestra

Obtención de los extractos

Se dejó secar la planta a temperatura ambiente, se separaron las partes de la planta (hojas, tallo, flores y frutos), las cuales fueron molidas por separado en un molino eléctrico y extraído en éter dietílico para obtener los componentes menos polares. El filtrado fue concentrado a presión reducida (aprox. 11 mbar) en un rotaevaporador marca Hidolph, obteniéndose el extracto crudo en éter. El residuo se extrajo sucesivamente con etanol y metanol para extraer los componentes más polares, los filtrados se concentraron a presión reducida en un rotaevaporador y luego, se juntaron los extractos etanólicos y metanólicos obteniéndose de esta manera el extracto crudo alcohólico. Se determinó la masa de cada uno de los órganos de la planta M. villosa, y se realizó el proceso de extracción con éter dietílico y metanol.

Pruebas químicas

La presencia de las diferentes familias de metabolitos secundarios (alcaloides, esteroles, saponinas, triterpenos, polifenoles, entre otros) encontrados en los extractos obtenidos, se determinó utilizando las metodologías de análisis fitoquímico reportadas (Marcano y Hasegawa 2002, Murrillo y Méndez 2007), las cuales se basan en la caracterización química de los diferentes grupos funcionales que integran las estructuras de los metabolitos.

Pruebas biológicas

Actividad letal con Artemia salina

Para evaluar el nivel de toxicidad de los extractos crudos de la planta, se colocaron los quistes del crustáceo con agua de mar bifiltrada en un envase, para obtener los nauplios de Artemia. Se preparó 1 mL de una solución madre de 10.000 μg/mL del extracto, preparada disolviendo el extracto en la mínima cantidad posible de dimetilsulfóxido (DMSO) y completando hasta 1 mL con agua de mar bifiltrada. A partir de la solución madre, se prepararon soluciones diluidas de 1.000; 100; 10; 1; 0,1 y 0,01 μg/mL mediante diluciones sucesivas. A cada disolución se le agregaron 10 nauplios de A. salina eclosionados con anterioridad, y por cada concentración se realizaron tres réplicas del bioensayo. Se realizó un blanco con la misma mezcla de DMSO y agua de mar utilizada en la preparación de la solución madre. Se determinó la mortalidad de los nauplios transcurridas las 48 horas de la realización del bioensayo, y se anotó el número de organismos muertos en cada una de las concentraciones (Meyer et al. 1982). Se determinó la concentración letal media (CL50) mediante un programa estadístico (métodos Binomial, Logit y Probit) propuestos por Stephan (1977).

Actividad antibacteriana

Este bioensayo se realizó por medio de la técnica de difusión en agar, el cual consistió en impregnar discos estériles de papel de filtro Whatman Nº 3 de 5 mm de diámetro con 10 μL de una solución del extracto (40 mg/ mL). Dichos discos fueron colocados en una placa servida con agar Müller-Hilton, previamente sembrada con una suspensión bacteriana de concentración conocida (1 x108 bacterias/mL) e inoculadas con una suspensión bacteriana estandarizada por comparación con un patrón McFarland 0,5. Posteriormente, las placas fueron preincubadas a 5ºC por 12 horas, para luego ser incubadas a 37ºC por 24 horas. La acción antibacteriana se midió tomando el diámetro (mm) del halo de inhibición alrededor del disco (Bauer et al. 1966). Se utilizaron cepas de bacterias certificadas existentes en el Laboratorio de Productos Naturales (412) del Departamento de Química de la Universidad de Oriente, Núcleo de Sucre (Tabla 1).

Actividad antifúngica

Esta actividad se evaluó utilizando cepas de hongos patógenos y fitopatógenos proporcionados por los Laboratorios de Fitopatología y Microbiología del Departamento de Biología de la Universidad de Oriente, Núcleo de Sucre (Tabla 2). El método consistió en incubar las cepas de hongos seleccionadas en tubos por una semana a temperatura ambiente. Se agregó aproximadamente 10 mL de agua destilada estéril a cada tubo para remover las esporas, luego se filtró sobre gasa estéril, para obtener la solución esporangial de cada cepa incubada. La solución obtenida se sembró sobre cápsulas de Petri, previamente preparadas con agar Papa Dextrosa (PDA), usando hisopos estériles. Seguidamente, se impregnaron los discos de papel de filtro Whatman Nº 3 de 5 mm de diámetro con aproximadamente 10 μL de la muestra y se incubaron por 48 horas a temperatura ambiente. Dicha actividad se indicó mediante la aparición de halos de inhibición alrededor del disco, midiéndose tomando en cuenta su diámetro (mm) (Madubunyi 1995).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Según la revisión bibliográfica, Melochia villosa es una planta que no ha sido sometida anteriormente a estudios de tipo fitoquímico ni biológico, por lo que a continuación se presentan los resultados obtenidos en el análisis del extracto alcohólico de las hojas, así como también en los extractos alcohólico y etéreo del tallo.

Rendimiento porcentual de los extractos

Una vez obtenidos los extractos secos, se procedió a determinar las masas de los mismos y su respectivo rendimiento, obteniéndose así 1,0486 g del EEH, 0,3816 g del EET y 0,4638 g de EEF, con un rendimiento de 0,79%, 0,24% y 1,07% respectivamente. De igual manera, se logró obtener 3,5551 g del EALH, 1,8703 g del EALT y 1,5831 g del EALF, con un rendimiento de 2,69%, 1,16% y 3,65%.

Estos resultados muestran claramente, que la mayor parte de los compuestos presentes en la planta son de naturaleza polar, puesto que se obtuvo un mayor rendimiento en la extracción alcohólica; sin embargo, también hay presencia de compuestos poco polares con una menor abundancia en dicha especie. Según la literatura, se observó el mismo comportamiento en los extractos obtenidos de H. baruensis Jacq, H. guazumofolia Kunth, M. tomentosa y M. chamaedrys; sin embargo, cabe destacar que para M. tomentosa solo se realizaron extracciones metanólicas (Costa 2005, Tarache 2007, Espinoza 2010, Vázquez 2010).

Análisis fitoquímico preliminar

Los esteroles naturales por tratamiento con ácidos fuertes en condiciones de deshidratación, dan reacciones coloreadas que son útiles para su identificación preliminar (reacción de Lieberman-Burchard), por lo cual al agregar las gotas de dicho reactivo, se observó la aparición de una coloración verde intensa indicadora de la presencia de esteroles en los extractos analizados (Murrillo y Méndez 2007).

Los fenilpropanoides son sustancias aromáticas que tienen funciones oxigenadas (hidroxilos, metoxilos, metilendioxilos) en posiciones orto y/o para; están muy difundidos en el reino vegetal (Murrillo y Méndez 2007). Su presencia fue evidenciada mediante la aparición de la coloración naranja, característica del reactivo de Arnow frente a los fenilpropanoides.

La acción farmacológica de los flavonoides es extensa y variada, bien conocida por su actividad contra la fragilidad capilar, su acción antiesclerótica y antiedematosa, dilatadora de las coronarias, espasmolítica, antihepatotóxica, colerética, estrógena y diurética. Se destaca su actividad antimicrobiana; además que limitan la acción de los radicales libres (oxidantes), reduciendo el riesgo de cáncer y enfermedades cardíacas, refuerzan los vasos sanguíneos y bloquea la degeneración macular (Murrillo y Méndez 2007).

Al exponer los extractos ante los vapores de hidróxido de amonio y colocarlos bajo luz ultravioleta, se observó una fluorescencia que indicó la presencia de flavonoides. Cabe destacar, que es posible que los flavonoides detectados en los extractos de M. villosa, puedan provenir de la biosíntesis de los fenilpropanoides propios de dicha especie.

De acuerdo al porcentaje de extractos con metabolitos pertenecientes a la misma familia química (% emf), se pudo observar que el grupo de los esteroles insaturados y triterpenos pentacíclicos, fueron los más abundantes dentro del grupo de extractos analizados (83,33%), seguido por los flavonoides (50%) y en último lugar los fenilpropanoides (33,33%); lo que quiere decir, que son los esteroles y triterpenos un tipo de metabolitos bastante abundante en la planta M. villosa. De igual forma, según el porcentaje de metabolitos presentes por cada extracto (% mpe), se observó que el extracto alcohólico del tallo (EALT) fue el que mostró la presencia de la mayor cantidad de núcleos secundarios, seguido del extracto alcohólico de las flores (EALF), presentando el resto de los extractos una menor cantidad de los mismos (Tabla 4). Esto hace al EALT un extracto bastante promisorio para ser estudiado.

El hecho de no haberse detectado la presencia de algunas familias de metabolitos, no implica necesariamente la ausencia de los mismos, ya que es posible que éstos se hayan encontrado en concentraciones muy bajas para ser detectados, mediante las pruebas húmedas de determinación de núcleos secundarios.

Este estudio fitoquímico constituye un aporte importante a la quimiotaxonomía de M. villosa, ya que no existe en la literatura reportes de este tipo para dicha especie; además, se evidenció la presencia de esteroles insaturados, los cuales constituyen un grupo de metabolitos muy característicos de las plantas de la familia Sterculiaceae, puesto que según los reportes de la literatura, este tipo de metabolitos se encuentra presente en otras especies tales como H. baruensis Jacq (Tarache 2007), H. guazumifolia Kunth (Vázquez 2010) y M. tomentosa (Espinoza 2010). Adicionalmente, la presencia de flavonoides también fue detectada en M. tomentosa y Waltheria americana (Osuna et al. 2005), evidenciándose la presencia de este segundo grupo de metabolitos en algunas plantas de esta familia. El hecho de detectar en M. villosa la presencia de los mismos grupos de metabolitos secundarios reportados en varias plantas de la misma familia Sterculiaceae, es evidencia de la relación quimiotaxonómica de las mismas.

Actividad antibacteriana

Al evaluar la actividad antibacteriana de los extractos crudos de M. villosa, se detectó la intensidad de la misma, según el criterio de Monks et al. (2002), de actividad leve (halos entre 7 y 9 mm) en el extracto alcohólico de las hojas contra cinco de las cepas bacterianas, el extracto etéreo del tallo lo hizo contra una de las cepas (halo de 7 mm), mientras que el extracto etéreo de las flores inhibió el crecimiento (halos de 8 a 10 mm) contra cuatro de las cepas ensayadas (Tabla 4).

Según el análisis realizado, para la mayoría de los casos el efecto fue bactericida, es decir, no hubo proliferación de la bacteria en la región inhibida; sin embargo, en el extracto etéreo de las flores (EEF) se observó acción bacteriostática, es decir, hubo cierto crecimiento bacteriano dentro del halo de inhibición para las cepas de M. luteus (halo de 8 mm) y S. aureus subspaureus (halo de 9 mm). De igual manera, se observó este comportamiento al ensayar el extracto etéreo del tallo (EET) contra la segunda cepa antes mencionada, y al probar la acción del extracto alcohólico de las hojas contra E. coli, por lo que el efecto antibacteriano del extracto se considera menos potente para estos casos.

De acuerdo al porcentaje de extractos activos contra un mismo microorganismo (%eam), S. aureus (IBE (DOC-19)) fue el microorganismo sensible a la mayor cantidad de extractos, exhibiendo un 60,00% de inhibición de los mismos, a pesar que en alguno de ellos la acción antibacteriana fue bacteriostática. Esto quiere decir, que la mayor parte de los extractos provenientes de M. villosa están compuestos por metabolitos activos contra esta cepa de bacterias. Por su parte, la cepa de B. subtilis (ICTA-07) fue inhibida en 40,00% de los extractos ensayados, seguido de las P. aeruginosa (ATCC 27853), A. calcoaceticus (ATCC 23055) y E. coli (ATCC 25922), con 20,00%, lo cual significa que en comparación con S. aureus, estas cepas son más resistentes ante la acción de los metabolitos presentes en M. villosa.

Según el porcentaje de microorganismos sensibles a un mismo extracto (%mse), se observó que el extracto alcohólico de las hojas (EALH) presentó mayor actividad con 62,50%, seguido del extracto etéreo de las flores con 50,00% y finalizando con el extracto etéreo del tallo con 12,5%, siendo inactivo el resto de los extractos. Esto significa que el extracto alcohólico de las hojas, posee ciertos metabolitos que le confieren una mayor propiedad antibacteriana, este hecho lo convierte en un extracto bastante promisorio para ser estudiado. Cabe destacar, que para el EALH, la mayor parte de las cepas inhibidas fueron Gram-positivas mientras que para el EEF las cepas inhibidas fueron en su mayoría Gram-negativas, a excepción de E. cloacae; por su parte, para el EET la única cepa inhibida fue Gram-positiva. Se puede inferir que M. villosa ejerce un mayor efecto antibacteriano ante las cepas Gram-positiva.

Según los reportes de la literatura, los extractos metanólicos crudos de las hojas de H. guazumifolia Kunth (Vázquez 2010), presentaron actividad antibacteriana contra las bacterias M. luteus, E. cloacae, A. calcoaceticus y B. subtilis. Por su parte, la fracción etérea de las hojas de H. baruensis Jacq (Tarache 2007), presentó actividad bacteriostática leve a la bacteria Salmonella enteritidis, y la fracción clorofórmica mostró un efecto bactericida contra la misma, así como también mostró actividad leve contra Bacillus cereus. De igual manera, las hojas de W. americana (Osuna et al. 2005) evidenciaron actividad contra B. subtilis, S. aureus y P. aeruginosa, mientras que el extracto metanólico de la planta en general, fue también activo contra E. coli. Para M. tomentosa (Espinoza 2010), el extracto metanólico del tallo exhibió una actividad antimicrobiana considerable contra E. coli, M. luteus, S. aureus y P. aeruginosa. En concordancia con este hecho, se dice que M. villosa, al igual que otras plantas de la familia Sterculiaceae, presenta propiedades antibacterianas.

Actividad antifúngica

Al ensayar los distintos extractos de M. villosa contra cuatro cepas de hongos, solo se observó una actividad muy leve ejercida por el EALT frente a la cepa de Fusarium poae (Tabla 5).

Hay evidencia que las plantas de la familia Sterculiaceae poseen cierta actividad antifúngica; sin embargo, la actividad mostrada por M. villosa fue menos marcada que en los casos citados anteriormente.

Actividad letal

El efecto letal de los materiales en larvas de A. salina permite estimar la potencia para producir la muerte de células cancerígenas en cultivo de tejidos, matar insectos y/o ejercer efectos farmacológicos, puesto que existe una correlación directamente proporcional entre la mortalidad de las larvas de Artemia y la citotoxicidad frente a las células 9KB (carcinoma nasofaríngeo humano) y la línea celular 3PS (P388) (leucemia in vivo), medida en términos de concentración letal media CL₅₀ (a mayor mortalidad de larvas, menor CL₅₀ y viceversa) (Pino y Jorge 2010).

Al determinar el promedio de nauplios muertos a las 48 horas de haber sido expuestos a los diferentes extractos (Tabla 6), se utilizaron estos datos para calcular la concentración letal media (CL₅₀). El EET presentó una potente actividad letal con una CL₅₀ de 2,06 μg/mL, siguiendo en letalidad el EALT y el EEF con una CL₅₀ de 10,00 μg/mL, el EALH con 74,68 μg/mL; siendo el EEH el menos letal, con una CL₅₀ de 169,10 μg/mL (Tabla 7). Estos resultados muestran que M. villosa es una fuente potente de compuestos letales, encontrándose una letalidad moderada en las hojas, y fuerte en las flores y tallo, siendo éste último el órgano más letal de la especie, especialmente en sus compuestos menos polares.

La mayoría de los extractos ensayados con el crustáceo A. salina mostraron una muy buena actividad letal, por lo que posiblemente M. villosa sea una planta con propiedades promisorias para la inhibición del crecimiento de células cancerígenas. Este hecho concuerda con la literatura, la cual expone excelente actividad letal en otras especies pertenecientes a la familia Sterculiaceae, como por ejemplo, el tallo de M. tomentosa (Espinoza 2010), la raíz de M. chamaedrys (Costa 2005), las flores y los frutos de H. guazumifolia Kunth (Vázquez 2010) y las flores de H. baruensis Jacq (Tarache 2007).

CONCLUSIONES

El análisis fitoquímico preliminar, reveló en la mayoría de los extractos de M. villosa, la presencia de esteroles insaturados y triterpenos pentacíclicos; flavonoides en los extractos alcohólicos de flores, hojas y tallos, además de fenilpropanoides en los dos últimos. M. villosa presenta propiedades antibacterianas, ejerciendo un mayor efecto ante las cepas de bacterias Grampositivas; además de presentar una letalidad moderada en las hojas, y fuerte en las flores y tallo, pudiéndose inferir de esta manera que dicha planta es una fuente promisoria de metabolitos secundarios bioactivos.

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