Maribel Quintero^1,6, Alicia Rojas-Atencio², Ana Ruiz³, Maczy González³, Olga Briceño3, Karelis Urdaneta², Melvis Arteaga-Vizcaino⁴, Miriam Duerto⁵,Jenny Cañizales²

Universidad del Zulia, Facultad de Medicina, Escuela de Bioanálisis, Maracaibo, Venezuela

1 Cátedra Práctica Profesional de Hematología,

2 Instituto de Investigaciones Genéticas,

3 Cátedra de Hematología,

4 Instituto de Investigaciones Clínicas,

5 Instituto Hematológico de Occidente,

RESUMEN

Las leucemias agudas son proliferaciones malignas de células hematopoyéticas inmaduras de tipo blástico, cuya acumulación progresiva se acompaña de una disminución en la producción de los elementos mieloides normales. La transcripción inactiva de genes supresores de tumores por la hipermetilación de islas CpG en regiones promotoras, ha sido un foco de interés de los investigadores como un factor causal en malignidades hematológicas. El propósito del presente estudio fue determinar regiones hipermetiladas en muestras de extendidos cromosómicos mediante la utilización de Alu I y relacionarlas con sitios de genes supresores de tumores asociados con leucemias agudas. En este sentido, se analizaron 30 muestras de médula ósea, 18 con diagnóstico de Leucemia Mieloide Aguda y 12 con Leucemia Linfoide Aguda, a 12 de las cuales se les realizó cultivo celular. Los extendidos cromosómicos fueron teñidos con Giemsa, luego de ser previamente digeridos con la enzima Alu I. En los pacientes con leucemia mieloide aguda y leucemia linfoide aguda se observó que 16/18 (88%) y 12/12 (100%) presentaron regiones anormalmente teñidas, solo en cuatro y tres de las regiones metiladas observadas, en leucemia mieloide aguda y leucemia linfoide aguda, respectivamente, no se encontró asociación en la literatura con genes metilados, lo cual resultó altamente significativo (p < 0,01) en ambas patologías. Queda en evidencia la utilidad de esta técnica para la identificación de zonas metiladas, ya que las mismas han proporcionado el fundamento y las bases moleculares para un mejor enfoque terapéutico dirigido con agentes demetilantes tanto en leucemias agudas como síndromes mielodisplásicos.

Palabras clave: Metilación, leucemia mieloide aguda, leucemia linfoide aguda, tinción cromosómica.

ABSTRACT

Acute leukemias are malignant hematopoietic cells of immature proliferations of the blastic type, whose progressive accumulation is accompanied by a decrease in the production of normal myeloid elements. Transcription of inactive tumor suppressor genes by hypermethylation of CpG islands in promoter regions, has been a focus of researchers as a causal factor in hematological malignancies. The purpose of this study was to determine hypermethylated regions of chromosomal spread samples using Alu I and relate these regions with sites of suppressor gene associated to acute leukemia tumors. From an analysis of a 30 bone marrow samples, 18 were diagnosed with Acute Myeloid Leukemia and Acute Lymphoid Leukemia, and 12 underwent cell culture. Chromosomal spreads were stained with Giemsa after being previously digested with the enzyme Alu I. In patients with acute myeloid leukemia and acute lymphoid leukemia it was observed that 16/18 (88%) and 12/12 (100%) had abnormally stained regions, single in four and three methylated regions observed in acute myeloid leukemia and acute lymphoid leukemia, respectively, no association was found in the literature with methylated genes, which was highly significant (p < 0.01) in both conditions. This shows the usefulness of this technique for the identification of methylated areas, since they have provided the foundation and the molecular basis for a better targeted therapeutic approach with demethylating agents, both in acute leukemias and myelodysplastic syndromes.

Key words: Methylation, acute myeloid leukemia, acute lymphocytic leukaemia, chromosomal staining.

Recibido: mayo 2014. Aprobado: julio 2014. Versión final: agosto 2014.

INTRODUCCIÓN

Las leucemias agudas son proliferaciones malignas de células hematopoyéticas inmaduras de tipo blástico, cuya acumulación progresiva se acompaña de una disminución en la producción de los elementos mieloides normales, se dividen en enfermedades agudas y crónicas sobre la base de sus signos y síntomas de presentación, y el tipo celular involucrado. Las leucemias agudas se dividen desde el punto de vista citomorfológico en leucemia mieloide aguda (LMA) y leucemia linfoblástica aguda (LLA) (Sans et al. 2001). La incidencia de las leucemias agudas a nivel mundial es de 1 a 3 casos por cada 100.000 habitantes por año, y se observa un ligero predominio sobre el género masculino. La leucemia linfoide aguda (LLA) en el adulto constituye, aproximadamente, el 15-20% de las leucemias agudas, es principalmente una enfermedad de la niñez: la mayoría de los casos se produce entre los 2 y los 10 años. Si bien es rara en los adultos, el segundo pico en la incidencia se produce en los pacientes ancianos (Sans et al. 2001, Rodak 2004). La leucemia mieloide aguda (LMA) es la más común en los niños menores de 1 año. Es rara en niños mayores y adolescentes, y el segundo pico de incidencia se produce entre los adultos de 40 años. Su etiología es desconocida, siendo los factores genéticos los de mayor importancia (Sans et al. 2001).

En forma temprana durante el desarrollo embriológico, olas alternantes de metilación y demetilación programan el crecimiento celular y la diferenciación (Haaf 2006). Los patrones de metilación del ADN que se establecen durante este tiempo se mantienen relativamente estables en los tejidos normales. La metilación del nucleótido citosina es la única modificación conocida que ocurre de forma endógena en el ADN de los mamíferos y es debida a la adición enzimática de un grupo metilo al carbono en la posición 5 de la citosina. La mayoría de la 5´-metilcitosinas (5mC), en el ADN humano están presentes en los dinucleótidos 5´-CpG-3´ (citosina-fosfato-guanina, CpG) (Bestor 2000, Roman-Gómez 2005). Sin embargo, en células madres y células cancerosas, puede ocurrir la metilación de ADN previamente no metilado. Esta es la llamada metilación de novo y es preferencialmente mediado por ADN metiltransferasas (DNMT3a y DNMT3b) (Okano et al. 1999). El proceso que inicia este fenómeno es aún desconocido y en contraste con las alteraciones genéticas, estas modificaciones epigenéticas son fenómenos reversibles (Boultwood y Wainscoaut 2007).

El silenciamiento de la transcripción génica por hipermetilación de islas CpG en las regiones promotoras de los genes supresores de tumores es uno de los eventos epigenéticos fundamentales en la carcinogénesis, y es probablemente el mecanismo más común de inactivación de GST en cáncer (Knudson 2001). Un aspecto de extraordinaria importancia es el hecho de que existen metilación de genes diferentes para cada tipo de tumor, así por ejemplo los genes APC y p14 están mas relacionados con tumores gastrointestinales, mientras que p73, p15 o p21 son casi exclusivos de hemopatías, por otro lado, no siempre se encuentran los mismos genes metilados en cada uno de los pacientes afectados de un mismo tipo de cáncer, sino que existe variabilidad y esta variabilidad se ha señalado como factor pronóstico en cada uno de ellos (Román- Gómez et al. 2005).

La enzima Alu I es una endonucleasa de restricción la cual reconoce las secuencias ALU, estas son secuencia de ADN altamente repetidas que cubren aproximadamente el 10% del genoma humano siendo distribuidas de manera heterogénea, están presentes en aproximadamente 300.000-600.000 copias, encontrándose principalmente de un 3-6% en las regiones promotoras de los genes relacionados con cáncer (Mezzanotte et al. 1983, Baylin y Herman 2000). La enzima Alu I corta el ADN cromosómico a lo largo de los ejes (Bianchi et al. 1985). En citogenética, en los patrones de bandeo inducido por esta enzima se observa la distribución de los patrones de una secuencia normal altamente repetitiva del ADN Satélite; su sitio específico de reconocimiento es en las uniones citosina-guanina, donde existe una secuencia palindrómica especifica de reconocimiento conocida como 5´---AG CT---3´ 3´---TC GA---5´ (Bianchi et al. 1985, Bikle y Krüger 1993, Maniotis et al. 2005, Rojas-Atencio et al. 2012), al cortar con la enzima se visualizarían luego de la tinción, bloques claros, los cuales corresponderían a áreas no metiladas (Xiang et al. 2010). Una investigación anterior, identificó áreas metiladas del genoma humano relacionadas con cáncer de mama, observando más del 80% de áreas metiladas (Rojas-Atencio et al. 2012). Aprovechando esta propiedad, se planteó la utilización de la enzima Alu I, colocada sobre una lámina portaobjeto contentivo de una muestra cromosómica de pacientes con leucemias agudas; para la visualización de zonas oscuras que indicarían la presencia de regiones hipermetiladas en el genoma de pacientes con esta enfermedad.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se analizaron 30 muestras de médula ósea (MO) de pacientes de ambos sexos, 18 de ellos con diagnóstico de LMA y 12 con diagnóstico de LLA, con promedio de edad de 27 y 13 años respectivamente, referidas de los hospitales públicos y privados de la región zuliana de Venezuela, durante el período enero 2010 a diciembre 2012, y 30 muestras de médula ósea de pacientes de ambos sexos con un promedio de edad de 32 años, con enfermedades hematológicas no malignas como control para el bandeo con la enzima Alu I. El proyecto fue aprobado por el comité de ética del Instituto de Investigaciones Genéticas de la Universidad del Zulia y se obtuvo el consentimiento informado de cada uno de los pacientes. Las muestras de MO se extrajeron mediante aspiración a nivel esternal y todas pertenecían a pacientes que no se habían sometido a quimioterapia. Las muestras de MO se procesaron para cultivo cromosómico, siguiendo la técnica descrita por Yunis (1981), con una modificación importante representada en la utilización del medio de cultivo, Amniomax C-100 (Gibco, BRL). Obtenido el botón de células, se procedió a realizar los extendidos cromosómicos en láminas porta objetos, se dejaron secar a temperatura ambiente y luego se inicia la técnica de bandeo utilizada para la Alu I, descrita por Kaelbling et al. (1984) y Verma y Babu (1995). En cada uno de los porta objetos, que contenían las preparaciones cromosómicas, se colocaron 10 μL de la enzima Alu I, previamente preparada, siguiendo el protocolo de preparación recomendado por la casa del fabricante (Promega). Incubadas por 20 h a 37oC e inmediatamente fueron teñidas con Giemsa al 15% durante 2 minutos. Posteriormente se observaron al microscopio óptico para su análisis y verificar la variación en el bandeo de los cromosomas, las metafases fueron fotografiadas y visualizadas con el equipo computarizado de cariotipo (Software de Leica Chantal© 2010 Leica Microsystems Imaging Solutions Ltd). Se analizaron 20 metafases por paciente. Las regiones hipermetiladas localizadas en los cromosomas, según la región teñida, fueron llevadas a la base de datos del GenBank para identificar en la región metilada los genes comprometidos con leucemias agudas.

RESULTADOS

Se realizó la digestión de las muestras cromosómicas de los casos y los controles, observándose en los controles patrones normales de digestión, los cuales coinciden con la presencia de regiones centroméricas teñidas solo en los cromosomas 1, 9 y 16. En los pacientes con LMA se observó que 16/18 (88%) presentaron regiones anormalmente teñidas (Tabla 1), solo en cuatro de las regiones metiladas observadas no se encontró asociación en la literatura con genes metilados en LMA (Tabla 2). En 100% de los pacientes con LLA se encontraron regiones anormalmente teñidas (Tabla 3), solo tres de las regiones metiladas observadas no se encontró asociación en la literatura con genes metilados en LLA (Tabla 4), lo que resultó altamente significativo (p > 0,01) en ambas patologías.

DISCUSIÓN

En las últimas décadas, grandes avances han contribuido a un mayor entendimiento del proceso biológico de las células neoplásicas, que subyace al inicio y progresión de la enfermedad. Varios estudios evidencian cambios terapéuticamente reversibles en el nivel de expresión génica sin modificaciones en la secuencia del ADN (cambios epigenéticos), como son las alteraciones de la estructura de la cromatina mediada por metilación de los residuos de citosina en los dinucleótidos CpG, la modificación de histonas mediante acetilación o metilación y cambios en la estructuración jerárquica de la cromatina de orden mayor (Blum y Marcucci 2005, Reyes et al. 2011, Béguelin et al. 2012).

La transcripción inactiva de genes supresores de tumores por la hipermetilación de islas CpG en regiones promotoras; ha sido un foco de interés de los investigadores como un factor causal en malignidades hematológicas (Herman et al. 1997). Estudios moleculares han demostrado que alteraciones epigenéticas comparten un papel protagónico en el desarrollo de las leucemias agudas (Reyes et al. 2011). Apoyando el papel de la metilación del ADN en la patogenia de la leucemia aguda, los pacientes con genes metilados mostraron un período de tiempo más corto para el desarrollo de una leucemia secundaria relacionada con la terapia que los pacientes con genes no metilados (Uehara et al. 2003)

Las modificaciones epigenéticas podrían ser potencialmente útiles en el diagnóstico temprano de enfermedades, como factores pronósticos, predictores de respuesta al tratamiento farmacológico, de la evolución de la enfermedad, así como también blancos terapéuticos (Ross et al. 2005, Mesa-Cornejo et al. 2006, Béguelin et al. 2012).

Se ha demostrado que varios genes supresores de tumores presentan hipermetilación en las áreas promotoras en la LMA, por ejemplo, la metilación del gen p15 (Cyclin-dependent kinase inhibitor 2B) y p16 (Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A), constituyen datos de mal pronóstico en LMA (Ross et al. 2005). Esto es especialmente importante debido al creciente interés en el uso de los tratamientos con drogas demetiladoras. Aunque en sus inicios no siempre tuvieron como blanco la metilación, estas estrategias han demostrado eficacia en ensayos clínicos que han incluido pacientes con síndrome mieloproliferativo y LMA (Pinto y Zagonel 1993, Chim et al. 2001, Román-Gómez et al. 2005, Kantarjian et al. 2006, Reyes et al. 2011).

En las LLA, es donde mejor se encuentra caracterizada, la metilación específica de tumor. En los últimos años, se ha mostrado que la metilación de múltiples genes es un fenómeno común en las células LLA y constituye el mecanismo más importante para inactivar genes relacionados con el cáncer en esta enfermedad (Román- Gómez et al. 2002, 2005). Se ha sugerido cómo la hipermetilación del promotor puede participar en la patogénesis y el pronóstico de la LLA (Román-Gómez et al. 2003).

La identificación de zonas metiladas mediante el uso de enzimas de restricción, se inició en la década de los 90. Mediante esta técnica la combinación del tratamiento con bisulfito y amplificación con PCR, resultaba en la conversión de residuos de citosina no metilados a timina y residuos de citosina metilados a uracilo. Esta secuencia de metilación lleva a la creación de nuevos sitios de restricción enzimática; en estos casos se utilizó la enzima BstUI (CGCG) (Kannan et al. 1999, Sakashita et al. 2001).

Otro ejemplo de ello lo constituye las regiones teñidas presentes en el cromosoma 3 (3p21-p26) y (3q13-q22) observadas en LMA (Tabla 2), en la primera región descrita se encuentra localizado el gen RARB2 (receptor de ácido retinoico beta 2) y en la segunda región descrita se encuentra localizado el gen CRBP1 (retinol binding protein 1, celular) (Fig. 1), según la base de datos del GenBank (GenBank 2013).

Investigaciones anteriores, han reportado hipermetilación de las islas CpG en la región promotora de los genes supresores de tumor RARB2 y CRBPI en LMA (Román-Gómez et al. 2005). El estado de metilación del gen RARB2, se ha reportado en 20% y 27% por Galm et al. (2005) y Reyes et al. (2011), respectivamente. Por otro lado, Rethmeier et al. (2006), además de encontrarlo frecuentemente hipermetilado en LMA, lo asocia a la presencia de transcripciones de fusión CBFbeta-MYH11 (core binding factor, beta-myosyn, heavy chain 11).

El gen p15 (CDKN2B), corresponde a un inhibidor de ciclina dependiente de la quinasa, conocido por controlar el ciclo celular en la fase G1 temprana. La perdida de expresión de p15 se ha asociado con varios tipos de cáncer, pero es frecuentemente silenciado en LMA y síndrome mielodisplásico. La inactivación de p15 mediante hipermetilación ha demostrado ser uno de los mecanismos más frecuentes en LMA y se asocia a mal pronóstico de la enfermedad, sin embargo, hay grandes discrepancias en los valores de metilación reportados en la literatura que varían desde 31 a 93% (Toyota et al. 2001). Shimamoto et al. (2005), estudiaron un grupo de 61 pacientes japoneses con LMA, la metilación de esta región promotora fue detectada en el 51% de ellos, siendo considerada como de pronóstico desfavorable, demostrando según los autores la participación de este gen en una disfunción del ciclo celular que tiene un rol en la patogénesis de la LMA. Galm et al. (2005), consideraron el gen p15 como uno de los más frecuentemente metilados encontrándose en el 31% de los pacientes estudiados. Las islas CpG existentes dentro del promotor de p15, están hipermetiladas en aproximadamente 50-60% de los pacientes con leucemia promielocitica y se correlaciona negativamente con la supervivencia libre de enfermedad (Paul et al. 2010).

De igual forma, la hipermetilación de los islotes de CpG del gen p16 inhibidor de la quinasa dependiente de la ciclina A (CDKN2A), en su área promotora, ha sido demostrada como un mecanismo alternativo para la pérdida de expresión de p16. En LMA se han reportado valores discretos de metilación de p16, alrededor de un 10%, sin embargo, estudios en poblaciones asiáticas destacan con 50-80% de hipermetilación de p16 (Guo et al. 2000, Fan et al. 2007). A diferencia de Reyes et al. (2011), en Chile, donde no encontraron metilación de p16, apoyando la teoría que el rol en LMA no sería de mayor preponderancia dependiendo del tipo de población estudiada y su área geográfica.

Es importante resaltar, que tanto el gen p15 (CDKN2B) y p16 (CDKN2A), se encuentran localizados en el brazo corto del cromosoma 9, específicamente en la región 9p21, la cual coincide con la región anormalmente teñida (9p21-p24) encontrada en cinco casos de la presente investigación, lo que pudiera sugerir una estrecha relación entre la metilación de este gen, la zona anormalmente teñida en el cromosoma 9 y la presencia de LMA en estos casos.

La hipermetilación concurrente de múltiples genes en la LMA ha sido demostrada por varios grupos (Melki et al. 1999, Toyota et al. 2001, Galm et al. 2005, Reyes et al. 2011), ellos mostraron la inactivación por metilación de DAPK (death-associated protein kinase 1), MGMT (methilguanina-DNA methyltransferase), E-Cadherin (Cadherin 1, type 1), HIC-1 (hypermethylated in cancer 1), P53 (tumor protein 53), CEBPA (CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), alpha).

En la actual investigación, se hallaron zonas marcadas o anormalmente teñidas en cromosomas (Fig. 2), que coinciden con las regiones donde se encuentran localizados dichos genes (Tabla 2), lo que podría indicar también, una relación estrecha entre las zonas teñidas, los genes afectados por la metilación y la presencia de LMA.

García-Manero et al. (2002), en 80 pacientes estudiados, reportaron en LLA del adulto la metilación de los genes, MDR1 (binding cassette, sub-family B (MDR/ TAP), member 1), THBS2 (thrombospodin 2), MYF3 (myogenic differentiation 1), ER (estrogen receptor 1), p15, THBS1(thrombospodin 1), CD10 (membrane metallo-endopeptidase), C-ABL (C-abl oncogene 1, nonreceptor tyrosine kinase), p16 y P73 fue metilado en 17 de los 80 casos (21,2%). Un total de 86,2% de los casos tenía metilación de al menos un gen, y 42,5% tenían metilación de tres o más genes. Otros estudios, han reportado en LLA metilación en los genes RSPO1 (R-spondin 1), P21 (cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, Cip1)), MGMT (metilguanina-DNA methyltransferase), CALCA (calcitonin-related polypeptide alpha), P57 (cyclindependent kinase inhibitor 1C) (Barrios García et al. 2005, Boultwood y Wainscoaut 2007, Kuang et al. 2008).

Grupos de investigadores, ha analizado el estado de metilación de 15 genes en 251 pacientes afectados de LLA, ellos observaron, que la metilación simultánea de un elevado número de genes se asoció a una significativa reducción de la supervivencia libre de enfermedad y supervivencia general, tanto en niños como en adultos. Esto sugiere que el patrón de metilación es un nuevo marcador de riesgo en la LLA y que puede complementar los análisis inmunofenotípicos, citogenéticos y moleculares habituales (Román-Gómez et al. 2001, Román-Gómez et al. 2002, 2003, 2005).

En la actual exploración, se detectaron zonas anormalmente teñidas, en cromosomas de pacientes con LLA (Tabla 4), las cuales coinciden con regiones donde se encuentran localizados genes que han sido descritos como genes metilados en LLA, así tenemos, P73(1p36.3), RSPO1(1p34.3), FHIT(3p14.2), p21(6p21.2), ASSPP1, ER(6p25), MDR1(7q21.12), p15(9p21), p16(9p21), MGMT(10q26), CALCA(11p15.4), MYF3( 11p15.4), p57(11p15.5) (GenBank 2013), lo que pudiera indicar una precisa relación entre las zonas anormalmente teñidas, la metilación de estos genes y la presencia de LLA en estos casos.

Las zonas anormalmente teñidas e identificadas en este estudio no se observaron en los pacientes con enfermedades hematológicas no malignas (controles), aumentando la posibilidad que las zonas teñidas estén muy relacionadas con la presencia de genes metilados reportados en leucemias agudas.

CONCLUSIONES

Por los anteriores hallazgos, se asume que el bandeo cromosómico con la enzima Alu I podría resultar una excelente herramienta para la valoración inicial de los pacientes con LMA Y LLA, lo que permite visualizar en forma general el genoma total del individuo, observar las áreas metiladas que se presenten y dirigir la confirmación molecular de forma más concreta. El bandeo cromosómico con la enzima Alu I, representa una técnica de diagnóstico económica, comparada, con técnicas de diagnóstico de biología molecular, como, la amplificación de ADN por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (combinación del tratamiento con bisulfito), y la metilación específica de genes, que por su alto costo no forman parte de los estudios de rutina en pacientes con LMA y LLA en Venezuela. En un futuro esta identificación permitiría dirigir terapias específicas a cada uno de los pacientes. Se sugiere la confirmación molecular de estas áreas metiladas que permitan corroborar estos hallazgos y, de esta manera, pueda ser utilizada como una técnica rutinaria en estos pacientes.

AGRADECIMIENTOS

Esta investigación fue financiada por el Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad del Zulia (CONDES), a través del proyecto de investigación VAC-CONDES-CC-0570-11. Los autores agradecen la dotación de materiales reactivos y equipo necesario para la ejecución de este trabajo de investigación.

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