Proteína de estrés de 47 kda expresada en el riñón de alevines de Colossoma macropomum expuestos a cadmio
Stress protein of 47 kda expressed in the kidney of juveniles of colossoma macropomum exposed to cadmium
Raquel Salazar-Lugo, Maria Cordero, Yanet Antón, America Vargas, Mairín Lemus
Universidad de Oriente, Núcleo de Sucre, Escuela de Ciencias, Postgrado de Biología Aplicada, Laboratorio de Proteínas e Inmunotoxicidad, Cumaná, Venezuela E-mail: raquelugove@yahoo.com
RESUMEN
El objetivo de la presente investigación fue evaluar el efecto del cd, la temperatura de 35ºc y la combinación de ambos (cd/35ºc) sobre el perfil de proteínas en el riñón de alevines del pez dulce acuícola Colossoma macropomum; así como comparar los posibles cambios en el patrón de proteínas del tejido expuesto a estas condiciones. Un grupo de alevines se expuso por 21 días a 0,01 mg/L de Cd, y durante 8 días a 35ºC de temperatura; otro grupo se expuso durante 8 días a Cd/35ºC. Finalizada la exposición, los peces fueron sacrificados y disecados para obtener el riñón y realizar el perfil de proteínas. La fracción citoplasmática de las células renales se obtuvo por centrifugación diferencial y se determinó la concentración de proteínas totales por el método de Bradford; los perfiles de proteínas fueron obtenidos por electroforesis SDS-PAGE, reveladas y cuantificadas con el programa QuantityOne. Los resultados indicaron que la exposición a Cd indujo algunos cambios en el comportamiento de los alevines. En términos generales se evidenció disminución del apetito y los peces expuestos a 35°C y a Cd/35°C manifestaron cambios en la respuesta de huida y en forma particular se observaron hambrientos. El perfil electroforético reveló la inducción de una proteína de 47 kDa en los peces expuestos a Cd, mientras que el grupo expuesto a Cd/35ºC presentó un aumento significativo en la concentración de proteínas totales. El Cd induce la expresión de una proteína de estrés de 47 kDa en el riñón de alevines de C. macropomum.
Palabras clave: Toxicidad renal, metales pesados.
ABSTRACT
The purpose of this study was to evaluate the effect of cadmium, a temperature of 35º C and both Cd and temperature (Cd/35ºC), on the kidney protein profile of juveniles of the freshwater fish Colossoma macropomum; as well as to compare possible changes in the protein pattern of kidney exposed to these conditions. A group of fish was exposed for 21 days at 0.01 mg/L of Cd and for 8 days at 35°C; another group was exposed for 8 days to Cd/35ºC. After exposure, the fishes were sacrificed and dissected to extract the kidney to determine the protein profile. Kidney cytoplasmic fraction was obtained by differential centrifugation and protein concentration was determined by the Bradford method; protein profiles were made by eletrophoresis SDS-PAGE, revealed and quantified using the QuantityOne program. Exposure to Cd induced changes in the behavior of C. macropomum juveniles. In general terms, a decreased of appetite was evident and fish exposed to 35º and Cd/35º C showed changes in the escape response and were observed hungry. Electrophoresis profile revealed the induction of 47 kDa protein in fish exposed to Cd, while the group of fish exposed to Cd/35ºC showed a significant increase in total protein concentration. Cadmium induces the expression of 47 kDa stress protein in C. macropomum kidney.
]]> Key word: Renal toxicity, heavy metals.Recibido: febrero 2014. Aprobado: noviembre 2014. Versión final: enero 2015.
INTRODUCCIÓN
Los peces, al igual que otros organismos, responden a las altas temperaturas sintetizando proteínas de estrés conocidas como proteínas de choque térmico. Otros estresores ambientales como los metales pesados pueden inducir la expresión de estas proteínas (Abdel-Gawad y Khalil 2013). En los ríos venezolanos los metales pesados han sido reportados en cantidades moderadas en peces y otras especies (Salazar 2009). El estudio de los efectos adversos de la acumulación de metales en los peces, está bien documentado (Chowdhury y Wooda 2007). Los principales órganos donde se acumulan son el riñón e hígado; causando cambios importantes en los niveles de proteínas totales (Dautremepuits et al. 2009).
La cachama Colossoma macropomun (Characidae) es especialmente apetecida por su calidad alimentaria; la acuicultura de ésta se ha desarrollado notablemente en el país mediante la reproducción artificial o inducida, multiplicándose así su comercialización. Este pez es originario de la cuenca del Orinoco, desde donde se distribuyó a la Amazonia (Useche 2000). Estudios sobre las respuestas hematológicas e inmunológicas y bioquímicas de C. macropomum a la toxicidad inducida por Cd han sido documentados (Salazar-Lugo et al. 2013, Vargas et al. 2013). Así, las evaluaciones realizadas en las crías de esta especie en ambientes naturales indican que pueden tolerar concentraciones moderadas de Cd (Salazar-Lugo 2009). Estas observaciones sugieren la activación de sistemas proteicos para contrarrestar el estrés inducido por la exposición al metal. Por otro lado, la evaluación del efecto de la temperatura sobre algunos tejidos de la cachama determinó que el tejido renal expuesto a la temperatura de 35ºC, presentó lesiones severas (Rojas et al. 2013). Debido a que uno de los principales tejidos blanco del Cd, en el pez, es el riñón y que este órgano es sensible a temperaturas elevadas; en este trabajo se evaluó la capacidad de inducción de proteínas de estrés en el riñón de alevines de C. macropomum expuesto a Cd, a la temperatura de 35ºC y a una combinación de estos dos factores.
MATERIALES Y MÉTODOS
Población
Se emplearon alevines de C. macropomun, que fueron provistos por la empresa Alma C.A. (ALMACA), ubicada en la localidad de Campo Mata, estado Anzoátegui. Los peces se trasladaron en bolsas plásticas con agua y oxígeno debidamente sellados hasta el Laboratorio de Proteínas e Inmunotoxicidad, Postgrado de Biología Aplicada, de la Universidad de Oriente, Núcleo de Sucre, Cumaná, estado Sucre.
Manejo y aclimatación de los peces
En el laboratorio, las bolsas con los peces fueron colocadas en tanques preparados con agua declorada y aireada para permitir su ambientación en un medio libre de microorganismos patógenos que pudieran afectar a los organismos. Con este propósito, al agua aireada se le agregó azitromocina (500 mg cada 15 litros) y cloranfenicol (75 mg cada 15 litros) en cada cambio de agua. Durante el tiempo de aclimatación, se realizaron recambios de agua declorada entre el 75 y el 80% del volumen total y los organismos fueron alimentados con una dieta correspondiente al 40% de su peso corporal dividida en dos raciones diarias. Finalizado el tiempo de aclimatación de 30 días, los peces fueron considerados aptos para someterse a bioensayos de toxicidad.
]]> Bioensayo subletalEl ensayo subletal se realizó considerando una dosis subletal por debajo del 10% de la concentración letal media (38,47 mg/L de Cd) y que garantizó el 100% de viabilidad (Salazar-Lugo et al. 2013):
El protocolo experimental consideró un número total de 42 animales, divididos en los siguientes grupos: 10 peces grupo control; 12 peces expuestos a Cd/21 días; 10 peces expuestos a 35ºC/8 días; 10 peces expuestos a Cd/35ºC/8 días. Para los ensayos con Cd se empleó una concentración final de 0,01 mg/L que fue colocada en los acuarios correspondientes, y para mantener la temperatura se emplearon equipos calentadores termostatos digitales marca Elite de 150W. Diariamente, se mantuvo un registro de la temperatura del agua, utilizando un termómetro marca Hanna, igualmente se realizaron mediciones de pH del agua que se mantuvo entre 7,0-7,3 y la temperatura entre 29-30ºC. Los peces se alimentaron siempre en la mañana. La iluminación artificial se redujo envolviendo los acuarios con bolsas negras para no alterar su comportamiento. Se llevó un registro cualitativo diario del comportamiento de los peces considerando los siguientes aspectos: desplazamiento, respuesta a estímulos externos y apetito.
Obtención de la muestras de tejido
Una vez cumplido el tiempo de exposición, los peces se sacrificaron y se procedió a realizar la disección para extraer el riñón. El tejido se mantuvo refrigerado a -20ºC hasta su posterior procesamiento. A 1 g del tejido se agregó 2,5 mL de buffer de lisis (ditiotreitol 0,5 mol/L, ácido etilendiamino tetraacético 1,0 mol/L, hidroximetil aminometano 10,0 mol/L y 100,0 μL de fluoruro de fenilmetilsulfonilo) y se procedió a su homogenización con un triturador eléctrico, manteniendo el tejido en un envase con hielo para evitar la desnaturalización de las proteínas. El homogenizado se centrifugó a 300 g por 15 minutos a 4ºC, se tomó el sobrenadante y este se centrifugó a 3.200 rpm por una hora a 4ºC en una ultracentrífuga refrigerada marca Hermle Z 383. El sobrenadante resultante se tomó como la fracción citoplásmica.
Cuantificación de proteínas
Las proteínas citoplásmicas fueron cuantificadas mediante el método de Bradford (1976), utilizando como estándar albúmina bovina (10 mg/mL); el resultado se expresó en μg/mL de proteínas de tejido húmedo.
Separación de las proteínas por electroforesis SDSPAGE
Las proteínas de la fracción citoplásmica se separaron por electroforesis en geles de poliacrilamida-sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE) al 12% de acuerdo a Laemmli (1970). Se tomaron 20 μg/μL de proteínas para la electroforesis y los marcadores de alta masa molecular de BIO-RAD. Una vez finalizada la electroforesis, se procedió a colorear el gel con azul brillante de comassie para visualizar las bandas.
La diferentes fracciones de las proteínas visualizadas, una vez reveladas con azul de comassie, en un sistema de documentación de geles “Gel doc XR” (BIO-RAD) y cuantificadas con el programa QuantityOne, que permitió determinar la masa molecular relativa.
]]> RESULTADOSEl comportamiento de los peces fue afectado tanto por la exposición a Cd como por el incremento de la temperatura. Los peces expuestos a Cd se observaron con una disminución del apetito que se hizo más evidente la última semana de exposición (Tabla 1 A-B). A diferencia de esto, los peces expuestos a 35°C y a 35°C/ Cd manifestaron cambios en la respuesta de huida y se observaron hambrientos desde el primer día de exposición. (Tabla 2 A-B), disminuyendo su viabilidad a los 10 días de exposición por lo que se procedió a su análisis hasta los 7 días.
Perfil electroforético de proteínas
El perfil electroforético de las proteínas extraídas de la fracción soluble del riñón de C. macropomun revela que la banda de masa molecular aproximada de 50 ± 10 KD sufrió un incremento en el caso de los peces expuestos a Cd (Fig. 1). El análisis de la banda determinó que su incremento fue de 18% por encima de lo observado en el control; para los otros grupos evaluados, este incremento fue de 3,77% en los peces expuestos a Cd/35ºC y 35ºC.
DISCUSIÓN
La exposición subletal a Cd y a la temperatura de 35°C de alevines de C. macropomum afectó el comportamiento del pez siendo el rasgo más resaltante la disminución del apetito, aunque esto se observó la última semana de exposición (Tabla 1A-B). Este comportamiento se ha observado en otros peces expuestos a Cd y puede conducir a la muerte por inanición (McGeer et al. 2000, Eissa et al. 2010).
Al contrario, los grupos de peces expuestos a 35°C y a 35°C/Cd incrementaron el apetito durante el tiempo de exposición. La temperatura es un factor que afecta directamente el metabolismo de los animales, a medida que esta aumenta, también aumenta la tasa metabólica y la demanda energética, por lo cual, el organismo consume una mayor cantidad de alimento, provocando que la tasa de crecimiento también se vea incrementada (Martínez et al. 2009).
]]> El perfil electroforético de las proteínas del riñón excretor de C. macropomun indican el incremento de una banda de aproximadamente 47 kDa en los peces expuestos a Cd, Cd/35°C y 35°C (Fig. 1), encontrándose mayormente expresada en el grupo expuesto a Cd, esta misma proteína se sobre expresa en el riñón excretor.El Cd ejerce una acción negativa sobre el metabolismo del colágeno. El colágeno constituye una familia de proteínas extracelulares que comienzan su montaje dentro del lumen del retículo endoplasmático y posteriormente son secretadas por la célula. Los colágenos de tipo I al V se unen a una proteína localizada en el retículo endoplásmico, es una chaperona molecular específica de 47 kDa, HSP47 (Hagiwara et al. 2007). La proteína de choque térmico 47, una glicoproteína de colágeno que desempeña un papel importante en el tratamiento y la secreción de procolágeno, asimismo están implicadas en el control de la apoptosis y migración celular (Vasques et al. 2010, Ishida y Nagata 2011). De ser esta proteína la que se encuentra incrementada en este pez expuesto a Cd podría explicar uno de los mecanismos implicados en el efecto del Cd en órganos como el riñón y el hígado.
Los resultados obtenidos en este trabajo indican que la exposición de alevines de C. macropomum a Cd indujo cambios en el comportamiento de este organismo, y la expresión de una proteína de choque térmico de 47 kDa en el riñón.
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