COMPARISON OF THE HYPOGLYCEMIC EFFECT BETWEEN THE PLANTS Azadirachta indica AND Eucalyptus camaldulensis IN HUMAN BLOOD CELLS

N UBILDE M ARTÍNEZ 1,2 , Y AMILETH R ODRÍGUEZ 2 , L UIS P ÉREZ - Y BARRA 3 , C ARLOS E SPINO 1,2

Universidad de Carabobo, Sede Aragua, Facultad de Ciencias de la Salud,

1 Escuela de Medicina , 2 Instituto de Investigaciones Biomédicas - BIOMED - UC ,

3 Escuela de Bioanálisis, Maracay, Venezuela E - mail: Lmpy2005@gmail.com

RESUMEN

Entre las plantas medicinales más utilizadas a nivel popular se encuentran aquellas que poseen efecto hipoglicemiante, tales como Azadirachta indica y Eucaliptus camaldulensis, que se encuentran distribuidas ampliamente en el territorio venezolano. El objetivo de esta investigación fue comparar el efecto hipoglicemiante de A. indica y E. camaldulensis utilizando soluciones acuosas de cada planta, en células sanguíneas humanas en un medio normoglucémico. Se utilizaron soluciones acuosas en concentraciones de 6,4% m/v, en dosificaciones de 0,01; 0,05; 0,1; 0,175; 0,5; 0,7 y 1,4 g/dL, para cada planta, y se midió la concentración de glucosa a los 0, 90, 210, 300 y 600 seg. Se utilizó insulina (Humulin®) en concentraciones de 0,1; 1 y 10 nM, como control, para comparar su efecto con el de las soluciones acuosas. Los resultados se analizaron utilizando el análisis de varianza y la prueba de comparaciones de medias de Tukey. Los resultados indican que hubo un mayor efecto hipoglicemiante con respecto al control para la solución de A. indica ( p = 0,0074) . Este efecto se evidenció de manera significativa ( p = 0,0349) en las dosis altas 0,7 y 1,4 g/dL . A dicionalmente , se observó un aumento notable del efecto hipoglicemiante a partir de 210 seg hasta 600 seg ( p < 0,0001). La solución acuosa de E. camaldulensis, mostró un comportamiento inconsistente y de efecto inferior al control, no evidenciándose su efecto hipoglucemiante. Se concluye que el efecto hipoglicemiante de extratos de A. indica quedó evidenciado, no observándose en los de E. camaldulensis .

Palabras clave : Eucalipto , Neem, leucocitos humanos.

ABSTRACT

Key words: Eucalyptus, Neem, human leukocytes.

Recibido: julio 2015 . Aprobado: diciembre 2015 . Versión final: marzo 2016.

INTRODUCCIÓN

La Azadirachta indica A. Juss (también conocida como Neem) y el Eucalyptus camaldulensis Dehn ( Eucalipto Rojo) son árboles que se encuentran ampliamente distribuidos en el territorio venezolano y que son utilizados de manera empírica para el tratamiento de la d iabetes m ellitus [DM] (Urdaneta 2001, Martínez et al . 2014 a ).

Si bien se ha analizado el efecto hipoglucemiante de las plantas A . indica y E . camaldulensis, la mayoría de las investigaciones se han realizado en animales de experimentación, siendo la planta A. indica una de las más estudiadas, sola o en combinación con otras plantas que le atribuyen posibles efectos hipoglucemiantes ( Swanston - Flatt et al. 1990, Halim 2003 , Mahdi et al. 2003 , Gholap y Kar 2004 ) .

Existen antecedentes de ensayos para estudiar el efecto hipoglucemiante de soluciones acuosas de plantas en estudios in vitro con células sanguíneas humanas . Rojo et al. (2002) investigaron el efecto hipoglucemiante de la planta Petiveria alliacea L . en una suspensión de eritrocitos , sin observar cambios en el consumo de glucosa por parte de las células eritrocitarias. Martínez et al. (2010) ensayaron con la planta Bixa o rellana in vitro , empleando una suspensión de leucocitos en un medio hiperglucémico, obteniendo resultados que revelan un aumento en el consumo de glucosa utilizando dosis bajas (0,1 y 0,175 mL ) de la solución acuosa en los primeros minutos de reacción ( p < 0,0091). Martínez et al. ( 2014b ) ensayaron con la planta Azadira chta indica in vitro , empleando una suspensión de leucocitos en un medio normogl u cémico, obteniendo resultados que revelan un aumento en el consumo de glucosa durante los primeros 10 minutos del ensayo utilizando dosis altas (0, 7 y 1 , 4 m g ) de l extracto acuoso.

En esta investigación se compar ó el efecto hipoglucemiante in vitro de las plantas A. indica y E. camaldulensis , utilizando para ello medios que conten ían células sanguíneas humanas , glucosa y soluciones acuosas elaboradas a partir de las hojas de dichas plantas, a fin de establecer similitudes y diferencias entre el efecto hipoglucemiante in vitro de las mismas.

MATERIALES Y MÉTODOS

La muestra vegetal de la planta A. indica se obtuvo de un árbol localizado en el jardín de la Universidad de Carabobo S ede Aragua, y la muestra vegetal de la planta E. camaldulensis se recolectó en el Parque Ecológico Universitario “Simón Bolívar” , en la Universidad Central de Venezuela, N úcleo Aragua . Ambas muestras estuvieron co nstituidas por hojas, que se certificaron en el herbario “Víctor M. Badillo” de la Facultad de Agronomía, Universidad Central de Venezuela, Núcleo Aragua.

Procesamiento de la muestra vegetal

Las hojas fueron lavadas , secadas a temperatura ambiente y llevadas a una estufa a 45°C durante 24 horas . L uego se trituraron por separado en un mortero y se colocaron en un m olino de bolas durante seis horas para obten er un polvo finamente pulverizado.

Preparación de la solución acuosa

Se disolvieron 32 g del material vegetal pulverizado de cada una de las plantas, en 500 m L de solución salina al 0,9%, llevándose a cocción durante treinta minutos en una plancha de calentamiento a una temperatura de 150°C. Las soluciones se prepararon por separado, se dejaron enfriar a temperatura ambie nte, y se dividieron en fracc iones pequeñas, luego fueron centrifugadas durante 10 minutos a 3 . 000 rpm. Los sobrenadantes se filtraron con papel Whatman Nº 2, se almacenaron y conservaron las muestras a - 20°C. Las concentraciones de las soluciones fueron de 6,4% m/v (6,4 g/dL) , a partir de las cuales se prepararon las siguientes dosis de las soluciones acuosas: 0,01; 0,05; 0,175; 0,5; 0,7 y 1,4 g/d L .

Separación de leucocitos mediante centrifugación

Se extrajeron 5 mL de sangre venosa del antebrazo de donantes voluntarios s anos que estuvieron de acuerdo en participar en la investigación mediante la aceptación del consentimiento informado, y se colocaron en un tubo de ensayo con anticoagulante ácido etilendiaminot etra acético (EDTA), se tomaron 4 mL de sangre de cada una de la s muestras y se utilizaron para la s eparación de leucocitos y el m ililitro restante se tomó como control sin centrifugar.

Para la separación de leucocitos se centrifugaron 4 m L de sangre durante 5 minutos a 2 . 700 rpm con un rotor JA - 20, marca Beckman®, se descartó el plasma y se tomó 1 mL de la primera capa de células, en donde se concentra la mayor parte de los leucocitos, luego se dividió en dos alícuotas de 50 0 μ L (A y B), estas fueron lavadas con 600 μL de tampón fosfato salino para eliminar los rest os de plasma. El contaje de células se realizó en un analizador hematológico marca Mindray BC - 2300.

Para los ensayos de consumo de gluco sa se seleccionó la alícuota (A o B), en donde se obtuvo la mayor concentración de leucocitos , extrayendo de ésta el volumen adecuado que contuviera 10 6 leucocitos.

Los ensayos de consumo de glucosa se realizaron empleando diferentes volúmenes de las soluciones acuosas de la A. indica y del E. camaldulensis , y se utilizó insulina como control, por ser el hipoglucemiante endógeno más potente ( González et al. 2011, Rodríguez y Salguero 2011 ) , pero manteniendo siempre un medio normogl u cémico con volumen constante de 1 mL, tal como se describe a continuación .

Se incubaron las muestras de 10 6 leucocitos a 37°C, durante un tiempo comprendido entre 0 y 10 minutos en 6 00 μ L de un medio iónico apropiado ( Hepes - KOH 20 mM pH 7,5, t ampón f osfato 5 mM, pH 7,5; KCl 2,5 mM, NaCl 70 mM y Mg 2 SO 4 2,5 mM ) , bajo condiciones normogl u cémicas , lo cual se obtuvo agregando 55 μ L de solución de glucosa 0,1 M, equivalente a 99 mg/dL para un volumen final de 1 mL . Adicionalmente , se agregó insulina Humulin® en concentraciones de 0,1; 1 y 10 nM para los controles, y para los tratamientos, las soluciones acuosas de las plantas A. indica y E. camaldulensis en concentraciones de 0,01; 0,05; 0,175; 0,5; 0,7 y 1,4 g/d L , para lo cual se agregaron 1,6; 8; 27; 78; 109 y 219 μ L de la solución madre al 6,4% m/v, respectivamente, los volúmenes faltantes para alcanzar 1 mL se completaron con agua destilada ( T abla 1 ) .

Una vez iniciada la incubación, se tomaron alícuotas de 40 μ L de cada uno de los ensayos, en tiempos sucesivos desde el inicio (0 minutos) hasta 10 minutos (0; 1,5; 3,5; 5 y 10 minutos), centrifugándose a 4 . 000 rpm durante 2 minutos en una microcentrífuga Eppendorf® 5415, luego se tomaron 5 μ L del sobrenadante y se mezcl aron con 500 μL del reactivo de glucosa (Bio science) siguiendo las instrucciones del fabricante y posteriormente, se registraron las absorbancias de los diferentes medios en un espectrofotómetro Beckman® DU 650.

Determinación de la concentración de glucosa

La cuantificación de glucosa se realizó utilizando el método de Trinder (Barham y Trinder 1972) .

Análisis estadístico

 Los ensayos se realizaron utilizando un arreglo de factorial de tratamientos, donde el primer factor lo constituyeron las plantas A. indica y E. camaldulensis , y el segundo factor lo constituyeron las dosis de las soluciones (0,01; 0,05; 0,175; 0,5; 0,7 y 1,4 g/d L ), en un diseño en bloques al azar, siendo los bloques los donantes de los cuales se extrajeron las muestras sanguíneas, adicionalmente las variables se midieron en los instantes 0, 90, 210, 300 y 600 segundos, (0; 1,5; 3,5; 5 y 10 minutos ). Sobre este arreglo se aplicó el análisis de varianza de un diseño en parcelas divididas, siendo la parcela principal las combinaciones de tratamientos de las plantas y las concentraciones de las soluciones acuosas, y la parcela secundaria las observaciones medidas a través del tiempo. Asimismo, las comparaciones de medias se llevaron a cabo utilizando la prueba de comparaciones múltiples de Tukey, y las interacciones se analizaron de forma gráfica. Los análisis se llevaron a cabo utilizando los programas estadísticos SAS 9.2, Minitab 16.0 y Statistix 9.0, bajo ambiente Windows.

Consumo de glucosa

El análisis de varianza mostró que no hay diferencias significativas para el consumo promedio de glucosa según la planta utilizada ( p = 0,2708), ni para las concentraciones de la solución acuosa ( p = 0,8282), ni para la interacción planta×solución acuosa ( p = 0,9989); sin embargo, sí se encontraron diferencias significativas a través del tiempo ( p < 0,0001) (Tabla 2), y para la interacción planta×tiempo ( p = 0,0137) (F ig . 1), las interacciones solución acuosa×tiempo ( p = 0,8052) y planta×solución acuosa×tiempo ( p = 0,9510), fueron no significativas.

La concentracion de glucosa presentó tendencia a disminuir a través del tiempo (Fig.1) , la reducción fue más marcada y estable para la planta A. indica , lo cual indicó que el efecto hipoglucemiante fue mayor que el de E. camaldulensis , asimismo, la concentración de glucosa fue estadísticamente igual en los primeros instantes del ensayo, pero presentó una reducción significativa a partir de los 210 segundos del ensayo (Tabla 2 ) .

En la Figura 2 se compara la acción de las dosis altas de las soluciones acuosas de las plantas E. camaldulensis y A. indica en los diferentes tiempos de reacción. Al utilizar la concentración más alta de la solución acuosa (1,4 g/d L ) de E. camaldulensis, se pudo observar un descenso en los niveles de glucosa en el medio extracelular con relación al grupo control a través del tiempo, aproximadamente 30,5% ; sin embargo, al utilizar la s dosis más alta s de la solución acuosa de A. indica (0,7 y 1,4 g/d L ), se observó que para la primera dosis el consumo comenzó a partir de los tres minutos , disminuyendo la concentración de glucosa a 89,8 mg/ dL ; para la segunda dosis el consumo comenzó al minuto 1,5 , reduciendo la concentración de glucosa en el medio a 87 mg/d L , y llegando a ubicarse en 65,7 mg/d L a los 10 minutos .

Reducción en el contenido de glucosa

El análisis de varianza mostró que hay diferencias significativas para el porcentaje de reducción de la concentración de glucosa según la planta utilizada ( p = 0,0074), y para las dosificaciones de solución acuosa ( p = 0,0439), pero no para la interacción planta×solución acuosa ( p = 0,9358), además, se encontraron diferencias significativas a través del tiempo ( p < 0,0001), y para la interacción planta×tiempo ( p < 0,0001), adicionalmente, las interacciones solución acuosa×tiempo ( p = 1,0000) y planta×solución acuosa×tiempo ( p = 1,0000), fueron no significativas.

La prueba de medias de Tukey para la planta utilizada mostró que hubo una reducción mayor para la solución acuosa de la planta de A. indica , lo cual evidencia s u mayor efecto hipoglicemiante, el valor negativo para E. camaldulensis indica que en la solución acuosa se midieron concent raciones de glucosa mayores a las del control (T abla 3 ).

En las dosificaciones de solución acuosa utilizadas, la prueba de medias de Tukey demostró que el mayor efecto hipoglicemiante ocurrió para l a dosis de 1,4 g/d L , aun cuando en general se observa un incremento en el consumo de glucosa a partir de la dosis 0,175 g/d L , los valores negativos indican que las dosificaciones de la solución acuosa de las plantas fueron en promedio mayores a las del control, estos promedios fueron calculados para las dos plantas en to dos los instantes considerados (Tabla 4 ).

 La prueba de medias de Tukey mostró que en general, la reducción en la concentración de glucosa tiende a ser mayor a través del tiempo, con la notable excepción a los 300 segundos, la cual presentó un comportamiento anómalo debido a un valor inusualmente elevado con signo negativo para la planta E . camaldulensis (Tabla 5 ) .

La gráfica de la interacción muestra que la reducción en la concentración de glucosa solo fue creciente y estable para la solución acuosa de la planta A. indica , mientras que el comportamiento fue muy inconsistente para la solución acuosa de E. camaldulensis , esto evidencia que efectivamente el efecto hipoglucemiante fue m ayor y más confiable para A. indica (F ig . 3).

DISCUSIÓN

La solución acuosa de A. indica para las dosis de 0,7 y 1,4 g/d L, provocó disminución significativa en los niveles de glucosa a partir de los cinco minutos de reacción, presentando un porcentaje de consumo de 15,4% hasta 26,6% ; sin embargo, esta misma solución en dosis de 0,01 y 0,05, 0,175 y 0,5 g/d L no evidenció consumo de glucosa, este mismo comportamiento se observó para la solución acuosa de E. camaldulensis en las dosis de 0,01 y 0,05, 0,175 y 0,5 g/d L , asimismo, las dosis de 0,7 y 1,4 g/d L provocaron un consumo estadísticamente no significativo de glucosa , por lo cual se puede inferir que aun cuando el consumo de glucosa tiende a aumentar a través del tiempo, la reducción es más marcada y estable para A. indica , en comparación con el comportamiento errático del consumo de glucosa mostrado por la solución de E. camaldulensis.

Swanston-Flatt et al. (1990) evaluaron el efecto hipoglucémico que podían ejercer mezclas o combinaciones de plantas (agrimonia, alfalfa, cilantro, enebro) y también E. camaldulensis, en ratones con hiperglucemia, y obtuvieron que la decocción de este grupo de plantas reduce el nivel de hiperglucemia durante el desarrollo de la diabetes por estreptozotocina, no obstante, este efecto hipoglucemiante se pudiera atribuir al efecto sinérgico de la mezcla de las otras plantas, y no precisamente por acción directa de E. camaldulensis . No se han encontrado estudios in vitro que demuestren el efecto hipoglucemiante de esta planta, y en esta investigación la solución acuosa de la planta no mostró un efecto hipoglucemiante significativo. Existe la posibilidad que las concentraciones evaluadas en este estudio sean menores a la dosis mínima requerida para producir el efecto hipoglucemiante , siendo necesarias investigaciones posteriores utilizando concentraciones mayores de la solución acuosa.

Kar et al. (2003) condujeron una evaluación comparativa de 30 plantas, que comprendía un estudio realizado con la planta A. indica en ratas con diabetes inducida por alloxano, los resultados obtenidos al administrar el extracto etanólico de forma oral a las ratas, mostraron que los valores finales de gl u cemia basal de cada muestra disminuyeron cerca del n ivel normal al utilizar dosis únicas y dobles del extracto etanól ico de las plantas. Al organizarlas por orden de mayor actividad hipoglucemiante, la p lanta A . indica ocupó el octavo lugar con la aplicación de dosis únicas en la primera semana, lo cual se asemeja al efecto hipoglucemiante que presentó la planta en esta investigación.

Gholap y Kar (2004) evaluaron el efecto del extracto acuoso de diez plantas en el tratamiento de la DM de ratones machos, y concluyeron que la concentración sérica de glucosa disminuyó significativamente sin alterar los niveles de cortisol sérico de los animales , al recibir extractos de A egle marmelos, A zadirachta indica , Convolvulus pluricaulis y Gymnema sylvestre, los autores no lograron determinar cuál fue el mecanismo hipoglucemiante de tales plantas .

Isea et al. (2011) evaluaron el efecto hipoglicemiante de la A. indica y de la planta Phyllanthus niruri utilizando en una primera fase los extractos de manera individual y en una segunda fase se mezclaron en partes iguales, observaron que la combinación de los extractos desencadenaron un efecto sinérgico por la mezcla de dos plantas, disminuyendo considerablemente el valor de la glicemia de los conejos estudiados.

En los estudios citados anteriormente se observó un efecto hipoglucemiante in vivo de la planta A. indica, al administrar se de manera individual o en combinación con otras plantas, los cuales coinciden con los resultados del estudio in vitro en células humanas realizado en este trabajo, el cual se diferencia de los anteriores por haberse llevado a cabo en células humanas y no en animales de experimentación, asimismo , se evidenció un mayor efecto hipoglucemiante con la planta A. indica que el producido por la planta E. camaldulensis . Se recomienda en investigacion es posteriores la posibilidad de realizar ensayos combinando estas dos plantas para observar si se produce un efecto sinérgico de potenciación en la acción hipoglicemiante de estas plantas.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. BARHAM D, TRINDER P. 1972. An improved colour reagent for the determination of blood glucose by the oxydase system. Analyst. 97(151):142-145.         [ Links ]

2. GHOLAP S, KAR A. 2004. Hypoglycaemic effects of some plant extracts are possibly mediated through inhibition in corticosteroid concentration. Pharmazie. 59(11):876 - 87 8.         [ Links ]

3. GONZÁLEZ C, STAVOLA J, TRILLO J, YEPEZ A. 2011. Efecto hipoglicemiante de la planta Eucalyptus camaldulensis Dehn en células sanguíneas humanas resuspendidas en medios con glucosa. Maracay: Universidad de Carabobo , Facultad de Ciencias de la Salud [Disertación para Médico Cirujano] , pp. 13.         [ Links ]

4. HALIM EM . 2003. Lowering of blood sugar by water extract of Azadirachta indica and Abroma augusta in diabetes rats. Indian J . Exp . Biol. 41(6):636 - 6 40.         [ Links ]

5. ISEA GA, RODRÍGUEZ IE, SÁNCHEZ EA, MONTERO MA. 2011. Efecto hipoglicemiante de Azadirachta indica A. Juss., Phyllanthus niruri L. y su combinación en ratas normales. Rev . Cubana Plant . Med. 16(2):183 - 18 9.         [ Links ]

6. KAR A, CHOUDHARY BK, BANDYPADHYAY NG. 2003. Comparative evaluation of hypoglycaemic activity of some Indian medicinal plants in alloxan diabetic rats. J . Ethnopharmacol. 84(1):105 - 10 8.         [ Links ]

7. MAHDI AA, CHANDRA A, SINGH RK, SHUKLA S, MISHRA LC, AHMAD S. 2003. Effect of herbal hypoglycemic agents on oxidative stress and antioxidant status in dia betic rats. Indian J . Clin . Biochem. 18(2):8 - 15.         [ Links ]

8. MARTÍNEZ N, JIMÉNEZ R, MORENO W, LAMONT L, CAYAMA E, ESPINO C, R EQUENA D. 2010. Efecto hipoglicemiante de la planta Bixa o rellana L. en conejos de la raza Nueva Zelanda y en medios de glucosa con células resuspendidas. In : Universidad Autónoma Metropolitana de México - Unidad Iztapalapa. Anuario de investigación en etnomedicina, medicina complementaria y utilización de plantas medicinales. Universidad Autónoma Metropolitana de México - Unidad Iztapalapa , México DF , México, pp. 45 - 50.         [ Links ]

9. MARTÍNEZ N, GIL A, CELIS L, RODRÍGUEZ L, ROMERO F, ESPINO C, REQUENA D . 2014a . Efecto hipoglicemiante de un fitofármaco (DIAMET). Comunidad y Salud. 12(2):18 - 22.         [ Links ]

10. MARTÍNEZ N, RODRÍGUEZ Y, SALGUERO O, REQUENA D, TRIANA L, PÉREZ-YBARRA L. 2014 b . A study of hypoglycemic effects of Azadirachta indica (Neem) en human blood cells. Emir . J . Food Agric. 26(7):623 - 629.         [ Links ]

11. RODRÍGUEZ Y, SALGUERO O. 2011. Efecto hipoglicemiante de la planta Azadirachta indica en células sanguíneas humanas en medios con glucosa. Maracay: Universidad de Carabobo, Facultad de Ciencias de la Salud [Disertación para Licenciatura Bioanálisis] , pp. 46.         [ Links ]

12. ROJO D, BELL L, CANCIO E, IGLESIAS R. 2002. Efecto del extracto hipoglicemiante de Petiveria alliacea L sobre el consumo de glucosa por los eritrocitos. Rev . Cubana Invest . Biomed. 21(3):161 - 16 6.         [ Links ] S

13. WANSTON-FLATT SK, DAY C, BAILEY CJ, FLATT PR. 1990. Traditional plant treatments for diabetes. Studies in normal and streptozotocin diabetic mice. Diabetologia. 33(8):462 - 46 4 .         [ Links ]

14. URDANETA J . 2001. Neem: un árbol milagroso. Manual técnico. Universidad del Zulia. Facultad de Agronomía. División de Extensión Agrícola , Maracaibo, Venezuela, pp. 50.         [ Links ]