Uzcátegui Negrón, M.*; Serrano, J.A.*; Rojas, K.*; García, E.**; Díaz Corrales, F.*; Couble, A.***; Casoli, E.***; Renaud, F. N. R.*** y Boiron, P.***

*Unidad de Ultraestructura, Grupo de Investigación de Actinomicetos Patógenos Humanos y del Suelo, Departamento de Patología, Facultad de Medicina, Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela.
** Departamento de Microbiología, Facultad de Farmacia, Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela.
*** Faculté de Pharmacie, Laboratorie de Mycologie,8, Avenue Rockefeller, 69373, Lyon Cedex, 08 France.

Palabras-clave: Nocardia, actinomicetales, aislamiento, taxonomía, ecología.

Resumen

Los autores presentan los resultados obtenidos del estudio de 43 muestras recogidas en 25 lugares de cinco estados de Venezuela. Las muestras fueron cultivadas para aislamiento de Nocardia sp. usando la técnica del "paraffin bait". Las muestras de suelo fueron recolectadas en el estado Lara (19 muestras), estado Mérida (13 muestras), estado Amazonas (7 muestras), estado Falcón (3 muestras) y estado Apure (1 muestra). De las muestras estudiadas, el 46,51% se identificaron como Nocardia asteroides y el 16,28% como Nocardia sp. En las muestras de suelo estudiadas del estado Lara se encontró el mayor número de aislados de Nocardia asteroides (95%); esto es un indicador de que este estado podría ser considerado como uno de los reservorios naturales de N. asteroides. Estos datos se compaginan con la alta morbilidad del actinomicetoma, entre los cuales figura como segundo agente etiológico del mismo N. asteroides.

Abstract

Forty-three soil samples from 25 places ("lugares") in Venezuela were cultivated using the paraffin bait technique for isolation of Nocardia sp. Samples were collected from Lara Sate (19 samples), Mérida State (13 samples), Amazonas State (7 samples), Falcón State (3 samples), and Apure State (1 sample). From the total isolatedstrains, 46.51% were identified as Nocardia asteroides, 16.28% were identified as Nocardia sp. Lara State shows the highest number of N. asteroides isolated (95%), this indicates that Lara State represents one of the most important natural soil reservoir of N. asteroides. The majority of actinomycetoma cases in Venezuela have been reported from this state, where N. asteroides is the second most common etiologic agent of actinomycetoma.

Las bacterias del género Nocardia están clasificadas dentro del orden de los Actinomicetales. Son microorganismos que presentan características morfológicas, bioquímicas y fisiológicas muy particulares, a través de las cuales se puede realizar su identificación. Son bacterias Gram-positivas, ácido-alcohol-resistentes (variables), que fragmentan en forma de cocos y bacilos, y así mismo son capaces de producir una variante de su crecimiento, formando células de tipo "formas L" (1).

La mayoría de los actinomicetales aerobios provienen del suelo, y generalmente se asocian con la descomposición de la materia orgánica. Aunque su actividad y desarrollo en el suelo es muy lento, se ha comprobado que este hábitat es el reservorio preferencial de estos microorganismos; los suelos constituyen una buena fuente para el aislamiento de especies patógenas de Nocardia (2, 3, 4).

La mayor frecuencia de los nocardiformes que son organismos cosmopolitas en los suelos ha sido reportada en terrenos de composteo y en establos (5). Estos microorganismos pueden ser transportados por los deslizamientos superficiales presentes en la actividad hidráulica de cada región, y sobrevivir en lugares acuáticos naturales, como ríos, esteros y mares, o en instalaciones de tratamiento de aguas residuales en la espuma de lodos activados (6).

Los actinomicetos, presentes en la microflora del suelo, pueden llegar a formar hasta un 25 % de la microflora edáfica en zonas áridas. Su distribución es de 105-106 g de peso seco por una biomasa de 160 gm3. Esta relación, comparada con la de otros microorganismos del suelo, establece que son unos de los más abundantes. El principal determinante de la distribución microbiana a pequeña escala es la naturaleza de las partículas de las cuales se compone el suelo; algunos microorganismos crecen más en partículas de humus que en granos de arena. Se ha reportado que las partículas de materia orgánica constituyen sólo el 15% del suelo, pero tienen mas del 50% de las bacterias asociadas con ellas. Se ha demostrado que los minerales de arcilla afectan la tasa de crecimiento de los microorganismos; también hay efectos físicos de arcillas y coloides de la materia orgánica que absorben bacterias, nutrientes, etc. Las bacterias tienden a crecer como individuos o microcolonias pequeñas (menores de 10 células) sobre las superficies de las partículas del suelo y las raíces, los hongos y, en menor grado, los actinomicetos. Difieren en cuanto a que crecen activamente a través del suelo, a partir de una base alimenticia.

Las hifas pueden ramificarse a través de los espacios de aire o en regiones que contienen minerales casi puros; por esta razón, no se desarrollan como colonias compactas. La esporulación se lleva a cabo en la superficie del suelo o de la hojarasca (7).

Para el aislamiento de microorganismos del género Nocardia de muestras de suelo, se procede a determinar la población natural de estos microorganismos presentes en el suelo, estudiando sus aspectos cualitativos, cuantitativos y otros componentes específicos. Tomando en cuenta que estas bacterias no son exigentes y crecen con facilidad en los medios de cultivos, han sido descritas diversas técnicas de aislamiento selectivo, tales como el "Paraffin bait" y otros métodos, en los cuales son usados antibióticos a fin de lograr un aislamiento más selectivo ( 8, 9, 10, 11, 12, 13).

Las infecciones por Nocardia se encuentran relacionadas con afecciones del tipo (infecciones medio ambiente-hombre), y dentro de éstas las de mayor impacto epidemiológico y clínico son la nocardiosis y el actinomicetoma. La nocardiosis, por lo general, es una infección de localización pulmonar, y el agente etiológico más común es N. asteroides; la enfermedad se produce al inhalar las bacterias (aerosoles), presentándose lesiones broncopulmonares indistinguibles clínicamente de una tuberculosis u otras micosis pulmonares. Característicamente, las infecciones pulmonares invasivas por Nocardia se presentan cuando ocurre una diseminación hematógena, que eventualmente puede lesionar cerebro, riñón, suprarrenales, entre otros (14, 15, 16, 3).

El actinomicetoma se caracteriza por ser una infección crónica supurativa y granulomatosa de la piel y del tejido subcutáneo. La especie de Nocardia más frecuentemente aislada en este tipo de infección es N. brasiliensis. Esta afección se inicia por el traumatismo cutáneo (punzo-penetrante) con astillas o espinas contaminadas por actinomicetos patógenos (17, 18).

Cabe destacar que la capacidad de Nocardia para causar enfermedad está relacionada con el nivel de parasitismo intracelular y otros factores de virulencia, que le permiten su supervivencia dentro del macrófago. Haciendo referencia a la condición de patógenos oportunistas de estas bacterias, el grupo con mayor susceptibilidad a presentar estas infecciones lo constituyen pacientes inmunosuprimidos, con SIDA, transplantados, o que estén recibiendo tratamientos quimioterapéuticos o con corticoides (19, 20, 21).

Materiales y Métodos

Recolección de las muestras. En la tabla 1 se encuentran referidos los estados de Venezuela donde fueron recolectadas las muestras de suelo. Las muestras fueron secadas a una temperatura de 45º C durante 45 minutos. Luego, a través de la técnica de tamizaje, se separó la tierra de piedras y de restos vegetales.

Tabla 1. Número, código y procedencia de las muestras de suelo.

Aislamiento selectivo. Las muestras se procesaron por dos métodos distintos:

Método Nº 1: Un gramo de suelo de cada muestra fue resuspendido en 5 ml de medio libre de fuentes de carbono. Se agitó en vórtex durante 5 minutos y se dejó en reposo. Seguidamente, se tomó 2 ml del sobrenadante para transferirlos a tubos de ensayos con 5 ml de medio libre de fuentes de carbono. Se introdujo en cada tubo una varilla con parafina y luego se incubaron los tubos de "Paraffin Bait" a 37ºC, hasta que se observó crecimiento sobre la varilla de parafina (12).

Método Nº 2: Un gramo de suelo de una de las muestras provenientes del estado Lara fue colocado en un tubo de ensayo estéril y suspendidos en 10 ml de solución salina; luego se agitó en un vórtex durante 15 minutos y se dejo en reposo. A partir de esta suspensión se transfirió 0,5 ml del sobrenadante a tubos con 4,5 ml de solución salina fisiológica, para realizar la solución original. Seguidamente, se tomó 0,5 ml de esta solución y se realizaron diluciones seriadas hasta 10-3. Se sembraron 0,1 ml de las respectivas diluciones en placas de Petri, con medio Middlebrook 7H10 suplementado con glicerol.

Este medio fue envasado en placas con rifampicina (5 mg/L), en placas con clortetraciclina (45 mg/L), placas con doxiciclina (10 mg /L), placas con la combinación de clortetraciclina y doxiciclina, y en placas sin antibióticos. Todas las placas utilizadas contenían cicloheximida (100 mg/L) (10).

Identificación de las cepas aisladas. Las cepas seleccionadas fueron estudiadas en diversos aspectos, tales como: su morfología, su fisiología y su citoquímica, teniendo estos estudios la finalidad de identificar y caracterizar los microorganismos aislados.

El estudio macroscópico se basó en la observación de las colonias, tomando en cuenta su color, aspecto, apariencia y la producción de micelio (aéreo y de substrato), así como sus exopigmentos. Para la observación microscópica se utilizó la técnica de cultivo en laminilla de Kowate y Shenobu, coloreándolas posteriormente con la tinción de Gram (11, 12).

En el estudio fisiológico se determinó la capacidad de degradar ciertos sustratos como son la caseína, la tiroxina, la hipoxantina, la urea y la resistencia a la lizosima. Para cada prueba se ensayaron cepas controles de cada una de las especies de Nocardia (N. asteroides, N. brasiliensis, N. otitidiscaviarum y Rhodococcus rhodochorous (4, 8).

Una vez obtenida la biomasa se procedió a la preparación de los extractos y cromatografía de lípidos y aminoácidos. Los lípidos fueron extraídos por metanólisis ácida a 55ºC, según el método de Minnikin (23), para luego ser analizadas por cromatografía de capa fina de sílica gel. El sistema de solvente utilizado fue hexano: acetona 95:5 v/v. Y, por último, se reveló con ácido fosfomolíbdico 5% y etanol 95% (22).

La extracción de los aminoácidos se realizó tomando 20mg de biomasa seca, la cual fue hidrolizada durante una noche con 1ml Cl 6N a 100ºC. Luego se sacaron de la estufa, se dejaron a temperatura ambiente y se centrifugaron 2 minutos a máxima velocidad en centrífuga Eppendorf. Se tomaron 2 ml de sobrenadante y fueron secados en la estufa a 100ºC, agregando 1 ml de agua destilada, repitiéndose este procedimiento 3 veces. Una vez seco, se agregaron 0,3 ml de agua acidificada y se corrieron los extractos sobre placas de celulosa de alta resolución (HPTLC); el sistema de solvente fue metanol: piridina: HCl 10 N: agua, 80 : 10 : 2,5 : 17,5, y se reveló con ninhidrina: acetona al 0,1% p/v. Al final, todas las placas se calentaron a 105ºC, hasta que desarrollaron color (22).

Pruebas de susceptibilidad a antibióticos:

Las muestras aisladas del suelo fueron probadas para su susceptibilidad a 11 agentes antimicrobianos, usando para esto el método de difusión en disco (NCCLS) (24). Cada cepa aislada fue comprobada en su pureza y luego emulsionada en 50 ml de caldo Mueller-Hinton. Los medios así inoculados fueron incubados a 37oC durante 24 a 48 h, en un incubador con agitación rotatoria. A cada fiola con el medio de incubación se le agregó perlas de vidrio de 5mm en diámetro, para evitar la formación de grumos de las nocardias en crecimiento. La concentración de las células se ajustó por dilución a unas 106-108 CFU/ml, siguiendo así las recomendaciones del "National Committee for Clinical Laboratory Standards" (NCCLS). Las siguientes cepas de referencia fueron usados como controles en las pruebas de susceptibilidad a antibióticos: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Nocardia asteroides ATCC 19247.

Un inóculo con aproximadamente 104 a 105 CFU/ml fue usado en las pruebas de susceptibilidad en disco, realizada la misma en agar Mueller-Hinton y leída luego de una incubación durante 24 a 48 h a 37oC. La lectura de la prueba se cuantificó como: susceptible, intermedio o resistente, esto de acuerdo con los criterios recomendados por el "Antibiogram Commitee of the French Society for Microbiology (25).

Pruebas de PCR gen (género y especie):

Para las pruebas de PCR gen a nivel de género, se obtuvo usando 16S rARN (26), y para el nivel de especie se obtuvo usando "PCR-restriction fragment length polymorphism", el cual usa un segmento amplificado de la 65- kDa "heat shock protein gene" (27).

Resultados

De las 43 cepas estudiadas, se seleccionaron un total de 19 aislados, que presentaron una morfología macroscópica y microscópica presuntivas de ser Nocardia sp., las cuales fueron aisladas por el método Nº1 (ver tabla 2).

Tabla 2. Características morfológicas de las cepas aisladas, utilizando la técnica de "Paraffin bait".

El método Nº2 permitió el aislamiento de 9 cepas de Nocardia sp. (ver tabla 3). En las tablas 2 y 3 se pueden observar los resultados de los estudios morfológicos (macroscópicos y microscópicos) de las cepas aisladas.

Tabla 3. Características morfológicas de las cepas aisladas, utilizando medio con antibióticos.

La tabla 4 muestra los resultados de las pruebas fisiológicas de: descomposición de la caseína (c), la tiroxina (T), la hipoxantina (H), la urea (U) y la resistencia a la lizosima. Se puede observar que 20 (46,5%) cepas mostraron un patrón fisiológico característico de Nocardia asteroides; el resto de las cepas no se lograron identificar, debido a un alto grado de contaminación en los medios de cultivo.

Hx: Hipoxantina; Tr: Tirosina; Cs: Caseína; Lz: Lisozima; ND: No determinado.
Nota: M, S, CS y PCR1 no fueron estudiadas en ninguna de estas características.
Tabla 4. Características fisiológicas de las cepas aisladas de las muestras de suelo.

Los resultados obtenidos en el estudio de los ácidos micólicos y meso-DAP de la pared celular de las nocar dias aisladas son presentados en la tabla 5.

Tabla 5. Estudio de la presencia de ácidos micólicos y de meso-DAP en la pared celular de las cepas aisladas del suelo

Si se analiza la tabla 6, se puede ver que de las 7 cepas aisladas en el estado Amazonas, 42,85% fueron identificadas como Nocardia sp.; en el estado Falcón, al igual que en el estado Apure, no fueron aisladas nocardias. En el estado Mérida, de un total de 13 cepas, se aisló una (7,69%) de Nocardia sp.; y en el estado Lara fueron aisladas 19 cepas, un 15,78% como Nocardia sp. y un 57,89% como Nocardia asteroides.

Tabla 6. Especies patógenas de Nocardia aisladas por el método del "Paraffin bait".

En la tabla 7 se presentan los resultados obtenidos con los 11 antimicrobianos utilizados contra cada uno de los aislados. Todas las cepas aisladas del suelo fueron susceptibles a la amikaci na, a la tobramicina, al trimetoprim-sulfametoxazol y a la cefotaxima. La susceptibilidad a los otros antibióticos usados, fue relativamente homogénea; la mayoría fue resistente a la amoxicilina, la ampicilina, la ciprofloxacina y la mayoría susceptible a la minociclina.

AMC: Amoxicilina; AM: Ampicilina; CIP: Ciprofloxacina; E: Eritromicina; SXT: Trimetoprim-Sulfametoxazol; AN: Amikacina; TM: Tobramicina; CTX: Cefotaxima; IMP: Imipenem; MNO: Minociclina; MA: Cefamandol; N. a.: Nocardia asteroides. R: Resistente; I: Intermedio; S: Susceptible.
Tabla 7. Susceptibilidad a 11 antimicrobianos observada en 11 cepas de N. asteroides aisladas de muestras de suelo en Venezuela.

Discusión

El aislamiento de estas bacterias en muestras de suelo, que en algún mo mento pueden actuar como patógenos oportunistas, está generalmente aceptado, debido a que estos microorganismos, que se consideran agentes etiológicos de infecciones a nivel pulmonar y de tejidos en humanos y animales, constituyen parte de la microflora del suelo (15, 2, 22).

Al relacionar la presencia de N. asteroides en los suelos de los estados estudiados, se observó lo siguiente: en las muestras del estado Apure, al igual que las del estado Falcón, fueron negativas. En las muestras del estado Amazonas se aislaron 3 cepas de Nocardia sp., en las del estado Mérida se aisló una cepa de Nocardia sp., y en las muestras recogidas en el estado Lara fueron un mayor número de cepas, tanto de Nocardia sp., 3 (15,78%) como de N. Asteroides, 11 (57,89%).

Posiblemente estos resultados no se correlacionan con los obtenidos por Gelderen y colaboradores (1987), en el que utilizaron para el aislamiento la técnica del "paraffin bait", donde se obtuvo una alta prevalencia de especies de N. brasiliensis y menos especies de N. asteroides. Se cree que otras especies diferentes a N. asteroides podrían estar presentes en estos suelos, pero el no haberlas aislado pudo deberse a que en el gramo de suelo examinado se eliminó su viabilidad, al precalentar las muestras de suelo a 45º C por 45 minutos. Otra de las posibles razones que puede explicar este hecho es que el estado Lara cuenta con características muy particulares de vegetación xerófila y zonas semidesérticas, con altas temperaturas, lo que puede ser perjudicial para el crecimiento natural de algunas especies de Nocardia (8). Además de esto, N. asteroides generalmente es reportada por ser más común en las regiones templadas del mundo, mientras que N. brasiliensis es más frecuente en regiones tropicales y subtropicales (17).

Las pruebas de sensibilidad a los antibióticos utilizados en el estudio de las N. asteroides aisladas del suelo mostró un patrón de sensibilidad y de resistencia bastante semejante al observado en cepas aisladas de humanos u animales (5).

Es importante establecer métodos que permitan determinar con más exactitud la distribución de Nocardia en suelos de las diferentes regiones del país, además de establecer la susceptibilidad a los antibióticos y efectuar su caracterización a través de un perfil enzimático o la utilización de diferentes substratos, para establecer qué tan parecidas o diferentes son entre sí.

Es interesante observar que 11 de las cepas aisladas de muestras de suelo del estado Lara fueron estudiadas por técnicas de PCR, caracterizándolas como Nocardia a través del uso del gen 16S rARN, y como especie asteroides usando "PCR-restriction fragment length polymorphism", que utiliza un segmento amplificado de "65-kDa heat shock protein gene". Se hace necesario el incluir estudios de amplificación y secuenciación, utilizando la técnica de PCR, la cual puede ser muy útil para determinar las posibles relaciones entre las cepas de Nocardia aisladas de muestras procedentes de humanos y/o del suelo (28).

Referencias Bibliográficas

1. Hoh,J.; Krieg, N.; Sneath, P.; Staley, J. and Williams, S.: Bergey's manual of determinative bacteriology. Ed. Williams & wilkins. Novena edición. 626, 1994.        [ Links ]

2. Murray, P.; y Kobayashi, G.. Microbiología médica. Segunda edición. Ed. Harcourt.España. pp. 315-318, 1997.        [ Links ]

3. Mcneil, M. and Brown, J.: The medically important aerobic actinomycetes: epidemiology and microbiology. Clinical microbiology reviews. 7: 357-417, 1994.        [ Links ]

4. Mc Clung.: Isolation of Nocardia asteroides from soil. Mycologia. 50: 154-156, 1960.        [ Links ]

5. Sandoval, H.: Actinomicetos: Microorganismos de la luz. Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco, 1993.        [ Links ]

6. Sodell, J. y Seviour, R.: Nocardiform pathogens in activated sludge. Proceed. 3er Simposio de Investigadores en Ciencias Biomédicas y 2da reunión internacional sobre biología de Nocardia. Davis, California, USA, 2000.        [ Links ]

7. Sánchez, S, N.; Sandoval, H. and Espejel, J.: Search of Nocardia crassostreae in Oysters (Crassostrea virginica) of the Gulf of México. Uni versidad Autónoma Metopolitana Unidad Xochimilco, México, Escuela Nacional de Ciencias Bilógicas, Instituto Politécnico Nacional.        [ Links ]

8. Gelderen, A.; Runco, R. and Salim, R.: Natural occurrence of Nocardia in soil of Tucumán: Physiological characteristics. Mycopathología. 99: 15-19, 1987.        [ Links ]

9. Khan, Z.; Neil, R.; Chandy, T.; Chugh, H.; Sayer, A. and Provost, F.: Nocardia asteroides in the soil of Kuwait. Mycopathologia, 137: 159-163, 1997.        [ Links ]

10. Gelderen, V.; Aida, A. and Duran, E.: Antimicrobial susceptibilities of strain of Nocardia brasiliensis isolated from soil of Tucumán. Mycopathologia 191 (12): 115-121, 1998.        [ Links ]

11. Khan, Z.; Neil, R.; Chandy, T.; Chugh, H.; Sayer, A. and Provost, F.: Nocardia asteroides in the soil of Kuwait. Mycopathologia, 137: 159-163, 1997.        [ Links ]

12. Kurup, P. and Schmitt, J.: Isolation of Nocardia from soil by a Modified paraffin bait method. Micologia LXIII; 175-177, 1971.        [ Links ]

13. Atia, M.; Farid, A and Zaki, M.: Isolation of pathogenic fungi and actinomycetes from soil in Egypt. International Society for human and animal mycology 38: 217-221, 1981.        [ Links ]

14. Beaman, B. and Beaman, L.: Nocardia Species: Host-Parasite relationships. Clinical Microbiology Reviews. 8: 213-218, 1994.        [ Links ]

15. Boiron, P.; Chevrier, G. et Provost, F.: Le diagnostic microbiologique de la nocardiose. Institut Pasteur-Unite de Mycologie XXIII: 341-346, 1989.        [ Links ]

16. Beaman, B.; Burnside, J. and Edwards, B.: Nocardial Infection in the United States. J Inf Dis. 134: 286-289, 1976.        [ Links ]

17. Serrano, J.; Beaman, B.; Viloria, J.; Mejía, M. and Zamora, T.: Microbiological and ultrastuctural studies of human actinomycetomas. Sixth international symposium on actinomycetes biology; 78: 647-661, 1985.        [ Links ]

18. Serrano, J.; Novoa, D.; Mejía, M. and García, E.: Mycetoma in Venezuela- Series of Cases in the State of Lara (1976-1994), Multidisciplinary family-Case. Comparison Epidemiologic Study (1994-1996). Proceedings of the Ninth Symposium on the Actinomycetes; 289-293, 1995.        [ Links ]

19. Palasí, P.; Aldeguer, J.; Todeli, J.; Diosdado, N.; Santos, M. y Bonora, V.: Absceso retromamario por Nocar dia asteriodes en pacientes con HIV positivo. Microbiología clínica; 16: 57-58, 1998.        [ Links ]

20. Serrano, J.; Beaman, B.; Viloria, J.; Mejía, M. and Zamora, T.: Microbiological and ultrastuctural studies of human actinomycetomas. Sixth international symposium on actinomycetes biology; 78: 647-661, 1985.        [ Links ]

21. Goodman, N.: The epidemiology of nocardiosis. The epidemiology human mycotic diseases; 2: 40-49, 1975.        [ Links ]

22. Serrano, J. y Sandoval, A.: Manual de Laboratorio para el estudio de los Actinomicetales patógenos. Consejo de publicaciones- Universidad de Los Andes, Mérida, 1985.         [ Links ]

23. Minnikin, D. E.; Alshamaony, L. and Goodfellow, M.: Differentiation on of Mycobacterium, Nocardia and related taxa by thin layer chromatographic analysis of whole- organism methanolysates. J Gen Microbiol; 88: 200-204, 1975.        [ Links ]

24. National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. Approved standards M2-A5. Villanova, PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1994.        [ Links ]

25. Soussy, C. J.: (Coord). Communiqué 2000-2001 du Comité de 1'Antibiogramme de la Société Francaise de Microbiologie. SFM 2001: 46 pp.        [ Links ]

26. Laurent, F. J.; Provost, F. and Boiron, P.: Rapid identification of clinically relevant Nocardia species to genus level by 16S rRNA gene PCR. J Clin Microbiol; 37:99-102, 1999.        [ Links ]

27. Steingrube, V. A.; Wilson, R. W.; Brown, B. A.; Jost, K. C. Jr.; Blackmock, Z.; Gibson, J. L. and Wallace, R. J. Jr.: Rapid identification of clinically significant species and taxa of aerobic actinomycetes, including Actinomadura, Gordona, Nocardia, Rhodococcus, Streptomyces, and Tsukamurella isolates, by DNA amplification and restriction endonuclease analysis. J Clin Microbiol; 35: 817-822, 1997.        [ Links ]

28. Díaz-Corrales, F.; Pujic, P.; Tam, S.; García, E.; Serrano, J. A. and Beaman, B. L.: Nocardia asteroides isolation from Venezuelan soils: PCR amplification of a part of HSP-65 gene of eight strains. Resúmenes Segunda Conferencia Internacional sobre Biología de Nocardia. Resumen N° 147, Davis, CA, USA, 2000.         [ Links ]