Andrea Orué^a, Nancy Y. De Abreu^a, Clara Martínez^b, Alexis Mendoza-León^a*

^aLaboratorio de Bioquímica y Biología Molecular de Parásitos, Instituto de Biología Experimental (IBE), Facultad de Ciencias. Caracas - Venezuela

^bEscuela de Nutrición, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela. Caracas - Venezuela

* Correspondencia:E-mail: amendoza50@cantv.net

Resumen:

Leishmania es el agente causante de la compleja enfermedad conocida como leishmaniasis. Las distintas especies de este parásito protozoario se encuentran agrupadas en dos subgéneros, Viannia y Leishmania, de acuerdo a su desarrollo en el mosquito vector. Un ensayo de PCR, β500-PCR, específico del subgénero Viannia, ha sido desarrollado utilizando la secuencia de ADN genómico denominada β500. En este trabajo se presenta el aislamiento e identificación de una secuencia genómica de 280 pb, L280, a partir del ADN genómico de Leishmania (Leishmania) mexicana luego de aplicar el ensayo β500-PCR en condiciones de baja rigurosidad. La secuenciación parcial de L280 permitió diseñar un ensayo de PCR (L280-PCR) que generó un producto de amplificación de 260 pb, en distintas condiciones de rigurosidad, cuando se utilizó el ADN genómico de distintas especies pertenecientes al subgénero Leishmania. El ensayo L280-PCR resultó negativo para el ADN genómico de distintas especies del subgénero Viannia al igual que para el ADN de otros organismos kinetoplastidos o humano. Los resultados sugieren que el ensayo L280-PCR es específico del subgénero Leishmania.

Palabras clave: Leishmania, identificación molecular, marcador molecular, leishmaniasis

Identification of a genomic DNA sequence of Leishmania, specific of Leishmania subgenus

Abstract:

Keywords: Leishmania, molecular identification, molecular marker, leishmaniasis

Recibido 10 de octubre de 2007; aceptado 13 de febrero de 2008

Introducción

Leishmania es un protozoario, perteneciente a la familia Trypanosomatidae, agente causal en humanos y en animales domésticos de la enfermedad conocida como leishmaniasis. La enfermedad se presenta con un amplio espectro de manifestaciones clínicas siendo las más frecuentes lesiones cutáneas, mucocutáneas y viscerales de las cuales la última es la forma más severa [1-4]. Las manifestaciones clínicas de leishmaniasis son complejas y entre otras cosas dependen de la especie responsable de la infección, de la interacción parásito-hospedador y de la correlación genética de tal interacción [5].

La identificación de estos parásitos es de suma importancia en términos epidemiológicos, de prevención y control de la enfermedad. De acuerdo a su desarrollo en el tracto digestivo del insecto vector, las distintas especies de Leishmania se agrupan en dos subgéneros, Leishmania y Viannia, siendo este último autóctono de América [3,6]. Se han descrito varias especies en cada subgénero, incluidas aquellas patógenas en humanos, y varios han sido los métodos fenotípicos o genotípicos utilizados  para la identificación y discriminación de las distintas especies de Leishmania [7-13]. En términos genotípicos, varias secuencias de ADN, fundamentalmente repetitivas, se han identificado y descrito como marcadores moleculares en la identificación de Leishmania, al igual que muchas de ellas han sido utilizadas en la estandardización de algunos ensayos específicos de PCR. Por ejemplo el ADN de kinetoplasto (kADN) [9,12,14], y secuencias de ADN nuclear como las secuencias del mini-exón [15], la región de los genes de tubulina [11] y la secuencia única del gen de la glucosa 6-P dehidrogenasa [16] entre otras. En estudios previos se identificó y demostró la especificidad para el subgénero Viannia de una de estas secuencias de ADN genómico, b500, la cual es intergénica en la región de los genes de la β tubulina. Luego de su secuenciación se seleccionaron oligonucleótidos específicos que permitieron estandardizar  las condiciones de un ensayo de PCR (b500-PCR) específico para la identificación de las especies de dicho subgénero [10,11]. En este trabajo se identifica una secuencia de ADN genómico de 280 pb (L280), aislada de L. (L.) mexicana mediante la aplicabilidad del ensayo b500-PCR  en condiciones de baja rigurosidad, la cual resultó ser específica de las especies de Leishmania pertenecientes al subgénero Leishmania. La secuenciación parcial de L280, permitió diseñar un ensayo de PCR, L280-PCR, el cual se evaluó exitosamente en la identificación específica de las especies de este subgénero.

Materiales y Métodos

Microorganismos

En la Tabla 1 se presentan las cepas de Leishmania empleadas en este estudio, las cuales en su mayoría son consideradas como cepas de referencia por parte de la Organización Mundial de la Salud (OMS).

Tabla 1. Designación de las especies de Leishmania y otros organismos.

^aSe utilizó la nomenclatura propuesta por Lainson y Shaw [6] para la clasificación de Leishmania spp.bLa OMS ha designado como cepas de referencia a la mayoría de las que se han utilizado en este estudio.cCorresponde a un clón derivado de L. (L.) amazonensis PH8.

Los promastigotes de Leishmania sp. se cultivaron en medio Schneider´s Drosophila (SIGMA) suplementado con 10 % de suero fetal de bovino (SIGMA) y 50 mg/ml de Kanamicina a temperatura ambiente [11]. 

Aislamiento del ADN

El ADN total de las diferentes especies de Leishmania sp., fue aislado a partir de 100 ml de cultivos de promastigotes en fase logarítmica tardía de crecimiento siguiendo la metodología previamente descrita [10,11]. Los promastigotes fueron centrifugados a 5000 g por 10 min., posteriormente el sobrenadante fue descartado y al precipitado se le añadieron 2 ml de buffer de lisis SDS (Tris HCl 0.01M, SDS 0.5%, NaCl 0.1M, EDTA 1mM). La mezcla se incubó por 30 min. a temperatura ambiente y seguidamente se añadió un volumen de fenol-cloroformo (1:1 v/v) con agitación suave; la mezcla se centrifugó a 5000 g por 10 min, la fase acuosa fue separada a un tubo estéril y a la misma se le añaden 2.5 vol de etanol. El ADN fue precipitado mediante centrifugación a 10000 g durante 10 min., el sobrenadante se descartó y el sedimento (ADN) se resuspendió en 0.20 ml de buffer TE 1X (Tris-HCl 10mM, pH 8.2, EDTA 1 mM, pH 7).

El ADN genómico de la cepa de referencia L. (L.) mexicana BEL21 fue utilizado en un ensayo β500-PCR (específicos para el subgénero Viannia [10]), a una temperatura de hibridación de los oligonucleótidos A₂ y A₁₀ de 50°C, generando un producto de 280 pb (L280) y otro de 260 pb. Luego de la extracción del gel de agarosa y purificación, el fragmento de L280 fue clonado en el vector pGEM-T Easy (Promega) de acuerdo a las especificaciones de la casa comercial. Posteriormente, el clon fue purificado y parcialmente secuenciado mediante técnicas convencionales.

Ensayo de PCR

El ensayo de amplificación por PCR se llevó a cabo utilizando el ADN total de las cepas descritas en la Tabla 1. Todas las reacciones fueron realizadas en un volumen final de 0.025 ml, los cuales contenían 5 ng de ADN de Leishmania spp; 50 pmol de los oligonucleótidos requeridos (Tabla 2) y 0.018 ml de PCR SUPER MIX (Invitrogen). Las diferentes reacciones se llevaron a cabo en un termociclador MJResearch PTC100, bajo las siguientes condiciones: 95°C durante 4 min., seguido por cuarenta ciclos con las condiciones siguientes: 95ºC por 1 min., 50º C (baja rigurosidad), 55°C (mediana rigurosidad ) o 60ºC (alta rigurosidad) por 2 min., 72º C por 3 min. y una extensión final a  72ºC por 10 min. El ensayo de PCR para la amplificación de la secuencia de ADN β500 (β500-PCR), especifica de subgénero Viannia fue descrito previamente [10].

Tabla 2. Oligonucléotidos diseñados para los ensayos de PCR.

^aEstos oligonucléotidos fueron descritos previamente como específicos del subgénero Viannia [10,11].

 ^bFueron diseñados como parte del presente trabajo.

 ^cAmplifican un producto de 900 pb en ambos subgéneros.

^dEl Tm fue calculado a NaCl 0.1 M. pb: pares de base. ND: no determinado.

Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1.5% en buffer TBE 1X (Tris-HCl 90 mM, pH 8.2, ácido bórico 90 mM, EDTA 2 mM), a 80 V durante 2 horas y se visualizaron bajo luz ultravioleta luego de tinción del gel con bromuro de etidio una vez concluida la electroforesis. 

Resultados 

Identificación de una secuencia de ADN genómico específica del subgénero Leishmania 

El ADN genómico de diferentes cepas de Leishmania del Nuevo Mundo representativas del subgénero Leishmania, fue utilizado para evaluar los productos generados de la aplicación del ensayo b500-PCR, especifico para el subgénero Viannia [10], a una baja rigurosidad (Figura 1). Dicho ensayo en condiciones de alta rigurosidad (60°C) produce un producto único de amplificación de 375 pb en las especies del subgénero Viannia. Los resultados muestran que el ensayo a una temperatura de 50°C, utilizando el ADN de la cepa L. (V.) braziliensis (línea 1), representativa del subgénero Viannia, generó el fragmento esperado de 375 pb, mientras que el ADN genómico de diferentes especies representativas del subgénero Leishmania, mostraron un patrón de bandas homogéneo caracterizado por dos bandas principales de 280 y 260 pb respectivamente (líneas 2 a 6). Sin embargo, la cepa L. (L.) tropica (línea 7), representante de este último subgénero en el Viejo Mundo, al igual que la cepa L. enriettii (línea 8) no produjeron ningún producto de amplificación en las regiones indicadas.

La amplificación del ADN genómico de L. (L.) mexicana BEL21 utilizando las diferentes combinaciones de oligonucléotidos y una temperatura de 50°C, muestra que el par F₁/B₁ genera un producto de 180 pb (línea 2), F₂/B₂ uno de 110 pb (línea 3), F₁/B₂ un producto de 260 pb (línea 4), mientras que el par F₂/B₁ no generó ningún producto de amplificación. Tomando en cuenta el tamaño del producto generado durante el proceso de amplificación, se seleccionó el par F₁/B₂ para llevar a cabo la evaluación de la secuencia L280 como un marcador molecular de las especies del subgénero Leishmania. La amplificación del mismo ADN con el par de oligonucléotidos del ensayo de PCR para b500, A₂/A₁₀, fue utilizado como control de la reacción (línea 1).

Evaluación de la amplificación de ADN-L280 en Leishmania spp.

El ADN genómico de distintas cepas de referencia y el de aislados venezolanos de Leishmania, previamente caracterizados como pertenecientes al subgénero Leishmania [11], al igual que la combinación de oligonucleótidos F₁/B₂ y una temperatura de hibridación de los mismos de 50°C, fue utilizado en la evaluación del ensayo L280-PCR (Figura 3). Los resultados muestran que un producto principal de 260 pb se generó a partir del ADN de las cepas de referencia del subgénero perteneciente al Nuevo Mundo (líneas 2, 3, 7 y 14), al igual que en los aislados venezolanos (líneas 4, 8, 10 y 12). Por otro lado, ningún producto de tamaño similar se obtuvo cuando se utilizo el ADN de L. enriettii (línea 5), o representantes del subgénero Leishmania del Viejo Mundo como L. (L.) tropica (línea 6) y L. (L.) major (línea 9), o representantes del subgénero Viannia (línea 11), indicando una especificidad del ensayo para las especies del Nuevo Mundo pertenecientes al subgénero Leishmania.

Especificidad del ensayo L280-PCR

A fin de evaluar la especificidad de los oligonucleótidos F1/B2 en la identificación de las especies del subgénero Leishmania se procedió a realizar el ensayo L280-PCR en diferentes condiciones de rigurosidad, empleando además de los ADNs previamente evaluados, el ADN de otros organismos kinetoplástidos (Figura 4). Los resultados muestran un producto principal de amplificación de 260 pb a la temperatura de 55°C (Figura 4A), al igual que a 60°C (Figura 4B) donde fue único, en las especies del subgénero Leishmania (Panel A, líneas 2 a 5 y 13; Panel B, líneas 2 a 5, 8, 13 y 19). Al igual que a 50°C, ningún producto del tamaño esperado se obtuvo a 55 o 60°C con el ADN de ninguna especie del subgénero Leishmania del Viejo Mundo utilizadas en este estudio (Panel A y B, línea 7), ni de las especies del subgénero Viannia (Panel A y B, líneas 9 a 12), como tampoco de otros kinetoplastidas (Panel A y B, líneas 14 a 17) o humano (Panel A y B, línea 18). Los resultados sugieren la ausencia de la secuencia L280 en el subgénero Viannia y en otros organismos kinetoplastidos, al igual que una gran especificidad del ensayo para especies del subgénero Leishmania con excepción de L. (L.) tropica y L. (L.) major.

Figura 4. Especificidad del ensayo L280-PCR. El mismo ensayo de amplificación para la secuencia de ADN L280 descrito en la Figura 3, fue evaluado a una temperatura de 55°C (A) y 60°C (B), utilizando el ADN genómico de Leishmania spp. y otros organismos que incluyeron otros kinetoplástidos y humano. Las especies del subgénero Leishmania están representada por L. (L.) mexicana BEL 21 (A y B, líneas 2 y 13), L. (L.) mexicana M379 (A y B, línea 3) y la cepa venezolana M9012 (A y B, línea 5; B, línea 8), L. (L.) amazonensis NR (A y B, línea 4), L. (L.) enriettii (A y B, línea 5), y L. (L.) tropica (A y B, línea 7); las del subgénero Viannia por L. (V.) braziliensis M2903 (A, línea 8; A y B, línea 9), y (línea 6), L. (V.) guyanensis M4147 (A y B, línea 10), L. (V.) lainsoni M6426 (A y B, línea 11), y L. (V.) panamensis LS94 (A y B, línea 12). Otros kinetoplástidos: Trypanosoma cruzi (A y B, línea 14), T. rangeli (A y B, línea 15), Leptomona spp. (A y B, línea 16), Crithidia spp. (A y B, línea 17); humano (A y B, línea 18). El ADN-ΦX174 RF Hae III fue utilizado como marcador de peso molecular (no indicado) y una muestra sin ADN representó el control de reactivos (A y B, línea 1). La flecha indica el producto esperado de 260 pb.

Una evaluación adicional de la especificidad de la secuencia L280, se llevó a cabo a través de la amplificación de un segundo marcador genérico para las distintas especies de Leishmania en el ensayo L280-PCR. Para ello se procedió a incorporar un segundo par de oligonucléotidos que amplifica una región de 900 pb del gen de la beta tubulina, el cual es común tanto para el subgénero Leishmania como para el subgénero Viannia (Figura 5). Los resultados muestran que cuando el ADN utilizado en el ensayo múltiple de PCR correspondía a especie de Leishmania del subgénero Leishmania (Figura 5A), se produjeron dos productos de amplificación con un tamaño de 900 y 260 pb (líneas 2, 3 y 4), mientras que un único producto de 900 pb fue obtenido para especies del subgénero Viannia (línea 5). Comparativamente, se llevó a cabo un ensayo similar utilizando la amplificación de la secuencia b500, especifica del subgénero Viannia [10] (Figura 5B), demostrándose un producto único de amplificación de 900 pb en las cepas pertenecientes al subgénero Leishmania (líneas 2, 3 y 5), y dos productos de 900 y 375 pb en cepas pertenecientes al subgénero Viannia (línea 6 y 7). Es de hacer notar que el ADN genómico de la especie del Viejo Mundo L. (L.) donovani fue positivo en la amplificación de L280. Los resultados confirman la especificidad de las secuencias L280 y b500.

Figura 5. Ensayo de PCR múltiple en la identificación de Leishmania spp. El ADN genómico de especies representativas del subgénero Viannia y Leishmania fue sometido en forma independiente, a los ensayos L280-PCR (A) y b500-PCR (B) a una alta rigurosidad (60°C), incluyendo en cada caso un segundo par de oligonucléotidos (Tub1 y Tub 6) que amplifica en forma específica un fragmento de 900 pb de la región de codificación del gen de la b tubulina. Las muestras corresponden a las amplificaciones de L. (L.) mexicana BEL 21 (A y B, línea 2), L. (L.) amazonensis NR (A y B, línea 3), L. (L.) donovani DD8 (A, línea 4; y B, línea 5), L. (V.) braziliensis M2903 (A, línea 5; y B, línea 6), y una muestra de una biopsia (B, línea 7). El ADN-ΦX174 RF Hae III fue utilizado como marcador de peso molecular en el ensayo L280-PCR (A, línea 1), mientras que 1 kb ADN ladder fue uti-lizado como marcador de peso molecular en el ensayo b500-PCR (B, línea 1) y una muestra sin ADN representó el control de reactivos (B, línea 4). Las flechas y números de la derecha representan la ubicación y tamaño (pb) de los productos del ensayo de PCR.

Discusión

 La identificación precisa de un organismo patógeno, representa un punto clave en el diagnóstico temprano de la enfermedad, siendo de suma importancia en la implementación y evaluación de programas de tratamiento y control de la misma. La leishmaniasis es una enfermedad compleja causada por diferentes especies del protozoario perteneciente al género Leishmania; muchas han sido las aproximaciones realizadas en pro del desarrollo de técnicas moleculares que puedan ser utilizadas en la identificación de estos parásitos, para luego ser aplicadas en estudios epidemiológicos. Estudios previos, han puesto de manifiesto la utilidad de metodologías moleculares como el análisis del polimorfismo de restricción (RFLP) [17] y la técnica de PCR [12,13], además del uso de secuencias de ADN repetitivo como los mini-círculos del kADN o secuencias de ADN genómico como el mini-exón, la región de los genes de la b tubulina ej. ADN b500, entre otras, en la identificación específica de las distintas especies del género Leishmania. En el caso particular del subgénero Viannia un ensayo de PCR, b500-PCR, ha sido implementado para la detección e identificación especifica de las especies que conforman este subgénero, donde condiciones de alta rigurosidad (60°C) produce un producto de amplificación de 375 pb que tipifica a las especies de Leishmania del subgénero Viannia [10,17].

En este trabajo se identificó y evaluó, mediante técnicas de biología molecular, la utilidad de una nueva secuencia de ADN genómico de 280 pb (L280), como un marcador molecular en la identificación de especies de Leishmania pertenecientes al subgénero Leishmania. Inicialmente, la secuencia L280 fue obtenida del ADN genómico de la cepa de referencia L. (L.) mexicana BEL21 luego de aplicar el ensayo b500-PCR en condiciones de baja rigurosidad (50°C) donde se generaron dos fragmentos, uno de 280 (L280) y otro de 260 pb [10,11,17]. La secuenciación parcial del fragmento L280 aislado de la cepa de referencia, permitió la selección del par de oligonucleótidos F1/B2 y establecer las condiciones de un ensayo de amplificación L280-PCR, cuyo producto principal, a las distintas condiciones de rigurosidad evaluadas, fue de 260 pb. Dicho ensayo fue específico en la identificación a nivel de subgénero de las especies representativas del subgénero Leishmania tanto del Nuevo como del Viejo Mundo. La excepción, en nuestro estudio, dentro del subgénero Leishmania fue L. (L.) tropica y L. (L.) major, lo cual nos obliga a ampliar la evaluación del ensayo en otros aislados de estas cepas a fin de determinar la presencia o ausencia de L280. Los resultados apoyan la idea de que la secuencia L280 es específica del subgénero Leishmania, lo cual se evidencia al no observarse ninguna señal de 260 pb en las especies del subgénero Viannia, ni en otros organismos kinetoplástidos. Estudios preliminares de hibridación molecular (no mostrados), utilizando como sonda el fragmento generado en el ensayo L280-PCR, sugieren que todos los productos de PCR de las especies del subgénero Leishmania, utilizadas en este estudio, guardan homología con la secuencia L280; mientras que las reacciones de hibridación realizadas con el fragmento de 375 pb generado del ensayo b500-PCR especifico de especies del subgénero Viannia, fueron negativas para aislados pertenecientes al subgénero Leishmania. El estudio comparativo entre los ensayos L280-PCR y b500-PCR, utilizando una alta rigurosidad (60°C), pone en evidencia que cada secuencia, L280 y b500, es específica para el subgénero de donde fue aislada. Actualmente, se adelantan protocolos de secuenciación del producto originado por cada una de las especies en estudio, a fin de establecer entre ellos el grado de homología de la secuencia L280. Igualmente, es necesario llevar a cabo la evaluación de la sensibilidad del ensayo L280-PCR, así como su implementación en muestras clínicas.

Estudios previos demuestran la potencialidad de identificar estos parásitos a través de un ensayo de PCR múltiple, utilizando los genes del mini-exón [15]. Tomando en cuenta la especificidad señalada anteriormente, queda por determinar si es posible estandarizar el mismo ensayo con una combinación entre los oligonucleótidos de las secuencias b500 y L280, permitiendo la identificación de las especies de ambos subgéneros dentro de una misma prueba (PCR múltiple), lo cual reviste particular importancia en el desarrollo de estudios epidemiológicos de la enfermedad.

Resumiendo, podemos concluir que la secuencia de ADN L280 es específica de las especies del subgénero Leishmania y no parece estar presente en las especies del subgénero Viannia como tampoco en otros kinetoplástidos. Un ensayo de PCR establecido a partir de la secuencia L280 (L280-PCR), permitió la identificación de las especies del subgénero Leishmania, del Nuevo Mundo al igual que la especie L. (L.) donovani del Viejo Mundo.

Agradecimientos

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