Normig Zoghbi^a, Luis Ojeda^a, Nirza Noguera^b, Antonio Yépez^c, Hendricka Camargo^c, Francisco Triana-Alonso^c*

^aDepartamento de Fisiología y Bioquímica, Escuela de Medicina, Universidad de Carabobo - Sede Aragua, Maracay-Venezuela.

^bDepartamento de Física Química y Matemáticas, Escuela de Bioanálisis, Universidad de Carabobo - Sede Aragua, Maracay-Venezuela.

^cInstituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad de Carabobo (BIOMED-UC), Maracay-Venezuela.

* Correspondencia: E-mail: biomed@uc.edu.ve

Resumen

La enzima glucosa oxidasa (GOX) es componente esencial de reactivos para determinación de glicemia y otros parámetros paraclínicos. Para su producción suele utilizarse Aspergillus niger cultivado en medios con sustratos costosos de grado analítico. Por tanto, se planteó purificar GOX producida por A. niger, cultivado con nutrientes complejos y económicos, y evaluar su efectividad en mediciones de concentración de glucosa. Para ello se formularon 4 tipos de medio, uno estándar y tres alternativos con azúcar industrial y fertilizantes. Los cultivos se realizaron en fiolas con 50 mL de medio bajo un diseño de bloques al azar, evaluando el crecimiento y la actividad enzimática. El medio alternativo con mejor rendimiento fue seleccionado para producción en biorreactores de 5 L y posterior purificación de GOX (fraccionamiento salino y cromatografías en Sephadex G-25 y DEAE-Sephacel). Se obtuvieron altos rendimientos de enzima (7 mg por carga) de alta pureza (39000 U/g) y un K_M aparente para glucosa de 22 ± 1 mM. El reactivo de diagnóstico formulado presentó un intervalo de linealidad óptima (de 50 a 600 mg/dL de glucosa). Por lo que se concluyó que los sustratos en el medio de cultivo alternativo no interfieren en la calidad y cantidad del producto purificado. 

Palabras Claves: Glucosa oxidasa, diagnóstico, glicemia, Aspergillus niger

Extraction and purification of glucose oxidase for diagnostic purposes produced in media based on fertilizers and industrial sugar

The enzyme glucose oxidase (GOX) is an essential component of reagents used for determining blood sugar and other clinical parameters. Aspergillus niger grown in media prepared with expensive analytical grade substrates is used for its production. Therefore, we decided to purify GOX produced by A. niger  grown in media with complex and inexpensive nutrients and to evaluate its efficiency in glucose concentration measurement assays. For this purpose we formulated four types of media, one standard and other three alternatives in which we used industrial sugar and fertilizers. The cultures were done in 50 mL flasks under a random block design, evaluating growth and enzymatic activity. The alternative medium with the best yield was selected for production in 5 liter bioreactors and later GOX purification (saline fractioning and Sephadex G-25 and DEAE-Sephacel chromatography ). Two large enzyme yields were obtained (7 mg per load), highly purified (39000 U/g), and with an apparent 22 ± 1 mM glucose K_M. The diagnostic reagent formulated presented an optimal linearity interval (between 50 and 60 mg/dL glucose). Therefore, it was concluded that the substrates in the alternative culture medium did not interfere in the quality and quantity of the purified product.

Key words: glucose oxidase, diagnosis, glycemia, Aspergillus niger

Recibido 28 de noviembre de 2007; aceptado 05 de febrero de 2008

La glucosa oxidasa (E.C.1.1.3.4) es una glicoproteína dependiente de FAD, que cataliza la oxidación de la b-D-glucosa, por la vía del D-glucano-d-lactona, hacia ácido glucónico y peróxido de hidrógeno, usando el oxígeno molecular como aceptor final de electrones [1]. Es muy utilizada a nivel industrial, es un aditivo importante para la conservación de alimentos y forma parte de los reactivos para determinación de glicemia y otros parámetros paraclínicos. Las primeras extracciones fueron realizadas por Müller en 1928, a partir de las cepas Aspergillus niger y Penicillium glaucum, posteriormente se han encontrado muchas especies productoras; sin embargo, las de mayor rendimiento pertenecen a estos dos géneros [2]. Los sustratos que se utilizan para el cultivo, son muy variables y van desde fuentes complejas como: suero de queso, licor de maíz, melazas, hidrolizados proteicos; hasta fuentes definidas como: glucosa y sales minerales [3]. La selección de los sustratos para el cultivo depende de la naturaleza del producto a obtener, su futuro uso y valor agregado, ya que estos aspectos condicionan los procesos y técnicas de extracción y purificación. En esta investigación se planteó, producir GOX a partir de A. niger usando sustratos complejos como el azúcar industrial y algunos fertilizantes, y probar su efectividad en la determinación de concentración de glucosa.

Materiales y Métodos

Microorganismos

Se utilizó una cepa silvestre del hongo A. niger estandarizada, proveniente del Dpto. de Microbiología de la Escuela de Bioanálisis de la Universidad de Carabobo, Venezuela.

Cultivos en fiola

Se establecieron 4 tipos de medios de cultivo y se probaron en cultivos de 50 mL, a fin de evaluar el crecimiento y la actividad enzimática exportada al caldo de fermentación. Como medio estándar (Est) se utilizó uno a base de glucosa y sales minerales [4]. Los medios alternativos fueron elaborados siguiendo la formulación de éste, haciendo sustitución de al menos 2 de los constituyentes. En todos los casos la glucosa se sustituyó por azúcar industrial (sacarosa) y al menos una de las sales nutritivas fue sustituida por un fertilizante comercial (Tabla 1).

El pH de todos los medios de cultivo fue ajustado a 7 y se esterilizaron a 121ºC por 15 min. La inoculación se realizó con esporas, a razón de 250.000 esporas/mL de medio. Los cultivos se llevaron a cabo en incubador a 30ºC por 36 h con agitación a 200 rpm. El micelio y el caldo de fermentación fueron separados por centrifugación a 6000 rpm por 20 min. El micelio fue colocado en estufa a 90°C hasta alcanzar peso seco y al caldo de fermentación (o extracto crudo) se le midió el volumen, el pH y la actividad enzimática. También se procedió a realizar la precipitación salina del caldo (con sulfato de amonio hasta el 80% de saturación), a fin de obtener un extracto parcialmente purificado de la enzima y hacer mediciones de actividad.

Cultivos en biorreactores

Para la producción y purificación de la enzima, se llevaron a cabo cultivos en un biorreactor de 5 L (New Brunswick, Modelo Bioflo 2000). Las condiciones de incubación fueron similares, 30ºC con suministro de aire a razón de 2 L/min por 36 h con una agitación de 200 rpm, monitoreando los cambios de peso, pH y consumo de oxígeno durante el tiempo de incubación. La recuperación se realizó por filtración y al extracto crudo obtenido se le determinó el contenido proteico y la actividad enzimática, antes de someterlo a los procesos de extracción y purificación.

Contenido proteico

Para la estimación se tomaron las lecturas de absorbancia de las muestras, a las longitudes de 260 y 280 nm y aplicó la fórmula (1,55*Abs 280) – (0,76*Abs 260) [5]. El equipo utilizado para tomar las mediciones, fue un espectrofotómetro Beckman Modelo Du 650.

Actividad enzimática

La actividad de GOX se evaluó midiendo la producción de peróxido de hidrógeno a partir de glucosa colocada como sustrato en el ensayo. Para ello se utilizó la modalidad de acoplamiento con peroxidasa, usando la 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) como cosustrato [6]. La mezcla de reacción contenía 30 µL de TMB 0,4 g/L oxigenado por 10 min; 1,4 µl de una solución de peroxidasa de 4,3 mg/mL en de buffer fosfato 0,05 M pH:6,9; 5 µL de de β-D-glucosa 4 mM; y 0,1-0,2 µg de proteínas de cada muestra diluidas en un determinado volumen de buffer fosfato 0,05M (pH 7). Esta mezcla se incubó por 10 minutos a 25 ºС y la reacción se detuvo agregando 50 µL de HCl 0,1 N. Las lecturas de absorbancia se realizaron a 450 nm (máximo de absorbancia del producto de oxidación del TMB) y los resultados se expresaron tanto en variación de la absorbancia por unidad de volumen (∆Abs450nm/ml) como en unidades de actividad. Para el cálculo de éstas se utilizó el coeficiente de extinción molar del TMB (5,9x10⁴ M^-1cm^-1) y se definió como la cantidad de glucosa oxidasa que cataliza la oxidación de 1 µmol de a-D-glucosa por minuto a pH 7 y a 25°C.

Técnicas de extracción y purificación

En esta investigación se trabajó con la enzima extracelular, por lo que la purificación de la misma se hizo a partir del caldo de fermentación, separado por centrifugación y/o filtración del micelio. Se inició el proceso de extracción por fraccionamiento salino, con sulfato de amonio al 80% en frío (4ºC) bajo agitación. Cuando se disolvió completamente la sal, se dejó en reposo durante 12 horas y luego se centrifugó a 6500 rpm por 30 min. El sobrenadante fue descartado y el sedimento fue lavado con sulfato de amonio al 80% y resuspendido en buffer Tris-HCl (pH 7,5) 20 mM; NaCl 350 mM y Glicerol al 2%, para extraer la GOX y tener así el extracto parcialmente purificado. Para purificación ulterior, dicho extracto fue sometido a una cromatografía de exclusión molecular, en Sephadex G-25, para eliminar el exceso de sal. La columna fue equilibrada en el buffer de resuspensión y a las fracciones obtenidas se les determinó la presencia de sulfato de amonio, la cantidad de proteínas por estimación 260-280 nm, y la actividad enzimática. Se agruparon las fracciones de mayor contenido de GOX y sin sal. Este volumen fue concentrado por ultrafiltración usando membranas de corte en 10 kD (AMICON). El concentrado fue sometido a cromatografía en una columna de DEAE-Sephacel (Sigma) equilibrada en Tris-HCl (pH 7,5) 10 mM. La elución de la proteína se efectuó mediante un gradiente optimizado de NaCl como se indica. A las fracciones obtenidas se les realizó estimación de contenido proteico y actividad enzimática.

Para determinar la presencia y calidad de la proteína aislada, se procedió realizar análisis electroforético en condiciones desnaturalizantes usando geles de poliacrilamida-SDS al 10% [7]. Los polipéptidos separados se visualizaron mediante tinción con nitrato de plata [8].

Parámetros cinéticos de la actividad enzimática de GOX (K_M)

Se realizó la determinación del K_M para la glucosa como sustrato, mediante ensayos de actividad enzimática de GOX utilizando concentraciones variables de glucosa, desde 0 hasta 250 mM. Los resultados se analizaron para verificar el cumplimiento de postulados establecidos por Michaelis y Menten.

Determinación de concentración de glucosa

A fin de dar un futuro uso a la enzima purificada en esta investigación en el área clínica y de diagnóstico, se procedió a diseñar un reactivo para la determinación de glucosa [9, 6]. Para establecer las concentraciones y cantidades de cada uno de los componentes que conformaron este reactivo, se optimizaron sus concentraciones tomando como base la información contenida en los folletos informativos de diversos reactivos comerciales hasta estandarizar la respuesta del reactivo diseñado (Tabla 2). Para la preparación del reactivo se mezclaron todos los componentes en las concentraciones optimizadas para la reacción. La reacción inició mezclando 200 μL del reactivo preparado con 2 μL de solución patrón de glucosa o agua (blanco reactivo), respectivamente. Las mezclas de reacción se incubaron durante 10 min a 37°C y posteriormente se realizaron las lecturas de absorbancia a 505 nm. Para evaluar la linealidad de respuesta del reactivo se utilizaron soluciones patrón de glucosa entre 50 mM y 600 mM.. Las lecturas de absorbancia se realizaron en un espectrofotómetro Beckman Du 650, calibrado con el blanco del reactivo. Simultáneamente se realizó el mismo ensayo empleando un reactivo comercial (Sigma) con soluciones patrones dentro del rango de linealidad reportado por esa empresa (desde 100 hasta 500 mg/dL).

 Tabla 2. Concentraciones de los componentes del reactivo de determinación de glicemia.

Fuente: Zoghbi (2006).

Análisis estadístico

Los resultados de las variables peso, volumen de caldo de fermentación recuperado, la actividad enzimática del mismo y del extracto crudo, obtenidos de los cultivos en fiolas, fueron analizados por la Prueba de Friedman, con un nivel de significación de 0,05 y así, establecer si existían diferencias significativas entre los diferentes medios probados. En función de estos resultados, se seleccionó el medio para la producción y purificación de la enzima que se utilizó en la preparación del reactivo diagnóstico.

Cultivos en fiolas

Al formular los medios se observó que, en el caso del medio estándar, durante la esterilización la glucosa se caramelizaba al mezclarse con los otros constituyentes del medio. El problema se resolvió esterilizando separadamente la glucosa. Esta situación no se presentó en el caso de los medios alternativos, que fueron formulados completamente y esterilizados en un solo paso. En todos los medios de cultivo utilizados se observó crecimiento de A. niger, con formación de un micelio esférico regular. Sin embargo, se observaron diferencias significativas en cuanto al peso (p= 0,0112), siendo los de menor rendimiento los medios estándar y alternativo II, con 1 ± 0.6 y 0,6 ± 0.2 g/L, respectivamente. Los medios alternativos I y III arrojaron los mayores valores alrededor de 2 g (Figura 1A). En las variables volumen de caldo de cultivo recuperado y actividad enzimática del extracto crudo (expresada como las variables volumen de caldo de cultivo recuperado y actividad enzimática del extracto crudo (expresada como ∆Abs450/ml), también se encontraron diferencias significativas (p= 0,0206 y 0,0112).

Los volúmenes recuperados más altos correspondieron a aquellos medios con menor rendimiento de biomasa, estándar y alternativo II, y la mayor actividad en extracto crudo el medio alternativo I seguido por el III , quedando por debajo el alternativo II; pero todos significativamente superiores al medio estándar Figura 1A y 1B. Sin embargo, las actividades de los extractos parcialmente purificados mediante fraccionamiento salino, no mostraron diferencias al nivel de significancia que se estaba trabajando (p = 0,0576), debido a que, probablemente, el procedimiento de extracción favorece a la homogenización de los extractos. 

Cultivos a mediana escala

A partir de los resultados de los cultivos en fiolas, se seleccionó el medio alternativo I para desarrollar el medio de producción en el biorreactor de 5 L. Durante el desarrollo del cultivo se evidenció que el período de latencia duró aproximadamente 12 horas. Superado este tiempo hubo incrementos significativos en el peso húmedo de las muestras de 10 mL acompañados por un descenso de la densidad de oxígeno disuelto (indicación de metabolismo aeróbico activo). A las 24 horas, en plena fase logarítmica de crecimiento, el oxígeno disuelto alcanzó su nivel mínimo (12-15%), el cual se mantuvo relativamente constante hasta las 36 horas (con ligera pendiente negativa). En cuanto al pH, se mantuvo estable hasta las 22 horas (alrededor de 6,75), tiempo a partir del cual ocurrió un descenso marcado hasta un pH 6,0 que se mantuvo hasta el final del cultivo (Figura 2). El rendimiento obtenido al final del proceso fue de 3,2 L de extracto crudo (caldo de cultivo), con un estimado proteico de 2,99 mg/mL y un peso húmedo del micelio 260g.

Extracción y purificación

La adaptación del procedimiento previamente optimizado para cultivos a pequeña escala [6] funcionó eficientemente para la purificación de la actividad enzimática a partir de caldos de cultivo obtenidos del biorreactor. El fraccionamiento salino permitió el incremento de la concentración proteica desde 2,99 mg/mL hasta 9,61 mg/mL, así como de la actividad específica, la cual pasó de valores entre 60 - 80 U/g hasta 250 – 300 U/g aproximadamente. Durante la desalinización por cromatografía en columna Sephadex G-25, se evidenció un proceso de separación eficiente, rápido y sin riesgo de inactivación enzimática. En el perfil cromatográfico se observó que la actividad enzimática de GOX comenzó a eluir de la columna en el volumen de exclusión coincidiendo con el máximo de absorbancia a 280 nm (Figura 3). Con este paso de purificación se logró un incremento significativo de la actividad específica entre 2000-2500 U/g. Uno de los factores importantes para este aumento fue, probablemente, la eliminación de la gluconolactona y/o el gluconato derivado que aparecen en el medio durante la fermentación. Se ha reportado que el gluconato inhibe a la glucosa oxidasa por competir con el sustrato (glucosa) por su sitio de unión [10,11]. Además el paso de filtración molecular elimina una porción importante de material que absorbe a 280 nm. Esto indica la eliminación de péptidos pequeños que contribuyen a la concentración de proteínas calculada en el material inicial.

El esquema de fraccionamiento en DEAE-Sephacel diseñado con un gradiente salino lineal, desde 100 mM hasta 600 mM NaCl (seguido por un incremento a 1 M NaCl), permitió la elución de la enzima a valores aproximados a 400 mM de la sal, logrando así la eliminación satisfactoria de elementos contaminantes y recuperando más del 65% de la actividad total de la muestra (270 U), con un incremento de la actividad específica alrededor de 20 veces (39.000 U/g).

Este factor de purificación es inusualmente alto para cromatografías de intercambio iónico. Sin embargo, en este caso se justifica por el gran pico de material contaminante separado que eluye después de incrementar la concentración de NaCl a 1 M (Figura 4).

Evaluación de la calidad del extracto enzimático purificado

El preparado enzimático purificado fue sometido a pruebas de calidad, comparando su integridad estructural con respecto a preparados comerciales de la enzima (Sigma). Se observó que el preparado purificado presentó un perfil electroforético similar al producto comercial, sin evidencia de procesos de degradación ni contaminantes mayores (Figura 5). La calidad del producto purificado, también fue estimada a través de la determinación del K_M para el sussustrato glucosa. Los resultados demostraron un comportamiento enzimático ajustado a la ecuación de Michaelis-Menten, con la forma hiperbólica típica (Figura 6A). Las representaciones de dobles recíprocos (Figura 6B) y Eadie-Hofstee (Figura 6C) dieron un buen ajuste a líneas rectas (coeficientes de correlación lineal: 0,99 y 0,95, respectivamente) y los valores estimados de K_M aparente para la glucosa fueron  bastante cercanos: 21 mM y 23 mM, respectivamente; como se espera en caso de una enzima que siga el mecanismo propuesto por Michaelis y Menten. El valor estimado promedio del K_M aparente (22 ± 1 mM) está en el orden de los valores reportados previamente para preparaciones purificadas de glucosa oxidasa de Aspergillus niger [12-15].

Tinción con nitrato de plata. Las flechas indican la posición de contaminantes de alto peso molecular en el preparado comercial.

Linealidad del reactivo para la determinación de glicemia

Conclusiones

Los resultados obtenidos demostraron que la enzima purificada fue de buena calidad y que el medio de cultivo a base de fertilizantes y azúcar industrial, como sustitutos de las sales minerales, hidrolizados de proteínas y de la glucosa, aportan todos los nutrientes que necesita el hongo para su crecimiento y la producción de la enzima. Otro aspecto importante es que dichos componentes del medio no ocasionaron interferencias detectables en los procesos de extracción y purificación, ni sobre la calidad del producto final. Esto constituye una ventaja, que puede ser aprovechada para reducir los costos de producción de enzimas a partir de microorganismos cultivados usando materiales económicos y de producción nacional. Al mismo tiempo se eliminan los tiempos de espera por productos importados de alto valor agregado como son las enzimas con fines diagnósticos.

Agradecimientos

A la Prof. Rosa Cristina Pérez del Departamento de Microbiología de la Escuela de Bioanálisis de la Universidad de Carabobo - Sede Aragua, por proveer la cepa de Aspergillus niger usada en este estudio. A la Lic. Ninoska Ramírez y el Lic. Edgar Tovar, por la excelente asistencia técnica durante el desarrollo experimental.

Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología (Proyecto: Purificación de componentes biológicos para la producción de reactivos de diagnóstico al servicio de la salud); FONACIT (Proyecto: Pem-2001002174; Beca de la Prof. Normig Zoghbi para estudios de Maestría en Ciencias Biomédicas en el BIOMED-UC); OPSU (Financiamiento del Programa Alma Mater para la Prof. Nirza Noguera).

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