Yasmina Araquea,b,*, Juana Vitelli-Floresc, Alvaro Ramírezc, Guillermina Alonsoc,d Vidal Rodríguez Lemoinec,d,e
Postgrado Ciencias Médicas Fundamentales, Universidad de Los Andes, estado Mérida
bDepartamento de Bioanálisis. Universidad de Oriente, estado Sucre
cCentro Venezolano de Colecciones de Microorganismos, Universidad Central de Venezuela. Caracas
dLaboratorio de Biología de Plásmidos. Instituto de Biología Experimental. Universidad Central de Venezuela. Caracas
eAcademia de Ciencias Físicas, Matemáticas y Naturales
* Correspondencia: E-mail: yamasi40@gmail.com
Resumen: Burkholderia cepacia es un bacilo gramnegativo no fermentador (BGNNF) reconocido como un patógeno oportunista para humanos y como agente causante de daño en cultivos vegetales. Su identificación es difícil y laboriosa confundiéndose a menudo con taxones relacionados. En este trabajo se examina, mediante técnicas bioquímicas y PCR especie-específica, una colección de 74 cepas de BGNNF de origen hospitalario y ambiental, con el objetivo de evaluar las condiciones para la identificación de rutina de B. cepacia en el medio hospitalario. El empleo de métodos comerciales automatizados, pruebas bioquímicas convencionales y una selección de pruebas complementarias permitió la identificación satisfactoria de 28 (37,8%) como B. cepacia, 15 (20,3%) S. maltophilia, 9 (12.2 %) A. xylosoxidans, 19 (25.6%) especies de Pseudomonas, 1 Ralstonia (1,4%) y 2 no identificadas. El empleo de PCR permitió confirmar la identificación del género Burkholderia y la caracterización de las especies o genomovares dentro del Complejo B. cepacia (CBc). La mayoría (12) pertenece al genomovar I (B. cepacia), 5 al II (B. multivorans); 3 al III (B. cenocepacia), 1 al IV (B. stabilis), y 7 al grupo V (B. vietnamiensis). El uso combinado de estas metodologías permitió la identificación precisa de miembros del CBc en muestras de origen hospitalario y ambiental.
Palabras clave: Burkholderia cepacia, BGNNF, PCR, Genomovares
]]> Biochemical and specie-specific PCR identification of Burkholderia cepacia strains from hospital and environmental sources in VenezuelaAbstrac: Burkholderia cepacia is a non fermentative grannegative bacilli (NFGNB) known as an opportunists pathogen for human beings and associated with plant diseases. Its identification is a difficult task, being usually confused with related genera. In this work a collection of 74 NFGNB from environmental and hospital sources were examined by biochemical and PCR methods in order to evaluate the conditions for hospital identification of B. cepacia. The use of conventional biochemical methods, and a selection of complementary tests allowed a satisfactory identification of 28 (37,8%) as B. cepacia, 15 (20,3%) S. maltophilia, 9 (12.2 %) A. xylosoxidans, 19 (25,6%) other Pseudomonas, 1 Ralstonia (1,4%) and 2 non identified ((2.7%). By PCR B. cepacia identification was confirmed and the genomovars or species of the B. cepacia complex (BcC) were differenciated. The majority (12) belongs to the genomovar I (B. cepacia), 5 to II (B. multivorans), 3 to III (B. cenocepacia), 1 to IV (B. stabilis), and 7 to the B. vietnamiensis group. The use of biochemical and molecular methods allowed us the identification of BcC members from environmental and hospital sources.
Keywords: Burkholderia cepacia, BGNNF, PCR, Genomovars
Recibido 10 de octubre de 2007; aceptado 13 de febrero de 2008
Introducción
Burkholderia cepacia, es un bacilo gramnegativo no fermentador (BGNNF) identificado en 1950 por Burkholder como un agente fitopatógeno responsable de la podredumbre de los bulbos de cebolla. Fue originalmente asignado al género Pseudomonas como P. cepacia [1], recibiendo a lo largo del tiempo otras denominaciones como P. multivorans y P. kingii [2]. Aunque B. cepacia no forma parte de la flora normal en humanos, se encuentra a menudo como un agente patógeno oportunista asociado a brotes nosocomiales así como a infecciones en pacientes con fibrosis quística y con enfermedad granulomatosa crónica [3-6].
Los miembros del género Burkholderia poseen un genoma complejo, formado por varios replicones, que le proporciona una extraordinaria versatilidad metabólica y capacidad de adaptación a nuevos ambientes [7]. Se encuentran frecuentemente en ambientes acuáticos, suelos y en relaciones simbióticas con otros microorganismos, animales y plantas [8].
B. cepacia es difícil de aislar debido a su lento crecimiento respecto a otros microorganismos con los cuales comparte un mismo nicho ecológico [9]. Su identificación es una tarea laboriosa y compleja que demanda laboratorios con personal entrenado a los fines de evitar los errores o limitaciones que se observan en los reportes clínicos o en estudios sobre microorganismos asociados al medio ambiente [10]. A menudo B. cepacia es reportada como Pseudomonas spp. Para una correcta identificación es necesario emplear medios de cultivo diferenciales, sistemas automatizados y ensayos bioquímicos complementarios [11,12]. Con frecuencia debe recurrirse a métodos moleculares, de alto costo pero de mayor sensibilidad y especificidad, como la reacción en cadena de polimerasa, (PCR por sus siglas en inglés), electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), tipificación de secuencias de ADN, ribotipificación o una combinación de estas técnicas [13]. El empleo de técnicas moleculares ha puesto de relieve la complejidad taxonómica del grupo, denominado Complejo Burkholderia cepacia (CBc), el cual incluye más de 20 especies o genomovares [14, 15].
La identificación de B. cepacia, a nivel de hospitales sigue siendo un problema debido a la falta de disponibilidad de técnicas de biología molecular. Este trabajo está dirigido al estudio y evaluación de las condiciones para la identificación de B. cepacia empleando métodos bioquímicos convencionales o automatizados y una selección de pruebas bioquímicas complementarias disponibles en la mayoría de los centros hospitalarios. Esto permitiría orientar la identificación del género Burkholderia entre los BGNNF encontrados en diferentes servicios de hospitalización. Se incorporó la técnica de PCR especie-especifica como una herramienta de validación, a nivel de especies o genomavares, de los resultados obtenidos mediante la aplicación de las pruebas bioquímicas propuestas. En forma complementaria se evaló una selección de muestras provenientes de cultivos de frutas, legumbres y hortalizas que pudieran actuar como reservorios potenciales de este patógeno oportunista.
Materiales y métodos
]]> MicroorganismosLos microorganismos empleados en este estudio forman parte de una colección de 156 cepas identificadas originalmente como BGNNF o Pseudomonas spp. aisladas durante los meses de enero 2001 a diciembre 2002, de pacientes con diagnóstico de infección nosocomial en hospitales de las ciudades de Caracas, Cumaná y Mérida (Venezuela), y en muestras de origen ambiental. Para este trabajo se seleccionaron al azar 74 cepas: 49 aisladas de pacientes hospitalizados y 25 de origen ambiental.
Como cepas de referencia se emplearon: B. cepacia CVCM 626 (derivada de la cepa ATCC 25416) y E. coli CVCM 73. Todas las cepas están depositadas en el Centro Venezolano de Colecciones de Microorganismos [16].
Identificación fenotípica de B. cepacia y organismos relacionados
a. Siembra y aislamiento
Todas las cepas fueron subcultivadas en agar Luria Bertani (LB), y agar MacConkey, incubadas a 30°C (aislados ambientales) o 37°C (aislados nosocomiales) por períodos de 24 a 72 horas. Las colonias desarrolladas fueron seleccionadas según aspecto, consistencia, tamaño, forma y producción de pigmento. Fueron sembradas en medio de Kligler para comprobar la característica de no fermentador. La pureza de los cultivos se comprobó mediante reaislamiento en medios apropiados y la observación microscópica de bacilos gramnegativos.
b. Métodos convencionales
b1. Caracterización preliminar
Para la identificación de BGNNF a nivel de género y especie se emplearon las siguientes pruebas preliminares: citocromo-oxidasa, siembra en medio basal OF (oxidación- fermentación) suplementado con 1% de glucosa, agar LB incubado a 42°C y medio semisólido de motilidad (agar LB 0.3%) suplementado con el colorante TTC (2´3´5 cloruro de trifenil-tetrazolio) [17,18].
b2. Pruebas complementarias
]]> Las pruebas bioquímicas complementarias empleadas fueron: siembra en medio basal OF (oxidaciónfermentación) suplementado con 1% de los siguientes carbohidratos: maltosa, manitol, xylosa, fructosa y lactosa, determinación de arginina dehidrolasa, lisina descarboxilasa, hidrólisis de la esculina y de la gelatina. La incubación se llevó a cabo bajo las mismas condiciones empleadas en las pruebas preliminares. Adicionalmente se realizó la prueba de resistencia a la polimixina B (300 U) y de crecimiento en agar LB con polimixina B (600 U) a 30°C y 37°C. Los aislados identificados se conservaron en agar LB a temperatura ambiente (punciones) y en caldo tripticasa soya con glicerol al 20% a -20°C.c. Sistema automatizado ATB/Plus
Se utilizó el sistema comercial automatizado ATB/Plus (BioMerieux, St Louis, MO, USA), empleando las galerías API 20 NE e ID 32 GN siguiendo las instrucciones de la casa fabricante. En el caso de PI 20 NE la incubación se realizó por períodos de 24 a 96 horas. La lectura de las reacciones producidas, espontáneas o reveladas mediante la adición de reactivos, se llevó a cabo mediante el registro manual de los datos y su incorporación al sistema ATB/Plus para su procesamiento. Las galerías ID 32 GN se incubaron a 30°C por 24 a 48 horas, y las lecturas se realizaron directamente en el sistema ATB/plus.
Los resultados obtenidos mediante el empleo de los sistemas API 20NE e ID 32GN son reportados de acuerdo a los criterios establecidos por los fabricantes, empleando los siguientes términos: aceptable: porcentaje de identificación mayor o igual a 90%; dudoso: perfil con dos posibilidades a nivel de género o especie (se requieren pruebas bioquímicas confirmatorias); inaceptable: el perfil presenta más de tres posibilidades a nivel de género o especie.
Caracterización molecular
a. Aislamiento del ADN genómico
El aislamiento del ADN genómico se realizó de acuerdo al procedimiento descrito por Mahenthiralingam et al [19]. El ADN fue resuspendido en 200 μl de TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8, EDTA l mM) a una concentración de 1 µg/ml. La presencia de ADN fue visualizada mediante electroforesis en geles de agarosa en buffer TBE 05X.
b. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
El protocolo empleado en esta reacción está basado en el método descrito por Whitby et al., [15] utilizando un termociclador Perkin Elmer GeneAmp (PCR System 2400). Se prepararon reacciones de 50 μl con 800 pmoles de cada iniciador, 100 ng de ADN genómico, 200 μM de cada dNTP, MgCl2 2 mM y 1.25 U de Taq ADN polimerasa. La desnaturalización inicial se llevó cabo a 95°C por 5 min, con 30 ciclos repetidos de desnaturalización 95°C por 45 s, hibridación a 66°C por 45 s, extensión a 72°C por 2 min, con un tiempo final de extensión de 10 min. Los productos amplificados fueron visualizados en electroforesis en geles de agarosa. Como controles se empleó: B. cepacia (CVCM 626), y E. coli K12 (CVCM 73).
Iniciadores empleados:
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El par PSL-PSR se empleó como control interno para amplificar un producto de aproximadamente 300 pb de una región rRNA conservada en todas las bacterias (PCR Universal). Los iniciadores G1-G2 amplifican un producto de 1300 pb de los genomovares I (B. cepacia), III (B. cenocepacia) y IV (B. stabilis). Los iniciadores SPR3-G1 amplifican un producto de 1200 pb de los genomovares I y II, y el par SPR4-G1 (1200pb) amplifica para los genomovares I y IV.
Se estableció una correlación entre la identificación fenotípica y los genomovares o especies determinados por PCR, según el esquema algorítmico previamente descrito [15].
Análisis de datos
La sensibilidad y especificidad de los métodos convencionales, sistemas comerciales y método de reacción en cadena de la polimerasa fueron calculadas por el método estándar propuesto por Morton et al., [20]. Se evaluó el poder discriminatorio de los métodos fenotípicos y la prueba molecular PCR para la identificación del CBc, y el poder discriminatorio se cuantificó con el Índice de Diversidad de Simpson [19].
Resultados
Todas las cepas de BGNNF empleadas en este trabajo, crecidas en agar LB, desarrollaron colonias translúcidas, brillantes, de consistencia blanda, con bordes definidos y lisos, algunas con producción de pigmento amarillo no difusible al medio de cultivo. En agar MacConkey se observó la expresión del carácter lactosa negativo.
Mediante la aplicación conjunta de las pruebas bioquímicas preliminares, complementarias y semiautomatizadas (Tabla 1, columna a) fue posible la identificación de 28 (37,8%) de las cepas (21 hospitalarias y 7 ambientales) como B. cepacia. El grupo remanente, formado por 46 (62,2%) cepas (28 hospitalarias y 18 ambientales) fueron identificadas como: Stenotrophomonas maltophilia (15), Achromobater xylosoxidans (9), Pseudomonas alcaligenes, (2) P. stutzeri (3), P. mendocina (1) P. luteola (1), P. fluorescens (1), Pseudomonas spp. (11) y Raltsonia picketti. (1) Bajo estas condiciones no fue posible identificar 2 de los 74 BGNNF incluidos en este trabajo.
El empleo del sistema semiautomatizado ATBPlus, utilizando sólo la galería API 20 NE, permitió la identificación de 19 (67.8%) de las cepas de B. cepacia, 9 (60%) de las S. maltophilia, 3 (33.3%) de las A. xylosoxidans,, 1 (33.3%) P. stutzeri, 1 P. luteola, 1 P. fluorescens, 1 (9%) Pseudomonas spp. y 1 R. picketti, todas con perfiles considerados como aceptables para este sistema API (% id >90.0 y T>025). Mientras que con el empleo de la galería ID 32 GN fue posible la identificación de 16 (57,1%) de las cepas de B. cepacia, 14 (93.3%) de las S. maltophilia, 8 (88.9%) de las A. xylosoxidans, 2 (100%) de las P. alcaligenes, 3 (100%) de las P. stutzeri y 5 (45.4%) de las Pseudomonas spp. Al comparar la eficiencia de los dos sistemas, se observó que ID 32GN permitió la identificación de 51 (68,9%) del total de las cepas con perfiles considerados como aceptables, mientras que con API 20 NE sólo 36 (48.6%) lo fueron con definición aceptable. En algunos casos las cepas mostraron perfiles considerados como dudosos (con dos posibilidades a nivel de género o especie) o inaceptables (con tres posibilidades a nivel de género o especie). Para lograr un mayor grado de certeza en la ubicación taxonómica de las cepas identificadas como B. cepacia, o que mostraron perfiles considerados como dudosos o inaceptables, o que mostraron en algún grado divergencia entre los resultados obtenidos con las dos galerías (sistema API 20 NE y ID 32 GN) se aplicaron, a cada una de las cepas, las pruebas bioquímicas descritas como complementarias en la sección de materiales y métodos (oxidación-fermentación /maltosa/ manitol/ xilosa/ fructosa/lactosa; arginina dehidrolasa, lisinadescarboxilasa, hidrólisis de la esculina, gelatina). El uso selectivo de este conjunto de pruebas permitió una definición más precisa del taxón (Tabla 2). Las pruebas de sensibilidad/ resistencia a la polimixina B (empleando el método de difusión en disco PB 300U y crecimiento en placa 600U fue decisiva para diferenciar el género Burkholderia del resto de los BGNNF ya que todas las especies del género son reportadas como resistentes a este antibiótico.
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La Tabla 2 incluye los resultados de la identificación empleando las galerías comerciales (API 20 NE y ID 32 GN) y las pruebas complementarias específicas descritas para el género Burkholderia (resistencia a polimixina B, oxidación y asimilación del manitol), así como la tipificación por PCR.
Se observaron variaciones en las pruebas de oxidación del manitol, tanto en los aislados ambientales como en los hospitalarios, en relación a la respuesta de la cepa control (CVCM 626). En la mayoría de los casos se confirmó la prueba de asimilación del manitol y dió positiva. En las pruebas de susceptibilidad al disco de PB (300 U) y al crecimiento en presencia de polimixina B (600 U), tres de los aislados (CVCM 1220, CVCM 1276 y CVCM 1170) resultaron sensibles, con un halo de inhibición mayor de 12 mm, y no crecieron en medio sólido en presencia del antibiótico. El resto de las cepas identificadas como B. cepacia mostraron clara resistencia a la polimixina B.
La caracterización a nivel de las especies o genomovares descritos para el CBc se realizó mediante análisis de PCR especie-específica empleando los iniciadores descritos en la sección de materiales y métodos. En las figuras 1 y 2 se muestran los resultados de los productos de amplificación obtenidos para una selección de cepas (hospitalarias y ambientales) identificadas por métodos bioquímicos como B. cepacia. El ADN de las 74 cepas incluidas en este estudio amplificó, como era de esperarse, con los iniciadores universales PSL-PSR para el genoma de bacterias (resultados no mostrados). En las 46 cepas identificadas bioquímicamente como géneros distintos a B. cepacia no se obtuvieron amplificados con los iniciadores G1-G2. Resultados similares fueron obtenidos con la cepa de E. coli K12 (CVCM 73) empleada como control negativo (Figura 2). En el análisis de las cepas CVCM 626 (B. cepacia, control positivo), CVCM 810, CVCM 1273 y CVCM 79, incluidas en la Figura 1 se determinó la presencia de los productos de 1300 pb esperados cuando se emplearon los pares de iniciadores G1-G2, y de 1.200 esperados para SPR3-G1 y SPR4-G1. Todas identificadas como pertenecientes al genomovar I. En la figura 2 se muestran resultados de la identificación de las cepas CVM1231, CVCM1367. CVCM1328 y CVCM1274, como pertenecientes respectivamente a los genomovares III (B. cenocepacia), III, I (B. cepacia) y IV (B. stabilis).
La Tabla 2 resume los resultados de la identificación por PCR de 27 de las 74 cepas de B. cepacia estudiadas. 12 (positivas para G1-G2, SPR3-G1 y SPR4-G1) como genomovar I: B. cepacia; 5 (positivas para SPR3-G) genomovar II: B. multivorans; 3 (positivas para G1-G2 y SPR3- G1) genomovar III: B. cenocepacia) y 1 cepa (positiva con G1-G2 ) como genomovar IV: B. stabilis. Finalmente, 7 cepas identificadas bioquimicamente como B. cepacia no amplificaron con G1-G2, SPR3 y SPR4-G1, fueron consideradas como pertenecientes al genomovar V: B. vietnamiensis.
Discusión
Estudios previos reportados en la literatura, así como los resultados de nuestra experiencia de laboratorio, ponen en evidencia las dificultades que se presentan en la rutina de laboratorio de hospitales y clínicas para la identificación de B. cepacia y su diferenciación de otros géneros del grupo de los BGNNF [11,12]. Si se toma en consideración la estrecha relación filogenética de B. cepacia con otros géneros de BGNNF, la diversidad taxonómica del complejo CBc, y el reconocimiento de nuevas especies dentro del grupo, se puede concluir que para su identificación es indispensable el uso de pruebas morfológicas y bioquímicas que incluyen: coloración de Gram, motilidad, oxidasa, crecimiento a 42°C, oxidación de glucosa, y una amplia gama de pruebas complementarias particulares de cada género o especie [17,18].
En el presente estudio se encontraron dificultades en la identificación del género Burkholderia debido a las variables fenotípicas presentes entre los aislados, así como a las discrepancias en los resultados del empleo de API 20 NE e ID 32 GN. Se pudo demostrar la presencia de diferentes especies o genomovares entre los aislados estudiados [13,15].
]]> El sistema API 20 NE resultó más eficaz en la identificación de B. cepacia, mientras que el sistema ID 32 GN fue más apropiado en la identificación de los otros géneros presentes en la muestra bajo estudio. Estos resultados coinciden con los reportados por van Pelt et al. [21], según los cuales API 20NE resultó ser el mejor sistema comercial en la identificación de B. cepacia en comparación con Vitek GNI, Vitek NFC y MicroScan. De las cepas caracterizadas como Pseudomonas spp: 11 (14,9%) presentaron variaciones bioquímicas y discrepancias entre los perfiles obtenidos por las galerías API 20 NE e ID 32 GN, impidiendo la identificación a nivel de especie. S. maltophilia mostró un perfil bioquímico más homogéneo. De 15 aislados que presentaron un posible taxón para S. maltophilia, 14 (93,3%) coincidieron con las pruebas confirmatorias: sensibilidad a polimixina B, asimilación de la maltosa y/o oxidación (+) y OF manitol (-). Con respecto a las pruebas de crecimiento y sensibilidad a polimixina B los resultados sugieren que son útiles en el diagnóstico preliminar de los géneros bajo estudio. Sin embargo, estas pruebas no son suficientes para ser utilizadas aisladamente en la caracterización inicial, y es conveniente tomar en consideración algunos criterios sobre la interpretación de los halos de inhibición. Por ejemplo, Gales et al. [22], han sugerido la modificación del rango de susceptibilidad entre ≤10 y ≥14 mm para polimixina B.La aplicación de PCR especie-específica, utilizando iniciadores para la amplificación de secuencias de genes ribosomales, permitió discriminar a nivel de especies (genomovares) dentro del CBc. Con esta técnica se logró la identificación de cepas de B. cepacia pertenecientes a los genomovares I, II, III y IV. La identificación de los aislados del genomovar V se estableció comparando los resultados negativos de amplificación con los iniciadores G1- G2 y SPR3-G1, pero bioquímicamente identificados como B. cepacia. Bajo las condiciones empleadas fue posible visualizar el producto amplificado de los iniciadores SPR4-G1, mientras que Whitby et al [15] y Silva y col [23] no lograron obtener resultados positivos. La utilización de PCR conjuntamente con técnicas como PCR recA y RFLP han permitido ampliar el espectro de especies o genomovares dentro del CBc [15,24].
Los resultados presentados corroboran la importancia de combinar métodos basados en características morfológicas y bioquímicas, con sistemas comerciales y métodos moleculares a los fines de mejorar el diagnóstico bacteriológico. Es recomendable el empleo de otros métodos como la ribotipificación [24,25], ya que algunas cepas no pudieron ser asignadas a los genomovares descritos para el CBc.
Finalmente, consideramos que el limitado número de aislados estudiados no permite establecer una clara relación entre las variantes bioquímicas y los genomovares identificados, razón por la cual se considera necesario ampliar el tamaño de la muestra con cepas aisladas en distintos ambientes naturales y hospitalarios.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado parcialmente por el Fonacit (proyecto Lab97000667), el CDCH-UCV, proyectos CDCH-UISI 03 99 6167 2005, CDCH-PI 03 00 6622 2007, Fundacite Sucre (Proyecto RETO) otorgados al Centro Venezolano de Colecciones de Microorganismos.
Se agradece el apoyo del Laboratorio de Biología de Plásmidos del Instituto de Biología Experimental de la Universidad Central de Venezuela y al Laboratorio de Bacteriología del Servicio Autónomo Hospital Universitario “Antonio Patricio de Alcalá,” Cumaná, estado Sucre – Venezuela.
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