Elsa Z. Salazar de Vegasa,*, Beatriz Nievesb, Joaquín Ruízc, Jordi Vilad
aDepartamento de Bioanálisis. Universidad de Oriente. Núcleo de Sucre. Venezuela
bDepartamento de Microbiología y Parasitología. Facultad de Farmacia y Bioanálisis. Universidad de Los Andes. Mérida. Venezuela
cCentro de Salud Internacional, IDIBAPS, Hospital Clinic, Villarroel 170, 08036 Barcelona, España
dServei de Microbiologia, Hospital Clínic, IDIBAPS, Facultat de Medicina, Universitat de Barcelona, España
* Correspondencia: E-mail: elsazul2003@cantv.net
Resumen: Se utilizaron 62 cepas identificadas inicialmente como bacilos gramnegativos no fermentadores (BGNNF), aisladas de pacientes con diagnóstico de infección nosocomial, con el objeto de determinar su género y especie. Cuarenta y cinco cepas fueron identificadas como Acinetobacter baumannii, 10 como Pseudomonas aeruginosa, 3 como Stenotrophomonas maltophilia, 3 como Comamonas acidovorans y 1 como Achromobacter xylosoxidans subsp. xylosoxidans, mediante el API 20NE. Con respecto a las cepas de Acinetobacter, el ARDRA permitió identificar 20 cepas como A. baumannii y 23 como Acinetobacter genoespecie 13TU, pero 2 cepas no fueron identificadas por este método. La secuencia de la subunidad 16S del ADNr de todas las cepas incluidas en este estudio permitió identificar 20 cepas como A. baumannii, 23 cepas como Acinetobacter RUH1139, 10 como P. aeruginosa, 4 como A. xylosoxidans subsp. xylosoxidans (2 de estas cuatro cepas habían sido identificadas como A. baumannii mediante API20NE), 3 como S. maltophilia, 1 como C. acidovorans y 1 como β-Proteubacterium. Las discrepancias entre la identificación bioquímica por API 20NE y por ARDRA, para diferenciar las genoespecies de Acinetobacter, fue resuelta por la secuenciación de la subunidad 16S del ADNr, indicando que la identificación de los aislados de Acinetobacter, entre otros BGNNF, mediante API 20NE, debe ser confirmada por técnicas genéticas.
Palabras clave: Acinetobacter, API 20NE, ARDRA, secuencia 16S de ADNr
Use of the API 20NE System to identify species of the Acinetobacter genus and other non fermenting gram-negative bacilli
]]> Abstract: We used 62 strains initially identified as non fermenting gram-negative bacilli (NFGNB) isolated from patients with a nosocomial infection diagnosis with the purpose of identifying their genus and species. Forty five strains were identified as Acinetobacter baumannii, 10 as Pseudomonas aeruginosa, 3 as Stenotrophomonas maltophilia, 3 as Comamonas acidovorans and 1 as Achromobacter xylosoxidans subspecies xylosoxidans through the API 20NE. Regarding the Acinetobacter strains, the ARDRA allowed to identify 20 strains as A. baumannii and 23 as Acinetobacter genospecies 13TU, but 2 strains were not identified with this method. The ADNr 16S sequence of all the strains included in this study allowed to identify 20 strains as A. baumannii, 23 strains as Acinetobacter RUH1139, 10 as P. aeruginosa, 4 as A. xylosoxidans subsp. xylosoxidans (2 of these four strains strains had been identified as A. baumannii through API20NE), 3 as S. maltophilia, and 1 as C. acidovorans and 1 as β-Proteubacterium. The discrepancies between the biochemical identification by API 20NE and by ARDRA to differentiate the Acinetobacter genospecies was resolved by the ADNr16S sequencing, indicating that the identification of the Acinetobacter isolates, among other NFGNB, through API 20NE, should be confirmed through genetic techniques.Keywords: Acinetobacter, API 20NE, ARDRA, ADNr16S Sequence
Recibido 26 de noviembre de 2007; aceptado 17 de julio de 2008
Introducción
Los bacilos gramnegativos no fermentadores (BGNNF) son bacterias habitantes de diferentes ambientes que están siendo asociadas, cada vez más, a enfermedades en los humanos, sobre todo relacionadas con infecciones intrahospitalarias. Especialmente, A. baumannii se ha encontrado causando brotes en diferentes partes del mundo [1]. La identificación correcta de estos microorganismos es objeto de estudio en la actualidad, debido a las limitaciones en su identificación mediante pruebas bioquímicas [2,3]. En los últimos años se han desarrollado nuevos métodos de identificación y tipificación molecular para diversas bacterias, incluyendo a los BGNNF, que se perfilan como herramientas idóneas para estudios epidemiológicos de cepas genéticamente relacionadas [2,4]. Para la identificación de Acinetobacter spp. se utiliza con frecuencia el sistema comercial API 20NE, sin embargo, para la diferenciación entre las especies de este género, así como de otros BGNNF, se requiere de la incorporación de otros métodos de identificación [2,5-11]. La aplicación de métodos genéticos, entre los que se incluye el análisis de restricción de la subunidad 16S del ADNr amplificada (ARDRA), ha permitido, en los últimos años, grandes avances en la diferenciación de algunas especies bacterianas y, particularmente, de las especies incluidas en el complejo A. calcoaceticus - A .baumannii [2-4,9,10]. En el presente artículo se muestra la experiencia obtenida al identificar especies de Acinetobacter y otros BGNNF, aislados de infecciones nosocomiales, mediante métodos bioquímicos y genéticos.
Materiales y Métodos
Cepas bacterianas
Un total de 62 cepas identificadas inicialmente como BGNNF fueron aisladas de pacientes con diagnóstico de infección nosocomial, hospitalizados en la Unidad de Cuidados Intensivos de Adultos (UCI-A) (15 cepas) y la Unidad de Alto Riesgo Neonatal (UARN) (17 cepas) del Instituto Autónomo Hospital Universitario de Los Andes (IAHULA), Mérida, Venezuela, durante el periodo enero 1998 – abril 1999. Acinetobacter sp. ocupó el primer y cuarto lugar de aislamiento en la UCI-A y la UARN respectivamente, durante este período. Todas las cepas se mantuvieron conservadas a –70oC en caldo infusión cerebro- corazón con 50% de glicerol hasta su análisis.
Identificación bioquímica
Se probó la viabilidad de cada cepa conservada a –70ºC cultivándolas en caldo infusión cerebro-corazón, luego se subcultivaron en agar MacConkey y, posteriormente, en agar nutriente, incubando en cada ocasión durante toda la noche a 35ºC. La prueba de oxidasa se practicó a cada cepa y la misma consistió en frotar la tira impregnada con una solución acuosa al 0,5% de clorhidrato de tetrametil-pfenilendiamina contra la colonia en estudio; la aparición de un color púrpura dentro de los primeros 20 segundos se consideró positiva. La identificación a nivel de género se realizó mediante el método bioquímico convencional [12,13]; la confirmación del género y definición de las especies se realizó mediante el sistema comercial API 20NE (BioMerieux, St Louis, MO, USA), siguiendo las instrucciones de la casa fabricante. Para el control de calidad se utilizaron las cepas de E. coli ATCC® 25922 y P. aeruginosa ATCC® 27853.
]]> Identificación molecularPara la identificación molecular a nivel de especie de las cepas de Acinetobacter se utilizó la amplificación de la subunidad 16S del ADNr [14]. Dado que la metodología del ARDRA utilizada se diseñó teniendo en cuenta sólo la secuencia del amplicón generado a partir de las diferentes especies de Acinetobacter, no se aplicó dicho método a ningún microorganismo que no se hubiese identificado como perteneciente a este género mediante las pruebas bioquímicas previamente realizadas. El amplicón de 1500 pb fue digerido con las enzimas AluI (Roche, Mannheim, Germany), CfoI, MboI, MspI (Promega, Madison, USA) y RsaI (Promega, Madison, USA), siguiendo las instrucciones de la casa comercial. Los fragmentos digeridos se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 3%, teñido con bromuro de etidio (5μg/ml). Para comparar el tamaño de los fragmentos resultantes, se utilizó un marcador de de peso molecular con bandas de concentración definidas de 100pb (Invitrogen, CA, USA). Los patrones resultantes se detectaron por transiluminación con luz ultravioleta (UVP, Inc.), se documentaron fotográficamente (Polariod Instantánea DS 34) y se compararon con los esquemas de ARDRA para la identificación de especies de Acinetobacter publicados por Nemec y col. [3] y Dijkshoorn y col. [4].
La identificación de la especie de cada cepa de Acinetobacter, así como de cada cepa de los otros BGNNF, se verificó mediante la secuenciación del fragmento de la subunidad 16S del ADNr, el cual fue previamente amplificado según lo descrito por Vila y col. [15]. El amplicón obtenido fue sometido al protocolo de purificación Wizard ® SV Gel Up System (Promega, Madison, USA), de acuerdo a las instrucciones de la casa comercial. El análisis de la secuencia fue desarrollado con un secuenciador automático modelo Abi Prism 377 (Perkin Elmer, CA. USA), utilizando el protocolo del Kit Dye® Terminator V 3.1 Cycle sequencing (Applied Biosystems, Foster CA, USA), siguiendo las instrucciones de la casa comercial, con algunas modificaciones. Los oligonucleótidos (Roche, Mannheim, Germany) utilizados fueron:
8F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)
806R (5’-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3’)
515F (5’-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA-3’)
1510R (5’-GGTTACCTTTGTTACGACTT-3’).
Las secuencias obtenidas fueron comparadas con las secuencias de la subunidad 16S del ADNr ubicadas en el Gene Bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi), para encontrar aquellas con homología más cercana a las obtenidas en este estudio.
Reproducibilidad de los Métodos
En todos los casos en que hubo alguna discordancia entre las diferentes técnicas de identificación utilizadas, se repitió la identificación por todos y cada uno de los métodos utilizados, para evitar cualquier error posible de manipulación. Análisis estadístico Se realizó un análisis de concordancia de los resultados obtenidos entre el sistema de identificación API 20NE y el método de secuenciación de la subunidad 16S del ADNr. Resultados De los 62 aislamientos de BGNNF investigados, 45 fueron identificados como Acinetobacter baumannii, 10 como Pseudomonas aeruginosa, 3 como Stenotrophomonas maltophilia, 3 como Comamonas acidovorans, y 1 como Achromobacter xylosoxidans subsp. xylosoxidans, mediante el API 20NE. Se encontraron 5 patrones bioquímicos diferentes de A. baumannii. El patrón 0041073 fue el más frecuentemente hallado en estas cepas (71,11 %) (Tabla 1).
]]>
De las 45 cepas identificadas como A. baumannii por el API 20 NE, se obtuvieron productos de amplificación de 1500 pb del gen que codifica para la subunidad 16S del ADNr (Figura 1), los cuales fueron sometidos al análisis de restricción (ARDRA). Sólo 20 cepas fueron identificadas como A. baumannii y, entre las cepas restantes, 23 fueron clasificadas como Acinetobacter genoespecie 13TU (Figura 2) y 2 no pudieron ser identificadas por este método (Tabla 1).
La secuenciación completa del amplicón de 1500 pb de la subunidad 16S del ARNr permitió identificar 20 cepas como A. baumannii y 23 como Acinetobacter cepa RUH 1139, 10 cepas como P. aeruginosa, 4 como A. xylosoxidans subsp. xylosoxidans, 3 como S. maltophilia, 1 como C. acidovorans y 1 como β-Proteobacterium (Tabla 1).
Las cepas identificadas como A. baumannii por ARDRA coincidieron con esta genoespecie en el 99% de la secuencia de nucleótidos. En el caso de las cepas identificadas como genoespecie 13TU mediante ARDRA, coincidieron en un 99% con la secuencia de la cepa designada como Acinetobacter cepa RUH 1139, ubicada en el banco de genes bajo el número de acceso 13275214 (http://www.ncbi.-nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi), pero en un 97% con la secuencia de la genoespecie 13TU (Figura 3).
La diferencia entre la secuencia de nucleótidos de la subunidad 16S del ADNr de las 23 cepas aquí estudiadas, con respecto a Acinetobacter cepa RUH 1139, fue de sólo 5 bases, mientras que las secuencias de dichas cepas y las de la genoespecie 13TU, también ubicada en el banco de genes, se diferenciaron en 28 bases.
En la Tabla 2 se muestra la concordancia de identificación entre ambos métodos. Para A. baumannii se obtuvo una concordancia del 55,6%.
En el caso específico de la identificación de especies del genero Acinetobacter, se observó una correlación del 100% entre las técnicas de ARDRA y la secuenciación en lo concerniente a las cepas de A. baumannii. Sin embargo, aquellas cepas que mediante técnica de ARDRA fueron identificadas como Acinetobacter 13TU, por secuenciación se demostró que pertenecían a Acinetobacter cepa RUH1139 (Tabla 2).
La reproducibilidad de los métodos en todos los casos fue del 100%.
Discusión
En los últimos años se han incrementado las infecciones nosocomiales causadas por BGNNF, afectando principalmente a pacientes debilitados, lo cual se ha relacionado al incremento de procedimientos diagnósticos invasivos y terapéuticos usados en las unidades de cuidados intensivos en los últimos 20 años [1,11,16-18]. Particularmente, algunas especies de Acinetobacter se han encontrado mayormente involucradas en brotes nosocomiales en unidades de cuidados intensivos [1,19-24]. Cuatro genoespecies se han agrupado en el complejo A. calcoaceticus - A. baumannii, debido a que fenotípicamente, dichas genoespecies, no pueden ser diferenciadas [25]. Estos datos hacen que sea relevante una correcta y rápida identificación de este tipo de patógenos, para prevenir colonizaciones hospitalarias causadas por estos germenes y tomar las medidas preventivas y terapéuticas adecuadas.
De las 62 cepas de BGNNF estudiadas, 45 fueron identificadas por API 20NE y pruebas fisiológicas como A. baumannii, siendo el patrón bioquímico 0041073 el más frecuentemente hallado entre las cepas. Estos resultados fueron discordantes con los hallados mediante el ARDRA, el cual permitió reconocer sólo a 20 cepas como A. baumannii, 23 como Acinetobacter genoespecie 13TU (18 de estas pertenecieron a un mismo clón) [26] y 2 cepas no pudieron ser identificadas por este método. Las discrepancias entre estos resultados fueron resueltas mediante la secuenciación de la subunidad 16S del ADNr. Así, las 20 cepas identificadas mediante ARDRA como A. baumannii se confirmaron mediante esta técnica, mientras que las 23 identificadas mediante ARDRA como Acinetobacter genoespecie 13TU, resultaron ser Acinetobacter RUH1139. Por último, las 2 cepas con un patrón no identificable por ARDRA, fueron identificadas como A. xylosoxydans subsp. xylosoxidans. Cabe resaltar que, 10 de las cepas identificadas como A. baumannii (31,2%) y 22 como Acinetobacter cepa RUH1139 (68,7%) tuvieron el mismo patrón bioquímico según el API 20NE (0041073), el cual indicaba una identificación excelente para A. baumannii. Las cepas identificadas como A. baumannii tanto por API20NE como por ARDRA, coincidieron en el 99% de la secuencia de la cepa correspondiente a esta genoespecie, ubicada en el banco de genes. Las secuencias de las cepas identificadas como A. baumannii mediante el API 20NE y como Acinetobacter genoespecie 13TU por ARDRA, coincidieron en un 99% con la secuencia de la cepa designada como Acinetobacter cepa RUH1139 y en un 97% con la cepa correspondiente a la genoespecie 13TU, ubicadas en el banco de genes, respectivamente. La diferencia entre la secuencia de nucleótidos de la cepa de Acinetobacter RUH1139, depositada en el banco de genes, con respecto a las aquí estudiadas, fue menor al ser comparada con la secuencia de la cepa de Acinetobacter genoespecie 13TU, también ubicada en el banco de genes. Dijkshoorn y col. (2003), describen una cepa de Acinetobacter RUH 1139 aislada de faringe, ubicada dentro de los perfiles ARDRA para cepas de Acinetobacter como no clasificable como especie por hibridación ADN-ADN. El patrón de ARDRA de esta cepa no coincide con los descritos en la presente investigación, los cuales resultaron similares a los descritos por dichos investigadores para la genoespecie 13TU. Recientemente, se han publicado modificaciones en la base de datos que recopila los resultados de ARDRA para identificar cepas de Acinetobacter, entre ellos, la cepa de Acinetobacter RUH 1139 que se relaciona con la genoespecie 13TU y el Acinetobacter fenotipo 6 [4].
Seleccionando un aislado de cada clón, tanto para las cepas correspondientes a Acinetobacter baumannii como para Acinetobacter cepa RUH 1139 [26], se encontró una concordancia de identificación, entre ambos métodos, del 55,6%, es decir, el API 20NE no pudo identificar estas cepas en un 44,4%. Este hallazgo pone en evidencia la estrecha relación genética existente entre algunas genoespecies de Acinetobacter, incluyendo las del complejo A. calcoaceticus - A. baumannii [6,25], la cuales, hasta ahora, no pueden ser diferenciadas mediante pruebas bioquímicas, incluyendo el sistema API 20NE; además, el hecho que actualmente se aíslen otras cepas de Acinetobacter, a partir de muestras clínicas, no incluidas aún dentro de las genoespecies, hasta ahora descritas pero similares bioquímicamente a A. baumannii [4], hace que varios investigadores hayan incluido métodos genéticos, sumados a dicho sistema, para la identificación precisa de la especie de este microorganismo [3,6,27,28].
Por otro lado, la secuencia de la subunidad 16S del ADNr de las otras cepas de BGNNF incluidas en este estudio, permitió corroborar la identificación de las 10 cepas de P. aeruginosa, 3 como S. maltophilia, 1 como C. acidovorans y 1 como β-Proteubacterium. La secuencia de estas bacterias coincidió entre el 97 y 99% con las secuencias de cada especie identificada ubicadas en el banco de genes. Además, mediante la secuenciación 4 cepas se identificaron como A. xylosoxidans subsp. xylosoxidans, con un 97% de similitud entre las secuencias, 1 de las cuales fue identificada previamente, mediante el API 20NE, como C. acidovorans, y otras 2, como ya se ha citado previamente, como A. baumannii, mostrando una de ellas bajo perfil bioquímico de identificación.
En la bibliografía consultada, se encontraron diversos trabajos que también utilizaron métodos genéticos sumados al sistema API 20NE para la identificación de estos microorganismos [2,3,23,26-28]. Otras publicaciones evalúan la eficacia de dicho método, y todos afirman que el poder de discriminación del sistema API 20NE es insuficiente para la identificación exacta de este tipo de microorganismos [2,6,8,29]. Estas limitaciones pudieran ser atribuibles a la poca utilización de bacterias ambientales en el desarrollo de los esquemas comerciales de identificación. En resumen, el 43,5% de las cepas incluidas en este estudio fueron identificadas erróneamente mediante el sistema API 20NE. El 44,4% de las cepas identificadas como A. baumannii por este método, no se correspondieron con dicha genoespecie y 22,2% de las cepas fueron identificadas como microorganismos diferentes. El hecho que la reproducibilidad de los métodos fuese del 100% en todos los casos muestra que las discrepancias entre los métodos son inherentes a los mismos y no atribuibles a errores de manipulación.
La metodología de secuenciación del gen que codifica para la subunidad 16S del ARNr es sin duda la mejor y más confiable de las metodologías, no obstante requiere de infraestructuras muy costosas que la hacen inasumible como técnica de rutina, quedando relegada a casos de interés especial o a estudios de índole epidemiológica.
]]> El sistema de identificación API 20NE demostró ser relativamente inexacto, debiendo sus resultados ser tomados con precaución. No obstante, en el presente estudio si bien se han identificado como Acinetobacter baumannii microorganismos que no lo eran, no se ha dejado de identificar ninguno que lo fuese. Así, una posibilidad, a tener en especial consideración en casos de brotes intrahospitalarios, sería realizar una identificación adicional mediante la técnica de ARDRA, que aunque necesita equipos (Termociclador) y reactivos (Taq polimerasa, cebadores, enzimas de restricción) costosos, posiblemente se pueda implementar, aunque el laboratorio no sea un centro de referencia. En caso de identificaciones discrepantes entre ambas metodologías, podría recurrirse a la secuenciación de los amplicones correspondientes a un grupo significativo de aislados.En conclusión, estos hallazgos sugieren que, idealmente, los resultados obtenidos por el API 20NE, para la identificación de especies dentro del género Acinetobacter, deberían de confirmase mediante la técnica de ARDRA como requerimiento mínimo. Así mismo, la diferenciación de otras bacterias incluidas en el grupo de BGNNF puede ser errónea mediante técnicas bioquímicas, por lo tanto, es importante seguir avanzando en el diseño de metodologías como la del ARDRA para la identificación correcta de los géneros y especies más representativos.
Fuente de financiamiento
Este trabajo fue financiado por los Proyectos S1 2001001159 y F: 2000001633 de FONACIT. Joaquim Ruiz goza de un contrato para incorporación de investigadores al SNS del Fondo de Investigaciones Sanitarias - España (Proyecto CP05/0130).
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