Deyanira Rivero González^a,*, Ariel Cruz Triana^a, Aida Tania Rodríguez Pedroso^a, Anayza Echevarría Hernández^a, Benedicto Martínez Coca^b

^aInstituto Nacional de Ciencias Agrícolas. Unidad Científico Tecnológica de Base “Los Palacios”, Los Palacios, Pinar del Río, Cuba.

^bCentro Nacional de Sanidad Agropecuaria, Mayabeque, Cuba.

* Correspondencia: E-mail: deyanira@inca.edu.cu

Resumen: Se aislaron e identificaron los hongos presentes en granos de arroz manchados, de la variedad INCA LP-5, cosechados durante las épocas lluviosas de los años 2003 y 2005, en áreas de la Estación Experimental del Arroz “Los Palacios”, Pinar del Río, perteneciente al Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA). Se determinó la incidencia y se realizaron las pruebas de patogenicidad mediante los postulados de Koch. Se identificaron 35 especies, correspondientes a 19 géneros de hongos asociados a granos manchados de la variedad INCA LP-5, y entre ellas se señalaron, como nuevos registros asociados al manchado del grano de arroz para Cuba a: Bipolaris maydis, Fusarium merismoides, F. solani, F. subglutinans, Penicillium itallicum, Phoma medicaginis var. pinodella y Syncephalastrum racemosum. Los hongos de mayor incidencia fueron Bipolaris oryzae, Sarocladium oryzae y especies de los géneros Alternaria, Fusarium, Curvularia y Phoma. Se confirmó que los hongos F. subglutinans, B. oryzae, A. padwickii, Alternaria sp., F. verticillioides, C. lunata, C. lunata var. aeria, C. pallescens, C. senegalensis, Curvularia sp., Phoma sp. y S. oryzae, son agentes causales del manchado del grano de arroz.

Palabras clave: arroz, manchado del grano, hongos fitopatógenos, frecuencia, patogenicidad.

Fungi associated to grain spotting in the INCA LP-5 (Oryza sativa L.) variety of rice in Cuba

Abstract: Isolation and identification of the fungi present in spotted rice grains of the INC LP-5 variety, harvested during the rainy seasons of the years 2003 and 2005, was done at sites of the Experimental Rice Station “Los Palacios”, Pinar del Río, belonging to the Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA). Incidence was determined, and pathogenicity tests were carried out according to Koch’s postulates. Thirty-five species corresponding to 19 fungi genus associated to spotted grains of the INCA-LP-5 variety were identified, and among them, the following strains were indicated as new registrations associated to spotting of rice grains in Cuba: Bipolaris maydis, Fusarium merismoides, F. solani, F. subglutinans, Penicillium itallicum, Phoma medicaginis var. pinodella and Syncephalastrum racemosum. The fungi with the highest incidence were Bipolaris oryzae, Sarocladium oryzae and species of the genus Alternaria, Fusarium, Curvularia and Phoma. It was confirmed that the fungi F. subglutinans, B. oryzae, A. padwickii, Alternaria sp., F verticilloides, C. lunata, C.lunata var. aeria, C. pallescens, C. senegalensis, Curvularia sp., and S. oryzae, are causative agents of the spotting of rice grains.

Keywords: rice, spotting of grains, phytopathogenic fungi, frequency, pathogenicity.

Introducción

Dada la situación de emergencia alimentaria mundial, es necesario conocer las causas fundamentales que afectan el rendimiento del cultivo del arroz en Cuba, el cual es inferior a la media mundial, aún cuando el potencial supera las 6 t/ha con las variedades y tecnologías existentes; de esta manera se contribuirá a incrementar su producción, así como satisfacer la creciente demanda de este cereal, que es el de mayor extensión de superficie cultivada en el mundo, el segundo en superficie cosechada, proporciona la mayor cantidad de calorías por hectárea y es el segundo alimento más utilizado, después del trigo [1].

Una de estas causas es la incidencia de numerosas enfermedades, favorecidas por las condiciones climáticas y las tecnologías de siembra del cultivo. En el caso particular de Cuba, con clima subtropical de elevada temperatura y humedad relativa, las enfermedades de origen fúngico han jugado un papel decisivo. Entre ellas se encuentra el manchado del grano, enfermedad ampliamente distribuida en las regiones de producción de arroz en el mundo y de gran importancia en muchos países de Asia, áfrica y América, causada por diversos géneros de hongos previamente reportados como Alternaria, Aspergillus, Mucor, Bipolaris, Chaetomium, Cladosporium y Curvularia entre otros [1-4].

Esta enfermedad afecta componentes del rendimiento al causar vaneamiento y disminución de: a) la germinación entre un 26 y 41%; b) vigor y tamaño de las plántulas; c) número de granos por panícula; d) peso de los granos hasta un 40%; e) llenado de los granos en un 30% [5]. Por otra parte, desmerece la calidad de la semilla, pues reduce el número de granos enteros e incrementa tanto los granos quebradizos en el proceso de molino como los granos yesosos y de coloración anormal [6].

Las estrategias fitosanitarias establecidas incluyen aplicaciones foliares preventivas en distintas fases del ciclo del cultivo, tratamiento químico a la semilla, uso de semilla certificada, y, aunque no se hace referencia al uso de variedades resistentes, existen algunos cultivares como el INCA LP-5, que presenta baja susceptibilidad al manchado del grano. Esta variedad es una de las de mayor porcentaje de área sembrada en Cuba y presenta excelentes cualidades agronómicas, entre las que se destacan su rendimiento potencial, elevada producción de hijos fértiles, alto número de granos llenos por panícula y peso de mil granos [7,8]. Sin embargo, es necesario establecer su susceptibilidad a las enfermedades causadas por hongos inherentes a este cultivo, para proponer estrategias de control específicas a esta variedad.

El objetivo del trabajo consistió en identificar los hongos asociados al manchado del grano en la variedad de arroz INCA LP-5 durante dos ciclos de cultivo, conocer su incidencia y evaluar la patogenicidad de los hongos aislados.

Materiales y métodos

Aislamiento e identificación de los hongos: Se utilizaron granos recién cosechados de la variedad INCA LP-5, procedentes de la Estación Experimental de Arroz “Los Palacios”, Pinar del Río, perteneciente al Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), durante el ciclo de primavera de los años 2003 y 2005, en un suelo Hidromórfico Gley Nodular Ferruginoso Petroférrico [9]. Se tomaron 400 granos por cada muestra (4 réplicas de 100 granos cada una) con síntomas típicos de manchado del grano, los que se sometieron a secado natural durante 12 h hasta reducir el contenido de humedad al 12%.

Las muestras se trasladaron al Laboratorio de Micología Vegetal del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) en sobres de papel kraft previamente esterilizados. Los granos se lavaron con agua corriente durante 30 min y se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 2,5% durante 10 min y etanol al 70% por 1 min. Posteriormente, se lavaron tres veces con agua destilada estéril (ADE) y se secaron sobre papel de filtro estéril (PFE) en condiciones asépticas.

Las estructuras vegetativas y/o reproductivas de los hongos se observaron mediante un estereomicroscopio Zeiss SV-6 (con aumento de hasta 100X). Para su aislamiento, los propágulos se sembraron en cajas Petri con medio de agar agua, agar papa dextrosa, agar papa sacarosa y agar extracto de malta según el género y se incubaron a 26±2 ºC en oscuridad durante 10 días. Se realizaron cultivos monospóricos a partir de las esporas producidas por los hongos sobre el material vegetal.

La identificación de los agentes fúngicos presentes se realizó mediante la observación y descripción en cuanto a tamaño, forma, coloración, distribución y agrupación de las estructuras vegetativas y/o reproductivas con el empleo de microscopios óptico y estereoscópico (Carl Zeiss Standard 25). Las características culturales y demás criterios taxonómicos, se compararon con los previamente informados por los siguientes autores: Onions [13,14], Rifai [15], Booth [16,17], Ellis [18-20], CMI [21], Sutton [22], Mercado [23], Ou [24], Agarwal et al. [25], Webster y Gunnell [26], Mew y Misra [27], Barnett y Hunter [28], López [29], Summerell et al. [30] y Estrada y Sandoval [31].

En muchos casos se realizaron microcultivos de algunas especies en los medios recomendados para las mismas.

Determinación de la patogenicidad de los hongos asociados con el manchado del grano de arroz: A partir de cultivos puros de 7 días en agar papa dextrosa de los aislamientos obtenidos previamente, se obtuvieron suspensiones de esporas y/o micelio, mediante la adición de 10 mL de ADE por placa. Se emplearon 3 placas por aislamiento. Las suspensiones se ajustaron a una concentración de 10⁵ UFC mL^-1.

Posteriormente se procedió a la inoculación de panículas sanas de arroz en la fase de floración y de granos sanos de la variedad INCA LP-5. Para la inoculación de las panículas se sembraron previamente semillas sanas y desinfectadas por el mismo método de desinfección empleado para el aislamiento; se eliminaron las plántulas que mostraran alguna afectación o síntomas de enfermedad durante el ciclo vegetativo del cultivo. En la fase de floración, se inocularon las panículas mediante aspersión de 10 mL de las suspensiones fúngicas y se garantizaron condiciones de humedad. Se utilizó un tratamiento testigo inoculado con 10 mL de ADE.

En la etapa de maduración se evaluó la afectación por manchado (observación de síntomas) y se reaislaron e identificaron los hongos responsables de dichos síntomas. Los granos (15 por réplica) se colocaron durante 10 min en 10 mL de las suspensiones correspondientes a los organismos aislados, y se dejaron secar por 1 h en láminas de PFE. El testigo se trató con ADE. Seguidamente, se colocaron en cámara húmeda, con alternancia de 12 h luz fluorescente/12 h oscuridad a una temperatura de 22-24 ºC durante 15 días. Se evaluó la acción patógena de los aislamientos mediante la aparición de manchas. Los hongos aislados que cumplieron los postulados de Koch se catalogaron como agentes causales del manchado del grano en arroz.

Estudio estadístico: Se evaluó la incidencia de las especies de hongos aislados, mediante la relación del número de granos infectados por cada especie, respecto al total de granos evaluados. Se determinó además el porcentaje de granos infectados por hongos de las muestras de granos manchados.

Para el estudio de la variabilidad de la frecuencia de los hongos aislados en los dos ciclos de cultivo, se utilizó un ANOVA simple (Statgraphic versión 5.1), para lo cual los datos se transformaron mediante la expresión 2Arcsen√%. Se realizó una comparación de medias mediante la prueba de rangos múltiples de Duncan (p<0,05). Para el análisis de los valores de porcentaje de granos infectados por hongos en los dos años, se empleó una comparación de medias con muestras independientes mediante el estadígrafo t de Student del programa Mexicano, versión 2.5 [32].

Resultados y discusión

Tabla 1. Hongos presentes en granos manchados de arroz de la variedad INCA LP-5 durante las campañas de primavera de los años 2003 y 2005 en Cuba.

x: presencia de la especie fúngica. -: ausencia de la especie fúngica.

De forma general, a pesar de que en la primavera del 2005 se determinaron mayor cantidad de especies fúngicas, en la del año 2003 el porcentaje de incidencia fue superior (Tabla 2). Es posible que la causa de esto se relacione con las condiciones climáticas, las cuales no pudieron verificarse.

Tabla 2. Incidencia de especies fúngicas presentes en granos manchados durante las campañas de primavera de 2003 y 2005 en Cuba.

**t = 4,9. Los valores seguidos de las mismas letras no difieren significativamente entre sí (p<0,05); las letras diferentes indican valores estadísticamente significativos.

Muchos de las variedades son susceptibles al manchado del grano, como la variedad Reforma. Sin embargo, la variedad INCA LP-5 muestra resistencia a las enfermedades más importantes del cereal, según notifican Pérez y Castro [34] y Pérez y col. [7]. Sin embargo, Morejón et al. [8], notificaron que obtuvieron baja susceptibilidad al manchado del grano y que esta tendencia se mantuvo inclusive durante la época de primavera, cuando las condiciones climáticas favorecen el desarrollo de enfermedades [35].

En los aislamientos obtenidos, los hongos Alternaria padwickii, Alternaria sp., Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus sp., Bipolaris oryzae, Chaetomium sp., Cladosporium cladosporioides, C. oxysporum, Curvularia lunata, C. lunata var. aeria, C. pallescens, C. senegalensis, Curvularia sp., Exserohilum rostratum, Fusarium sp., F. verticillioides, Melanospora sp., Mucor sp., Nigrospora sp., Penicillium sp., Phoma jolyana, Phoma sp., Rhizoctonia sp., Rhizopus stolonifer, Sarocladium oryzae, Sclerotium hydrophilum y Trichoderma sp., se encontraron asociados a los granos de arroz manchados, coincidiendo con lo informado por Castaño-Zapata [3], Gutiérrez et al.[4], Barrios y Pérez [36], Bonilla et al [37], Cardona y González [38], Neninger et al [39], Pineda et al [40].

En este estudio, se señalaron como nuevas especies asociadas a los granos de arroz en Cuba a las siguientes: B. maydis, F. merismoides, F. solani, F. subglutinans, P. itallicum, P. medicaginis var. pinodella y Syncephalastrum racemosum, que a su vez también tienen como hospederos el maíz, sorgo, pastos, pimiento y arvenses, según lo informado por Malaguti [41].

Los hongos F. merismoides y F. solani también se pueden encontrar en los suelos asociados con diferentes tipos de cultivos, como los ornamentales y hortícolas. El primero también ha sido encontrado frecuentemente en la rizosfera de plantas de trigo [42], mientras que F. solani, se haya tanto en cultivos de regiones tropicales como áridas y mediterráneas [43]. F. subglutinans es un hongo fitopatógeno presente en Cuba, que afecta varios tipos de cultivos a escala mundial, entre ellos caña de azúcar, piña, mango, banano, frijol, pino, grosella, vid, sorgo, trigo y maíz [44].

P. medicaginis var. pinodella tiene un amplio rango de hospederos, incluidas fabáceas y otras familias, pero fundamentalmente se conoce como un patógeno débil del guisante y el trébol; se ha aislado frecuentemente del suelo y puede encontrarse además en el heno y la paja [44]. S. racemosum se puede encontrar en alimentos y forrajes.

Al analizar la incidencia (Tabla 2), los mayores porcentajes se encontraron para los hongos Bipolaris oryzae (19% y 11% en 2003 y 2005, respectivamente), Sarocladium oryzae (6 y 3,7%), y especies de los géneros Alternaria (14 y 4,7%), Fusarium (13,5 y 6,7%), Phoma (5,5 y 7,7%) y Curvularia (10 y 4,2%). El patógeno B. oryzae tuvo la mayor incidencia en ambos ciclos, con diferencia significativa respecto a los restantes. Neninger et al. [39], obtuvieron esta misma tendencia, con predominio de las especies correspondientes a los géneros Bipolaris-Drechslera, Curvularia, Fusarium, Phoma y Sarocladium. Resultados similares han sido informados por Cárdenas et al. [32] para la variedad J-104, donde la incidencia de B. oryzae correspondió a un 90% en igual época de siembra (primavera). Los resultados obtenidos difieren en cuanto al número de hongos aislados, ya que estos autores determinaron otros 4 grupos genéricos, entre ellos Alternaria y Curvularia, en menos de un 5%. Bonilla et al.[37], encontraron alta incidencia de S. oryzae en muestras de granos manchados de las variedades Amistad 82, Bolito, J-104, IAC-14 y Perla, colectadas en La Habana y Pinar del Río (Cuba).

La diferencia en la frecuencia de estos hongos se encontró no sólo entre géneros, sino entre especies de un mismo género. Estrada y Sandoval [45], notificaron diferentes valores que varían desde 5 hasta 25% en especies de Curvularia aisladas a partir de distintas regiones, variedades y épocas de siembra. En este sentido, se han encontrado diferencias en la frecuencia de aparición de las especies del género Phoma que contribuyen al manchado del grano de arroz; para las variedades de arroz mencionadas en el párrafo anterior, la frecuencia de Phoma osciló entre 1,3 y 18,6% en el ciclo de primavera de 1999 en la provincia Pinar del Río, mientras que en La Habana alcanzó entre 5 y 24,5% para la variedad Perla durante la campaña de frío de 1998 [46]. Esto demuestra que las diferencias encontradas en la aparición de hongos en distintos años están influenciadas por el comportamiento del clima y la calidad de las medidas de control, sin obviar las variedades de arroz que, aunque no se conoce la resistencia de las mismas a este síndrome, juegan un papel importante en la manifestación de los síntomas.

El porcentaje de granos infectados (Tabla 2) también mostró diferencias significativas entre los años 2003 y 2005, siendo mayor en el primero, pero con mayor número de hongos aislados en el segundo. Esto pudiera atribuirse a una mayor competencia interespecífica entre los hongos presentes en el 2005, o a la ineficacia de las medidas preventivas para el manejo de la enfermedad en campo, unido a condiciones favorables para el desarrollo de la mayoría de los hongos, al menos por períodos de tiempo cortos.

Los síntomas ocasionados por estos agentes fitopatógenos variaron en cuanto al grado de manchado, desde manchas pequeñas (especies de Curvularia y Phoma), manchado total del grano (B. oryzae y en algunos casos S. oryzae), y coloración; aunque esta última fue generalmente pardo oscura, su intensidad dependió del patógeno en cuestión, con combinaciones grisáceas, rojizas (S. oryzae) o negruzcas (Curvularia sp. y Phoma sp.).

Bipolaris oryzae fue el hongo que causó los daños más intensos. Se caracterizó por mostrar manchas pardas oscuras a negras muy extendidas sobre la cubierta seminal y el endospermo; en la mayoría de los granos éstas cubrieron las glumas totalmente (Figura 1A). A simple vista, se observó crecimiento micelial profuso, abundantes conidióforos y conidios sobre las manchas Este patógeno ocasiona grandes pérdidas, ya que puede manifestarse de forma sistémica en la planta y causar daños como disminución de la germinación, pudrición de las semillas, marchitez de la panícula, tizones, marchitez y amarillamiento en semilleros, disminución del número de hijos y de la altura de las plántulas, manchas en hojas y lesiones sobre la raíz, reducción del número de granos por panícula y del peso de los mismos, senescencia temprana y reducción del rendimiento [39,44].

Las especies de Alternaria patógenas de arroz se asocian con el oscurecimiento y manchado del grano. A. padwickii produjo manchas de color pardo oscuro a negro en las glumas, localizadas fundamentalmente hacia los extremos del grano. Con el crecimiento de micelio abundante y la producción de conidióforos y conidios, estas manchas se tornaron posteriormente grisáceas o blanquecinas (Figura 1B), pero estuvieron en muchos casos delimitadas por un borde pardo oscuro. Al invadir el grano, el patógeno penetró al endospermo y produjo manchado negruzco en los bordes. Se plantea que el síntoma puede extenderse hasta la mitad de la longitud del grano, resecándolo y haciéndolo quebradizo. Gutiérrez et al. [4] señalaron que una infección severa por este hongo en las semillas, y la pudrición ocasionada por éste, pueden causar serios impactos en el cultivo, tanto en semillero como en campo, y que ha sido asociado con el tizón de plántulas y manchas foliares.

Las especies de Curvularia y más específicamente C. lunata, produjeron manchas desde muy oscuras a negras en los extremos o a lo largo de toda la superficie del grano, distribuidas de forma no homogénea, localizadas en numerosos puntos necróticos que convergieron indistintamente. Se observó deformación del grano, con ruptura de la cubierta seminal y desarrollo de abundante micelio, conidióforos y conidios, emergiendo del endospermo en dichas lesiones y de manchas en las glumas (Figuras 1C y 1D). Estos resultados concuerdan con los informados por el Compendio CABI [44], donde se asevera que la infección de los granos de arroz por C. lunata se caracteriza por un cambio de coloración de la aleurona y de la capa de almidón que torna la cáscara parda, y que en infecciones severas, el hongo produce manchas de color negro en los granos. Estrada y Sandoval [47], evaluaron la patogenicidad de especies de Curvularia sobre toda la planta de arroz, observando la aparición de manchas en hojas inoculadas, así como marchitez de la panícula, tizón de plántulas en semillero, manchado del grano y reducción de la germinación.

En el presente estudio se observó una decoloración de los granos de arroz por la acción de algunas especies de Fusarium, dando al grano una apariencia reseca y de color pajizo. Sin embargo, una parte de los granos inoculados con F. verticillioides mostró manchas que variaron de pardo claras a oscuras, con abundante esporulación y micelio blanquecino rosáceo, mientras que en la otra parte se observaron algunos granos decolorados parcial o totalmente (Figura 1E).

F. verticillioides, antiguamente F. moniliforme [48], aunque aparece notificado como patógeno del grano, también causa una enfermedad asociada al crecimiento excesivo de plantas afectadas (“Bakanae”), afectaciones en semillero y esterilidad de las panículas. Las plantas infectadas, que ocasionalmente sobreviven hasta la madurez, originan panículas vanas, generalmente tienen muy bajo número de hijos y sus hojas se van secando una tras otra y mueren. Este patógeno también se asocia a la pudrición de los granos de arroz [24,39]. En otros estudios se ha comprobado que varias de las especies del género Fusarium causan marchitez y amarillamiento en semilleros de arroz, pudrición negra de los nudos y marchitez de la panícula. F. subglutinans produjo decoloración parcial o total en la mayoría de los granos, y en algunos manchas pardas claras y abundante esporulación. Esta especie se informa por primera vez en Cuba como patógena del grano de arroz, aunque también afecta otros cultivos, como fue abordado anteriormente.

Phoma sp. causó manchas pardas claras de tamaño pequeño con presencia característica de abundantes picnidios que dieron apariencia de numerosos puntos negros al observarlos a simple vista, pero estos fueron pardo oscuros, de forma casi esférica. La presencia de micelio sobre el grano fue escasa y éste fue de color blanquecino o grisáceo. Estas observaciones son similares a las realizadas por Wong y Sandoval [46], quienes plantearon que las especies de Phoma están frecuentemente asociadas a los granos, en los cuales pueden causar manchas que crecen sobre los mismos con escaso micelio blanco o cenizo y pueden producir abundantes picnidios. También afirman que bajo condiciones de alta humedad pueden ocasionar necrosis foliares y se han encontrado en diferentes categorías de granos de arroz que abarcan desde aparentemente sanos hasta manchados vanos.

S. oryzae es el agente causal de la pudrición de la vaina, enfermedad que cobra importancia desde su aparición en Cuba a partir de 1997. Se puede encontrar en la cubierta seminal, endospermo y embrión. En las inoculaciones realizadas, se observó que este hongo causó manchas de diversos tipos, tamaño y coloración; algunos granos resultaron decolorados, otros mostraron manchas puntuales pardo rojizas, y en otros casos de color pardo oscuro que llegaron a converger causando necrosis total de los granos. Este patógeno provocó, además, amarillamiento y marchitez de las plántulas en semillero, pudrición de las semillas, esterilidad, no emergencia de la panícula, reducción del porcentaje de germinación y del número de espiguillas por panículas, del peso y contenido de azúcares totales, así como de almidón proteínas de los granos [39,44,49].

Las especies de hongos que no fueron patogénicas, son generalmente saprófitas, y no causan afectaciones importantes al cultivo. No obstante, algunas pudieran estar relacionadas con la producción de micotoxinas (Aspergillus sp. y Penicillium sp.), que tienen una repercusión importante en la salud humana y animal, como refieren Lima et al [50] en su trabajo sobre micoflora y especies aflatoxigénicas en derivados de arroz molinado. Por otra parte, la especie Sclerotium hydrophilum, causante de podredumbre de tallo, que ha sido aislada de arroz y comprobada su patogenicidad por otros autores, como Cedeño et al [51] en nuestras condiciones experimentales no reprodujo los síntomas al ser inoculada, por lo que no se consideró como patógena en nuestro trabajo.

Conclusiones

Se determinaron 35 especies, correspondientes a 19 géneros de hongos, asociadas al manchado del grano en la variedad INCA LP-5; entre ellas, se señalan como nuevos informes para Cuba: B. maydis, F. merismoides, F. solani, F. subglutinans, P. itallicum, P. medicaginis var. pinodella y S. racemosum.

Los hongos de mayor incidencia fueron B. oryzae, S. oryzae y especies de los géneros Alternaria, Fusarium, Curvularia y Phoma.

Se confirmó que los hongos F. subglutinans (nuevo informe), B. oryzae, A. padwickii, Alternaria sp., F. verticillioides, C. lunata, C. lunata var. aeria, C. pallescens, C. senegalensis, Curvularia sp., Phoma sp. y S. oryzae, son agentes causales del manchado del grano de arroz.

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