Keila Esteli Torres Izarra^a, Yeinmy Heliannie Moran Borges^a, Elvis José Valderrama Rios^b, Miguel Ángel Chiurillo Siervo^a,*

^aLaboratorio de Genética Molecular “Dr. Yunis-Turbay”. Decanato de Ciencias de La Salud. Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado” (UCLA). Barquisimeto, Venezuela.

^bDepartamento de Anatomía Patológica, Hospital Antonio María Pineda. UCLA, Barquisimeto, Venezuela.

* Correspondencia: E-mail: mchiurillo@ucla.edu.ve

Resumen: Helicobacter pylori es una bacteria que coloniza la mucosa del estómago produciendo enfermedades gástricas crónicas. Las cepas que expresan el factor de virulencia CagA se unen al epitelio gástrico e inyectan en él esta proteína, la cual es activada por fosforilación en residuos de tirosina ubicados en el motivo EPIYA. Dependiendo del número y tipo de motivo EPIYA (EPIYA-A, B, C y D), se inducen transformaciones celulares que juegan un papel importante en el desarrollo de enfermedades gastroduodenales asociadas con H. pylori. El objetivo de este trabajo fue determinar la frecuencia de las variantes de EPIYA en cepas de H. pylori cagA positivas de la región centroccidental de Venezuela. Se estudiaron 81 muestras de ADN extraídas de biopsias gástricas tomadas de individuos con gastritis crónica. El tipo de motivo EPIYA fue determinado por PCR y secuenciación. Solamente se detectaron variantes de EPIYA descritas para países occidentales: ABC (58,0%), ABCC (38,3%) y ABCCC (3,7%). La baja prevalencia detectada de cepas de H. pylori con tres repeticiones de EPIYA-C, las cuales se conocen por generar un mayor riesgo a cáncer gástrico, puede encontrase entre las razones que expliquen la escasa incidencia de cambios histológicos severos en las muestras de gastritis crónica analizadas.

Palabras clave: Helicobacter pylori, CagA, EPIYA, gastritis crónica.

Variants of the EPIYA motif of Helicobacter pylori CagA protein in gastric biopsies from patients with chronic gastritis from the center-occidental region of Venezuela

Abstract: Helicobacter pylori is a bacterium that colonizes stomach mucous tissue producing chronic gastric disease. The strains that express the CagA virulence factor adhere to the gastric epithelium and inject this protein, which is activated by phosphorilation at tyrosine residues located in the EPIYA motif. Depending on the number and type of EPIYA motif (EPIYA-A, B, C, and D), cellular transformations are induced which play an important role in the development of H. pylori associated gastro duodenal diseases. The objective of this work was to determine the frequency of the EPIYA variants in cagA positive H. pylori strains from the center-occidental region of Venezuela. The study included 81 DNA samples extracted from gastric biopsies taken from individuals with chronic gastritis. The type of EPIYA motif was determined by PCR and sequencing. Only EPIYA variants described for occidental countries were detected: ABC (58.0%), ABCC (38.3%) and ABCCC (3.7%). The low prevalence of H. pylori strains with three EPIYA-C repetitions detected, which are known to generate a higher gastric cancer risk, could be one of the reasons that explain the low incidence of severe histological changes in the chronic gastric samples analyzed.

Keywords: Helicobacter pylori, CagA, EPIYA, chronic gastritis.

Introducción

Helicobacter pylori es una bacteria gramnegativa microaerofílica de forma espiralada, reconocida como un agente causal de cáncer gástrico, siendo este último considerado como la segunda causa más común de cáncer en el mundo, con 736.000 muertes en el año 2008 [1]. En Venezuela, el cáncer gástrico ocupa el tercer lugar como causa de muerte por neoplasias malignas [2].

La infección con H. pylori ocurre generalmente en la niñez a través de las vías oral–oral o fecal–oral. La bacteria se aloja en la mucosa gástrica, lo que le permite protegerse de la acidez gástrica, a su vez metaboliza urea para liberar amonio y de esta forma neutraliza el ácido del medio [3]. Una vez adquirida, la infección persiste durante toda la vida si no es tratada con antibióticos [3-5].

H. pylori presenta alta variabilidad genética producto de una elevada tasa de mutaciones y eventos recombinatorios que le permiten adaptarse rápidamente a los cambios del ambiente [6,7]. A pesar de la diversidad genómica de H. pylori, varios elementos genéticos de la bacteria han revelado su importancia como factores de virulencia en estudios epidemiológicos, siendo el mejor estudiado la isla de patogenicidad cag (cag-PAI), la cual es un fragmento de 40 Kpb que codifica un sistema de secreción tipo IV [8]. Cuando H. pylori invade el organismo, inyecta la proteína antígeno citotóxico asociada al gen A (CagA) en las células epiteliales gástricas a través de dicho sistema [5,9]. Sin embargo, cag-PAI no es una entidad uniforme, siendo susceptible a disrupción debido a rearreglos genéticos que pueden ocurrir interna o externamente a los genes constituyentes de la misma, lo cual puede determinar que algunas cepas de H. pylori no expresen CagA o sean incapaces de inyectarla a las células del hospedero [10].

Una vez en el interior de las células epiteliales, CagA es fosforilada por múltiples miembros de la familia de kinasas Src (SFK) que actúan sobre los residuos de tirosina presentes en la región C-terminal de la proteína [5,9]. Esta fosforilación le permite a la proteína CagA unirse y activar a la tirosina fosfatasa SHP-2, lo cual induce cambios morfológicos por rearreglos del citoesqueleto (elongación celular conocida como fenotipo colibrí). Las cascadas iniciadas por la activación de SHP-2 pueden generar desregulación en el crecimiento, sobrevivencia y migración de las células epiteliales gástricas [3,5,9,11].

Las cepas de H. pylori productoras de CagA funcionalmente activa, pueden provocar una respuesta inflamatoria severa en las células epiteliales gástricas al inducir la secreción de moduladores proinflamatorios, como la interleuquina-8 (IL-8). El incremento de la infiltración de la mucosa gástrica por linfocitos, leucocitos polimorfonucleares y macrófagos, de persistir, puede inducir gastritis crónica superficial, la cual pudiera progresar a gastritis crónica atrófica, metaplasia intestinal, displasia y en última instancia en cáncer [12,13]. Por otra parte, algunos individuos infectados por cepas de H. pylori productoras de CagA pueden desarrollar enfermedad péptica ulcerosa [14].

El sitio de fosforilación de residuos de tirosina en CagA es caracterizado por la presencia de un motivo repetido Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala (EPIYA), el cual se presenta en número variable en la región C-terminal de la proteína [15]. Hasta la fecha se han descrito cuatro motivos EPIYA diferentes: A, B, C y D, quienes se diferencian entre sí por la secuencia de aminoácidos adyacente a la secuencia EPIYA [15].

Ha sido descrita una distribución geográfica particular de las cepas de H. pylori productoras de CagA según los motivos EPIYA que presenten. Los aislados de países occidentales, provenientes de Europa, Norte América y Australia, poseen comúnmente EPIYA-A, EPIYA-B seguidas de uno a tres motivos de EPIYA-C, mientras que gran parte de las muestras obtenidas de oriente, específicamente del este asiático, presentan EPIYA-A, EPIYA-B seguida en varios casos por EPIYA-D [5,10,15,16].

Los motivos EPIYA-C y EPIYA-D representan los principales sitios de fosforilación en CagA, siendo este último más afín a la unión con la SHP-2 que los motivos EPIYA-C. Como resultado de estas interacciones, las cepas de H. pylori productoras de CagA del este de Asia han sido asociadas con un alto índice de gastritis crónica y mayor potencial oncogénico; mientras que las cepas de H. pylori que presentan más repeticiones de los motivos EPIYA-C se ubican en segundo lugar en su capacidad oncogénica [5,10,15].

En este trabajo se evaluó el número y tipo de motivos EPIYA para determinar si representa un marcador importante del grado de patogenicidad de H. pylori y su posible asociación con el desarrollo de enfermedades gástricas en el país.

Materiales y métodos

Aislados clínicos: Se estudiaron 81 muestras de ADN genómico extraído directamente de biopsias gástricas obtenidas por endoscopia superior entre los años 2005 y 2008 en el Servicio de Gastroenterología del Hospital Antonio María Pineda (HAMP) de Barquisimeto, estado Lara, Venezuela. Todas las muestras son de pacientes con diagnóstico endoscópico e histopatológico de gastritis crónica (28 hombres y 53 mujeres). La edad promedio de los pacientes fue 42,9 años (rango: 18-76 años). Todas las muestras habían sido identificadas en estudios previos o en el presente como H. pylori cagA positivas mediante la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) de un fragmento de la región 5’ del gen empleando los oligonucleótidos cag5c-F (5`-GTTGATAACGCTGTCGCTTC-3`) y cag3c-R (5`-GCGTTGTATGATATTTTCCATAA-3`) siguiendo las condiciones descritas anteriormente [19,20].

De cada paciente se obtuvieron dos biopsias del antro y dos del cuerpo gástrico. Los criterios de exclusión fueron: menor de 18 años, cirugía gástrica previa y tratamientos previos contra H. pylori, antecedentes de hemorragia y trastornos de la coagulación, consumo de antibióticos durante los 3 meses anteriores a la endoscopia, consumo de sales de bismuto, inhibidores de la bomba de protones o sucralfato en el mes anterior. Este estudio fue aprobado por la Comisión de Bioética del Decanato de Ciencias de la Salud, Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado” (UCLA). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes en este estudio.

Las extracciones de ADN fueron realizadas directamente de las biopsias colocando en un mismo tubo una muestra de cada región gástrica y empleando el kit Wizard Genomic DNA Purification System (Promega). El ADN extraído fue preservado a -20°C hasta su uso.

Detección y amplificación de la secuencia EPIYA de la región de cagA: Se usaron dos pares de iniciadores, cagA2530S (5`-GTTAARAATRGTGTRAAYGG-3`, donde R= A o G y Y= T o C) / cagA3000AS (5`-TTTAGCTTCTGATACCGC-3`) [16] y cag2 (5`-GGAACCCTAGTCGGTAATG-3`) / cagA-p3E (5`-ATCAATTGTAGCGTAAATGGG-3`) [21]. Los iniciadores cagA2530S y cagA3000AS fueron utilizados en el análisis de todas las muestras, y las condiciones de la reacción de PCR fueron las siguientes: un ciclo de desnaturalización inicial a 95 °C por 3 min, seguido por 35 ciclos con una temperatura de desnaturalización de 95 °C por 30 seg, anillamiento por 45 seg a 55 °C y una elongación a 72 °C por 45 seg, finalmente una extensión a 72 °C por 5 min. La mezcla de reacción (25 µL) se preparó con buffer 1X, 1,5 mM de MgCl_2, 200 µM de dNTPs, 0,8 µM de cada primer, 2 µL de ADN, 1,25 U de GoTaq^® flexi ADN polymerase (Promega).

Las muestras que no amplificaron para los iniciadores anteriormente mencionados fueron probadas en una segunda reacción de PCR empleando los oligonucleótidos cag2 y cagA-p3E. Para determinar la presencia del motivo EPIYA-D se emplearon los iniciadores cag2 y cagA-pD (5`-TTGATTTGCCTCATCAAAATC-3’) [20], ya que el oligonucleótido reverso cagA-pD ancla específicamente en la secuencia de EPIYA-D. En ambos casos, fueron empleadas las mismas condiciones de amplificación antes mencionadas exceptuando que la temperatura de anillamiento fue de 58 °C.

Los productos de PCR fueron analizados mediante electroforesis en geles de agarosa al 2%, teñidos con bromuro de etidio y visualizados con luz UV.

Secuenciación de ácidos nucléicos: Con el fin de confirmar la correspondencia entre el tamaño de los productos de PCR y el tipo de motivo EPIYA obtenidos en este trabajo, 9 fragmentos fueron purificados mediante el kit Wizard SV Gel y PCR clean-up System (Promega) y posteriormente sometidos a secuenciación de nucleótidos con la metodología “Dye Terminator” en un equipo ABI 310 (Applied Biosystems). Se obtuvieron las secuencias de ambas hebras de cada fragmento realizando la reacción de secuencia por separado para cada iniciador utilizado en las PCRs iniciales (cagA2530S/cagA300AS).

Evaluación histopatológica: Las muestras del antro y cuerpo gástrico fueron embebidas en parafina, y secciones de las mismas teñidas con hematoxilina y eosina. La gastritis fue histológicamente evaluada de acuerdo al sistema Sydney [22] para la presencia de gastritis atrófica, y el grado de infiltración por granulocitos (G0/G1, ausencia y leve; G2/G3, moderado y severo) y linfocitos (L0/L1, ausencia y leve: L2/L3, moderado y severo).

Análisis estadístico: Los datos fueron analizados mediante el paquete estadístico SSPS 11.0, empleando el test de Fisher o χ² para comparar las diferencias entre los grupos analizados. Las diferencias fueron consideradas estadísticamente significativas para valores de p<0,05.

Resultados

Se detectaron 3 de los tipos de EPIYA descritos: ABC, ABCC y ABCCC. Las reacciones de PCR desarrolladas por Panayotopoulou et al [16] y Jones et al [21] permiten la amplificación de fragmentos con aproximadamente 100 pb de diferencia ante la presencia de motivos EPIYA C o D. Las diferencias de peso molecular entre las distintas variantes encontradas concuerdan con variación en el número del motivo EPIYA-C existente [16,21]. El tamaño de los fragmentos está determinado por la amplificación de EPIYA-A y EPIYA-B, seguido de una a tres repeticiones de EPIYA-C (ABC, ABCC y ABCCC) (Figura 1).

Debido a que el motivo EPIYA-D también puede presentar un tamaño de aproximadamente 100 pb, y los iniciadores reversos cagA-p3E y cagA3000AS pueden anclar en ambos tipos de motivos (C o D), se evaluaron las muestras que revelaron EPIYA tipo ABC mediante PCR con los oligonucleótidos cag2 y cagA-pD. En todos los casos analizados con estos iniciadores la amplificación resultó negativa, confirmando que las cepas evaluadas carecen de motivo EPIYA-D.

Entre las 81 muestras de H. pylori cagA positivas evaluadas la tipificación del motivo EPIYA mostró que 47 (58%) eran tipo ABC, 31 (38,3%) eran tipo ABCC y 3 (3,7%) presentaron 3 copias de EPIYA-C (ABCCC) (Tabla 1). No se obtuvieron productos de PCR con tamaños compatibles con menos de 3 o más de 5 repetidos EPIYA.

Tabla 1. Distribución de las distintas variantes de EPIYA de acuerdo a los grados de lesión histopatológica en muestras de pacientes con gastritis crónica.

Evaluación histológica de la gastritis según sistema Sydney [22]: infiltración por granulocitos (G0/G1, ausencia y leve; G2/G3, moderado y severo), infiltración por linfocitos (L0/L1, ausencia y leve; L2/L3, moderado y severo). No se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p<0,05).

No hubo diferencias estadísticamente significativas entre el tipo de EPIYA y el grado de lesión histopatológica encontrada en las biopsias, incluso cuando se consideraron en conjunto las muestras con 2 y 3 motivos EPIYA-C.

Al obtener la traducción a aminoácidos de las secuencias obtenidas se observó correspondencia con las reportadas como conservadas para definir el tipo de motivo EPIYA: EPIYA-A: EPIYAKVNKKK(A/T/V/S)GQ; EPIYA-B: EPIY(A/T)(Q/K)VAKKVNAKI y EPIYA-C: EPIYATIDDLG [16] (Figura 2). Seis de los fragmentos caracterizados por secuenciación presentaron motivos EPIYA-B, en los cuales el residuo A (alanina) es reemplazado por T (treonina).

Discusión

La producción de CagA por H. pylori se considera un factor importante para generar un estado inflamatorio persistente en la mucosa del estómago, el cual puede determinar la evolución de la gastritis crónica no-atrófica a gastritis atrófica, y en continuar el proceso de múltiples pasos hacia el desarrollo del adenocarcinoma gástrico [5,10]. El análisis de los motivos de fosforilación EPIYA ha sido sugerido como una forma de predecir la evolución y pronóstico de las enfermedades asociadas a la infección por H. pylori [16,23].

Las variantes de EPIYA detectadas en las muestras de pacientes con gastritis crónica (ABC, ABCC y ABCCC) corresponden a las prevalentes principalmente en poblaciones Occidentales (Europa, Norte América y Australia) [5,10,15,24], con un predominio del tipo ABC de EPIYA (58,0%). Resultados similares en cuanto a la distribución de EPIYA fueron obtenidos por Sicinschi et al [25] con muestras de pacientes del estado de Nariño en Colombia, los cuales reportaron una distribución en las muestras de 64,2% para aquellas que presentaban una repetición C, mientras que el 34,3% y el 1,5% correspondían a la presencia de dos y tres motivos de EPIYA-C, respectivamente. Otro estudio con aislados mexicanos de H. pylori cagA positivos reportó cerca del 30% de los mismos con 2 o 3 motivos EPIYA-C [26].

Rizzato et al [27] describen en muestras de pacientes venezolanos y mexicanos con gastritis crónica, y Torres et al [28] en pacientes cubanos, una prevalencia aún mayor de EPIYA ABC (70.37/73,6%), mientras que los tipos ABCC y ABCCC fueron encontrados en 18,5/20,0% y 3,7/2,1%, respectivamente. En el estudio de Rizzato et al [27] la frecuencia detectada de EPIYA ABC en muestras provenientes de pacientes con cáncer gástrico fue de 88,4%, y no se encontraron muestras con EPIYA ABCCC en las mismas. Por último, la prevalencia de EPIYA ABC encontrada es muy similar a la reportada en un estudio que analizó cepas de H. pylori de Inglaterra y Escocia (62,3%) [24].

Las técnicas de PCR permiten de manera confiable establecer la correspondencia entre fragmentos amplificados con tamaños de 400/510 pb o 500/610 pb y la combinación de motivos EPIYA ABC y ABCC, respectivamente [16,21]. Adicionalmente, no detectamos amplificación de fragmentos correspondientes a cagA con dos repetidos EPIYA. Por lo tanto, en la gran mayoría de los casos (ABC+ABCC= 96,5%), el tamaño de los productos de PCR obtenidos permitió predecir el número y tipo de EPIYA presente. Debido a que las reacciones de PCR empleadas no permiten establecer el tipo de motivo EPIYA exacto entre las combinaciones ABCCC y ABABC, las 3 muestras con tamaño correspondiente a 5 repetidos EPIYA fueron secuenciadas, confirmándose la combinación ABCCC. A diferencia de estudios recientes llevados a cabo en nuestro continente, no fueron detectadas muestras con combinaciones de dos motivos EPIYA, ni con el tipo ABABC [26,28].

Evidenciamos baja prevalencia de cepas con tres repeticiones EPIYA-C, las cuales han sido asociadas en países occidentales con un mayor riesgo a cáncer gástrico, debido a que los motivos de EPIYA-C presentan una alta afinidad por la SHP-2 [5]. No se detectó en ninguna muestra la variante EPIYA ABD, la cual es característica de las muestras del este de Asia [24]. Esta variante se asocia con mayor inducción en el aumento de la oncogénesis, del fenotipo colibrí y del incremento del índice de gastritis crónica y cáncer [5,15].

Aunque hay evidencias en aumento de que la presencia de múltiples segmentos de EPIYA-C está involucrada desarrollo de enfermedades gástricas, [25,29,30] no se encontró asociación entre el número de EPIYA-C y la severidad de cambios histopatológicos en la mucosa gástrica. Resultados similares han sido reportados en otros estudios en poblaciones de Colombia e Irán, en los cuales no se detectó una correlación positiva entre el número de motivos EPIYA y diferentes enfermedades gastroduodenales asociadas a la infección por H. pylori [31,32]. Por otra parte, Batista et al [33] demostraron en cepas de H. pylori obtenidas de pacientes con gastritis en Brasil que el cáncer gástrico, la atrofia y la metaplasia intestinal están asociados con un mayor número de motivos EPIYA-C, sin embargo, no encontraron asociación entre las variantes de EPIYA y la formación de úlceras duodenales.

Nuestros resultados sugieren que las cepas de H. pylori analizadas presentan en mayor proporción tipos de EPIYA conocidos por su bajo potencial patogénico. Sin embargo, no podemos descartar la influencia del relativamente reducido tamaño de la muestra estudiada y/o la constitución genética del hospedador en nuestras observaciones. Estudios previos de nuestro grupo indican que existe un sinergismo entre los factores de virulencia de H. pylori y los polimorfismos genéticos de la citocina proinflamatoria IL-1 que presenta el hospedero con el desarrollo de formas más severas de gastritis crónica en esta región de Venezuela [19,34]. Por otra parte, estudios recientes han reportado actividades proinflamatoria y prooncogénica de CagA independientes de los motivos EPIYA que tal vez sean relevantes para el desarrollo de enfermedades gastroduodenales [25].

Aunque CagA es el marcador de virulencia de H. pylori mejor establecido, la sola determinación del status de cagA no es suficiente para predecir el resultado clínico en poblaciones con alto riesgo, en las cuales la mayoría de los individuos infectados por H. pylori, lo están por cepas cagA positivas. Por esta razón, consideramos relevante evaluar con más profundidad el papel de los factores genéticos que determinan la relación H. pylori/hospedero, y su influencia en la prevalencia de cáncer gástrico en el país.

Agradecimientos

Al Dr. José Luis Ramírez por facilitar la secuenciación de ácidos nucleicos en el Centro de Biotecnología de IDEA (Caracas, Venezuela). Este trabajo es el resultado de los proyectos aprobados por el CDCHT-UCLA: 025-ME-2005 y 018-RCS-2011.

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