Jackeline Cortez, Yassellis Ruiz, Luís Medina*, Oscar Valbuena

Centro de Investigaciones Microbiológicas Aplicadas, CIMA-UC, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo, Valencia, Venezuela.

* Correspondencia: E-mail: cima.uc@gmail.com

Resumen:

Debido a su uso por humanos y para preservar la salud pública, los ambientes marinos recreacionales, deberían cumplir requisitos de calidad fisico-química y microbiológica. Sin embargo, actividades antropogénicas, tales como agricultura, ganadería, industriales, turísticas y domésticas, pueden descargar aguas servidas en playas marinas. La metodología vigente para evaluar la carga bacteriana de aguas recreacionales, no pareciera satisfactoria, particularmente en la detección de microorganismos patógenos debido a la presencia, en aguas marinas, de bacterias viables pero no cultivables (VBNC). Este estudio evaluó la carga bacteriana de aerobios mesófilos, coliformes totales/fecales y enterococos, en playas de Chichiriviche, Falcón, Venezuela y el efecto de concentraciones de agua marina sobre las densidades bacterianas. Las determinaciones se efectuaron en agar nutritivo, Mac Conkey y KF, preparados con agua destilada (MAD) o con agua de mar 10% v/v, (MAM). La carga bacteriana se incrementó entre 20 y 47 veces cuando los medios de cultivo se suplementaron con agua de mar. Las diferencias en las cargas bacterianas entre MAD y MAM, para aerobios mesófilos, coliformes totales y fecales fueron estadísticamente significativas (p≤0,05). El oxígeno disuelto y pH, en ambos medios presentaron valores permisibles.

Palabras clave: balneabilidad, agua de mar, VBNC, coliformes totales y fecales, enterococos.

Effect of culture media prepared with sea water over health indicators in sea water of the Chichiriviche resort, Falcon State, Venezuela

Abstract:

Due to their use by humans and to preserve public health, recreational marine environments should fulfill physico-chemical and microbiological quality prerequisites. Nevertheless, anthropogenic activities such as agriculture, cattle raising, industrial, touristic and domestic, can discharge contaminated water at marine beaches. The present methods for evaluating the bacterial load of recreational waters does not appear satisfactory, especially concerning the detection of pathogenic microorganisms due to the presence, in marine waters, of viable but not cultivable bacteria (VNCB). This study evaluated the bacterial load of mesophilic aerobials, total and fecal coliforms, and enterococci at the Chichiriviche beaches, Falcon State, Venezuela, and the effect of marine water concentrations over the bacterial densities. The determinations were done in nutrient, Mac Conkey and KF agar prepared with distilled water (MAD) or with sea water (MSW). The bacterial load increased between 27 and 47 times when the culture media were supplement with sea water. The differences of the bacterial loads between MAD and MSW for mesophilic aerobials, total and fecal coliforms were statistically significant (p≤0.05). Dissolved oxygen and pH presented permissible values in both media.

Recibido 13 de noviembre de 2012; aceptado 10 de julio de 2013

Introducción

El hábitat preponderante del planeta lo constituyen los ambientes marinos, ocupando aproximadamente el 72% de su superficie [1]. La fuente más común de contaminación en aguas y sedimentos marinos proviene de actividades antropogénicas realizadas en tierra, las cuales incluyen descargas industriales, agrícolas y aguas domésticas servidas, problemática común en todos los países, independientemente de su nivel de desarrollo social y económico [2-4]. Tal práctica se debe fundamentalmente a dificultades logísticas y económicas asociadas al tratamiento adecuado de las aguas luego de su uso [5]. En el área del Caribe la causa más común de contaminación marina proviene de aguas domésticas servidas, originadas en centros poblados, actividades turísticas y agrícolas. Para disminuir, eliminar y controlar tal contaminación se ha adoptado un protocolo de procedimientos que intenta regular las fuentes de contaminación establecidas en tierra (Control of Land Based Source of Marine Pollution, LBS protocol) promulgado en Cartagena [6]. A los mares ingresan constantemente bacterias, algunas con diversos grados de patogenicidad para el hombre, animales y plantas, conociéndose de forma insuficiente el destino de estas bacterias una vez que ingresan al medio marino [4]. El tiempo de permanencia de bacterias potencialmente patógenas, en aguas y sedimentos marinos es relativamente largo, abarcando meses [7,8]. La situación se agrava pues las bacterias, al incursionar en estos ambientes, pueden entrar en un estado fisiológico de latencia conocido como “viable pero no cultivable” (VBNC, por su siglas en ingles), el cual se caracteriza por su incapacidad de formar colonias en medios de cultivo sólidos, permaneciendo viables y expresando su patogenicidad en ambientes permisibles [5,9,10] y en algunos casos, perdiendo características típicas para su identificación tradicional [11]. Esta condición fisiológica es inducida por condiciones estresantes del ambiente donde habitan los microorganismos, tales como alta salinidad (osmolaridad), cambios bruscos y bajas temperaturas, escasez de nutrientes, pH, incidencia de luz visible y ultravioleta, infección por bacteriófagos, predación por protozoarios, pudiéndose presentar cambios morfológicos en las bacterias, aumento de expresión de factores de virulencia, modificaciones superhelicoidales de plásmidos, modificaciones en la población de ribosomas y acumulación intracelular de solutos de bajo peso molecular [12-18]. La condición VBNC puede alterar e interferir con la detección de microorganismos en los ambientes evaluados [5,9,19], lo cual podría exponer a los usuarios de aguas recreacionales a riesgos de salud ocasionados por la presencia de coliformes totales y fecales, Salmonella y Vibrio cholerae [2,20]. La condición VBNC, en bacterías, ha sido descrita en aguas y arenas marinas tropicales, antárticas, ríos, lagunas y cuevas [2,5,8,9,21-23]. La metodología actual aprobada por los entes encargados de supervisar la calidad de las aguas, recomiendan la utilización de medios de cultivo sólidos (agar Mac Conkey, agar KF, agar nutritivo), para la detección y cuantificación de coliformes totales y fecales, enterococos y aerobios mesófilos, respectivamente [24]. Estos medios contienen bajas concentraciones salinas y a algunos de ellos se le adicionan sustancias que los convierten en medios restrictivos para los grupos bacterianos, en condiciones de temperatura establecidas. El ambiente marino por su relativa alta salinidad, su variable temperatura, escasez de nutrientes, entre otros, constituye un hábitat estresante y restrictivo, provocando, en la población bacteriana asociada a él, cambios subletales y estructurales que establecen situaciones no aptas para su cuantificación (incapacidad de sustentar la división celular y no formar colonias), cuando son transferidas a medios de cultivo in vitro, sólidos o líquidos. Existen reportes que indican que bacterias entéricas humanas, VBNC, pueden formar colonias en medios no selectivos y que bacterias típicas del medio marino (aguas, sedimentos y plantas), no asociadas a animales, pueden mimetizar las características de coliformes en placas de agar suplementado con sales biliares, lo cual interfiere con la determinación de la carga bacteriana en este último grupo [25,26]. En el presente estudio se determinó el crecimiento de bacterias aeróbicas mesófilas, coliformes (totales y fecales) y enterococos, en muestras de agua de mar provenientes de cuatro playas de Chichiriviche, estado Falcón, Venezuela, en medios de cultivo (agar nutritivo, agar Mac Conkey y agar KF) siguiendo el método estándar (preparados en agua destilada) y una modificación de tal método (medios suplementados con agua de mar), con el objeto de comparar el efecto del agua de mar en los medios de cultivo y su influencia sobre la carga bacteriana.

Materiales y métodos

Área de estudio y muestreo: El estudio se realizó en la zona costera de Chichiriviche, municipio Iturriza, estado Falcón, Venezuela. Las muestras se recolectaron en cuatro balnearios de la zona: playa Norte, playa Sur (Fábrica de Cemento), Puerto Adentro (playa Los Cocos) y Plaza de Los Niños. El muestreo se efectuó una vez al año, en agosto, por dos años consecutivos (2006 y 2007). En playa Norte y playa Sur, por ser los balnearios de mayor superficie, se recolectaron muestras en 6 puntos de las playas, en Puerto Adentro y Plaza de Los Niños 4 y 3 muestras, respectivamente. Las muestras se recogieron a 14 m de la orilla de las playas, a un metro de profundidad y en horas de la mañana. La situación geográfica de los puntos de muestreo se estableció con un equipo GPS y se detallan en la figura 1.

Toma de muestras: Las muestras se recolectaron en botellas de vidrio ámbar de 3,8 L de capacidad, esterilizadas, dejando una cámara de aire de 2,5 cm, cerradas herméticamente y trasladadas al laboratorio, sobre hielo, procesándose en un lapso no mayor a las 8 h después de haber sido recolectadas [24].

Determinación de parámetros fisicoquímicos: La temperatura, pH y oxígeno disuelto, se determinaron in situ, usando un termómetro digital, un medidor de pH (Checher by Hanna) y un medidor de oxígeno (Dissolved oxygen/°C meter, DO 100 series, OAKTON®), respectivamente.

Viabilidad de cultivos bacterianos en presencia de agua de mar: La viabilidad de las bacterias presentes en las muestras de agua de mar de Chichiriviche, se evaluó en agar Mac Conkey (HIMEDIA, M083) y agar KF (Kennel fecal, Merck 10707), mediante la técnica de membrana filtrante. A tales efectos se procedió de la siguiente manera: una muestra compuesta de agua de mar, preparada al mezclar volúmenes iguales de las aguas marinas provenientes de las cuatro playas en estudio, se diluyó con agua destilada estéril a concentraciones finales de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 y 90% v/v; posteriormente se prepararon placas de agar Mac Conkey y KF, utilizándose las diferentes diluciones de agua de mar (10-90%) y la mezcla compuesta sin diluir (100%), esterilizándose los medios a 121 ºC, 15 libras de presión durante 15 min. Volúmenes de 100 mL de diferentes diluciones de agua de mar (sin esterilizar) se filtraron a través de membranas de ésteres de celulosa, de 47 mm de diámetro y 0,45 μm de diámetro de poro (Advantec, Toyo Roshi Kaisha, Japón). Las membranas se incubaron sobre placas de agar Mac Conkey a 37 y 44 ºC para la determinación de coliformes totales (CT) y fecales (CF) respectivamente y en agar KF a 37 ºC para los enterococos (E). El contaje de colonias se realizó, luego de 24 a 48 h de incubación, en un contador de colonias (Colony Counter 560 Suntex), en las membranas que contenían entre 20 y 80 colonias. Luego de considerar las diluciones, se calculó el número de colonias por 100 mL de agua de mar sin diluir. Para efectos comparativos, estas experiencias se repitieron con medios preparados con agua destilada.

Aerobios mesófilos (método vertido en placa): Alícuotas estudio, se cultivaron en placas de Petri, con 15 mL de agar nutritivo (HIMEDIA, M088) preparado con la mezcla de agua de mar a una concentración final del 10% v/v (técnica modificada) o preparado con agua destilada (técnica estándar), incubándose en estufa a 37 °C y luego de 24 h, se determinó la carga bacteriana. Tomando en consideración los volúmenes ensayados se calculó la carga bacteriana en UFC/100 mL de agua de mar.

Coliformes (método concentración por filtración sobre membranas): Volúmenes de agua de mar pura o diluida, con agua destilada estéril, se filtraron a través de membranas de ésteres de celulosa, de 47 mm de diámetro y 0,45 μm de diámetro de poro (Advantec, Toyo Roshi Kaisha, Japón). Para estas determinaciones se procedió de la siguiente manera: con la “técnica estándar”, 100 mL de agua de mar pura se filtraron, a vacío reducido, y la membrana se incubó sobre una placa de agar Mac Conkey, preparado con agua destilada estéril. Con la “técnica modificada”, agua de mar se diluyó con agua destilada estéril, a concentraciones finales de 1, 5 y 10% v/v, filtrándose 100 mL de cada dilución, luego la membrana se incubó sobre una placa de agar Mac Conkey, preparado con agua de mar al 10% v/v. Las placas se incubaron a 37 °C (CT) y 44 °C (CF) durante 24 h. El recuento de colonias (UFC/100 mL) se realizó, en las membranas que contenían entre 20 y 80 colonias, en un contador automatizado de colonias.

Enterococos (método de concentración por filtración fue similar al descrito para coliformes, pero las membranas de celulosa se incubaron en placas de agar KF, a 37 °C durante 48 h.

Identificación de cepas bacterianas. Las colonias obtenidas mediante filtración sobre membranas se sembraron en placas de agar infusión cerebro corazón (HIMEDIA, BHI; M210I) conteniendo cantidades decrecientes de agua de mar (7, 4 y 1%), cultivándose por 24 h a 37 ºC, con la finalidad de aclimatar las cepas a los medios de cultivo estándar y para su posterior identificación mediante pruebas bioquímicas tradicionales (oxidasa, catalasa) y galerías API D32GN, siguiendo las indicaciones del fabricante, leyéndose en un equipo Mini API (Biomérieux modelo INS005039).

Análisis estadístico: Se utilizó la prueba estadística no paramétrica de Mann-Whitney, para determinar la existencia de diferencias significativas entre los resultados obtenidos con la “técnica estándar” y la “técnica modificada”. Los cálculos se efectuaron empleando el programa SPSS versión 12.

Resultados

Parámetros fisicoquímicos: Los valores promedios y desviaciones estándar de los parámetros determinados en las playas evaluadas se detallan en la tabla 1. El promedio de temperatura para cada playa osciló entre 26,4 °C (playa Plaza de Los Niños) y 31,5 °C (playa Sur), con un valor promedio para el muestreo I de 29,1 °C, mientras que para el muestreo II los valores mínimo, máximo y promedio fueron 30,0 (playa Sur); 34,4 (playa Norte) y 31,5 °C, respectivamente. Los valores de pH, a excepción del registrado en la playa Plaza de Los Niños en el muestreo I, el cual fue de 10,1, se ubicaron en el intervalo permisible según el Decreto 883 (6,5-8,5), registrándose valores comprendidos entre 7,9 (playa Sur) y 8,5 (playa Puerto Adentro). La variación de pH en el muestreo II no superó 0,05 unidades, y su valor promedio fue de 8,2. En el muestreo I la variación de pH fue mayor, alcanzando valores de hasta 2 unidades (playa Sur respecto a playa Plaza de Los Niños), obteniéndose un promedio de 8,7, ligeramente superior al máximo permitido. La concentración de oxígeno disuelto, en todos los casos, superó el valor límite mínimo permisible (>5 mg/L). Los valores mínimo y máximo detectados fueron 5,3 y 9,2 mg/L en Plaza de Los Niños y los promedios para los muestreos I y II fueron 5,9 y 8,4 mg/L, respectivamente.

Viabilidad bacteriana en medios sólidos suplementados con agua de mar: El efecto que ejerce el agua de mar sobre la carga bacteriana (UFC/100 mL), se reporta en la tabla 2. En el caso de CT se evidenció una estimulación a concentraciones de agua de mar de 10-50% v/v, obteniéndose un valor máximo de 13.800 UFC/100 mL, en el sistema a 10%, mientras en el sistema control (0% de agua de mar) la carga bacteriana fue de 5.400 UFC/100 mL Para CF las cargas bacterianas fueron de 10.200 y 8.000 UFC/100 mL, en los medios al 10% y 0%, respectivamente; en el caso de E, se alcanzaron valores de 58.800 UFC/100 mL en presencia de agua de mar 10% y en su ausencia se obtuvieron valores de 4.280 UFC/100 mL.

Carga bacteriana en las muestras de aguas de mar. Después de constatar que el agua de mar, incorporada a una concentración del 10 % v/v a los medios de cultivo, ejerció un efecto estimulatorio sobre la viabilidad microbiana, se procedió a determinar la carga bacteriana correspondiente a AM, CT, CF y E, en las aguas recolectadas en las playas seleccionadas, utilizando en la técnica modificada el 10% de agua de mar para formular los medios de cultivo. En las tabla 3 se observan los valores promedios de la carga bacteriana (UFC/100 mL) y sus respectivas desviaciones estándar, bajo condiciones definidas como “técnica estándar” y “técnica modificada”. Además, se incluye el promedio para cada grupo bacteriano en cada playa, la respectiva estimulación sobre la carga bacteriana y el cociente CT/CF. En ambos muestreos, se observó un incremento de la carga bacteriana en los grupos microbianos estudiados, cuando los medios de cultivo se suplementaron con agua de mar 10% v/v. El incremento en la carga bacteriana, en AM, CT y CF, expresada por la estimulación, se ubicó en el intervalo de 20-48, siendo los CF el grupo que mostró el mayor índice de estimulación, 47,8 y el grupo E el menor índice (2,4). En la tabla 3 se muestra que con la técnica estándar la proporción de CT/CF es mayor que 1, mientras que con la técnica modificada la proporción fue inferior a 1. El análisis estadístico Mann-Whitney reveló que en AM, CT y CF, las diferencias observadas en las cargas bacterianas, promedio y en los muestreos individuales, entre las dos técnicas fueron significativas, (p≤0,05). Aunque, para E las diferencias promedio no fueron estadísticamente significativas, el análisis individual de los muestreos I (2006) y II (2007) indicaron diferencias significativas en el muestreo I pero no en el II (datos no mostrados). Debe notarse que, de 16 comparaciones realizadas entre la técnica estándar y la modificada (tabla 3), en 12 de ellas (las correspondientes a AM, CT y CF), las diferencias entre las cargas bacterianas resultaron estadísticamente significativas. La excepción ocurrió en el grupo E. Un aspecto a resaltar es que los CT predominaron sobre los CF cuando se determinaron por la técnica estándar, pero la situación se invirtió con la técnica modificada. De acuerdo a la técnica estándar, las cargas bacterianas para CT y CF fueron 34,3 y 21,1 UFC/100 mL (CT/CF=1,62), respectivamente, mientras que en la técnica modificada tales valores fueron 770,7 y 1008,6 UFC/100 mL (CT/CF=0,76), respectivamente.

Cepas bacterianas identificadas en muestras de agua de mar: Las cepas bacterianas detectadas se pudieron ubicar en cuatro grupos de acuerdo a su presencia/ausencia en las muestras de agua evaluadas. En el primer grupo, Escherichia coli y Enterococcus faecalis se identificaron en ambos muestreos y en todas las playas. El segundo grupo, detectado en 3 de las 4 playas estudiadas, estuvo constituido por Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes y Pseudomonas aeruginosa. El tercer grupo, constituido por Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens y Vibrio alginolyticus, se detectó en 2 de las 4 playas. Finalmente, en el cuarto grupo y con una única presencia en las playas, se detectaron Serratia ficaria, Serratia odorifera, Enterococcus faecium, Klebsiella oxytoca, Klebsiella terrigenas, Comamonas sp, Chryseobacterium meningosepticum, Alcaligenes faecalis y Aeromonas sobria.

Discusión

Las características físicoquímicas determinadas en balnearios de Chichiriviche (tabla 1), cumplen con las especificaciones vigentes del Decreto 883 en términos de pH y oxígeno disuelto [27]. Esto indica que las aguas costaneras no contienen materiales que tiendan a modificar la acidez ni la cantidad de oxígeno de las ]]> tabla 2), obteniéndose valores de estimulación de 2,6, 1,3 y 13,7 para CT, CF y E respectivamente. La estimulación detectada podría implicar la recuperación de la capacidad de sustentar la ]]>