Saraí del Valle Acuña Ramíreza, Elia Sánchezb, Lorena Abadía-Patiñoa,*
a Instituto de Investigaciones en Biomedicina y Ciencias Aplicadas (IIBCA), Universidad de Oriente, Cumaná, estado Sucre. Venezuela.
b Hospital “Santos Aníbal Dominicci”, Carúpano, estado Sucre, Venezuela.
* Correspondencia: E-mail: labadia@udo.edu.ve
Resumen: Staphylococcus spp. figura entre las bacterias patógenas más importantes para el ser humano. La caracterización molecular de cepas de Staphylococcus meticilino resistentes (SMR) es necesaria para conocer qué tipo de complejo cromosómico estafilocócico que transporta el complejo mec (SCCmec) circula en una región. Se estudiaron 21 cepas de S. aureus y 29 de Staphylococcus coagulasa negativa (SCN) aisladas en el Laboratorio de Bacteriología del HUAPA (enero a julio 2007) resistentes a meticilina. Se les realizó antibiograma, PCR múltiple y concentración mínima inhibitoria (CMI) a las cepas positivas para mecA. 19 cepas de S. aureus y 24 de SCN fueron resistentes a oxacilina, correlacionándose con la presencia del gen mecA principalmente en S. aureus; algunas discordancias fueron observadas en SCN. Solo se identificaron Staphylococcus SCCmec tipo I y IV. La caracterización del SCCmec permitió conocer el tipo de Staphylococcus circulante en el hospital, lo que hará posible monitorear cambios futuros en estas cepas.
Palabras clave: Staphylococcus, mecA, meticilina, SCCmec.
Typification of methicillin-resistance in Staphylococcus spp. strains isolated from University Hospital “Antonio Patricio de Alcalá” in Cumana, Sucre State, Venezuela
Abstract: Staphylococcus spp. figures as one of the most important bacteria for human beings. The molecular characterization of methicillin-resistant Sttaphylococcus strains (MRS) is necessary for knowing what type of staphylococcal chromosomic complex transporting the mec complex (SCCmec) circulates in a certain area. Twenty one methicillin–resistant S. aureus and 29 coagulase negative (CNS) Staphylococcus strains isolated at the Bacteriology Laboratory of the HUAPA were studied during the January-July 2007 period. The study included antibiogram, multiple PCR, and minimum inhibitory concentration (MIC) determination of the mecA positive strains; 19 S. aureus and 24 CNS strains were oxacilline resistant, correlated with the presence of the mec.A gene, mainly in S. aureus since some discordances were observed with the CNS strains. Only Staphylococcus SCCmec type I and II were identified. The SCCmec characterization identified the Staphylococcus type circulating in the hospital, possibilitating the monitoring of future changes of these strains.
Keywords: Staphylococcus, mec.A, methicillin, SCCmec.
]]> Recibido 3 de junio de 2013; aceptado 2 de diciembre de 2013Introducción
Staphylococcus aureus, denominado a menudo estafilococo dorado, es responsable de un gran número de infecciones en humanos tales como septicemia, endocarditis y neumonía, siendo la lesión característica, el absceso o exudado piógeno [1]. Los estafilococos coagulasa negativos (SCN), en general, son menos invasores; pero, actualmente, se les señala con más frecuencia, como patógenos oportunistas en pacientes inmunocomprometidos con graves infecciones nosocomiales [2].
Poco después de la introducción de la penicilina en 1941, usada en la erradicación de las infecciones estafilocócicas, se reportó el aislamiento de una cepa resistente por producción de betalactamasas [3]. En 1959 apareció la meticilina, y en 1961 fueron reportadas las primeras cepas de S. aureus resistentes a este antibiótico (SAMR) [4], convirtiéndolo en resistente a todos los betalactámicos, creando un problema clínico importante por las pocas opciones terapéuticas [5].
La resistencia adquirida a meticilina en S. aureus depende de una proteína específica de membrana denominada PBP2a o PBP2’, la cual tiene afinidad reducida por los betalactámicos y es diferente a la PBP2. Dicha resistencia está codificada por el gen mecA, el cual está ubicado en un elemento exógeno de ADN, insertado en el cromosoma de S. aureus [6].
El complejo cromosómico estafilocócico (SCC) es un elemento genético móvil que transporta el complejo mec, constituido por los genes mecA y los genes regulatorios mecR1 y mecI, además del complejo ccr, formado por los genes ccrA y ccrB (SCCmec). Han sido descritos once tipos de SCCmec, del I al XI, de acuerdo al complejo mec y al complejo ccr presente. El SCCmec tipo I corresponde al complejo mecA clase B y al complejo ccr tipo 1; el SCCmec tipo II complejo mec clase A y al complejo ccr tipo 2; el SCCmec tipo III al complejo mec clase A y al complejo ccr tipo 3; el SCCmec tipo IV al complejo mec clase B y al complejo ccr tipo 2 [7, 8]; el SCCmec tipo V correspondiente al complejo mec clase C2 y al complejo ccr tipo 5, que en lugar de tener los genes ccrA y ccrB lleva una copia de un gen homólogo, ccrC [9]; el tipo VI es similar al tipo IV pero con un nuevo tipo ccrAB [10]; el tipo VII es análogo al tipo V, variando el complejo mec que es clase C1 [11]; el tipo VIII el cual pertenece al complejo mec clase A y el complejo ccr tipo 4 [12]. Tipos adicionales de SCCmec, mec y ccr no se han descrito en la literatura; son enumerados en el sitio web por el International Working Group on the Clasification of Staphylococcal Cassette Chromosome Elements [13]. Debido a la extensa diversidad genética que se ha observado en la organización de los elementos SCCmec, el IWG-SCC estableció criterios estándares para la clasificación de los mismos [14].
La caracterización molecular de cepas de SMR es necesaria para conocer el tipo de SCCmec que circula en una región, y para monitorear cambios futuros; debido a esto se realizó la caracterización molecular de cepas de SMR aislados en el Laboratorio de Bacteriología del Hospital Universitario “Antonio Patricio de Alcalá” (HUAPA) en Cumaná, estado Sucre.
Materiales y métodos
Recolección de cepas: Se recolectaron todas las cepas de SMR aisladas en el Laboratorio de Bacteriología del HUAPA, durante un período de siete meses (enero a julio de 2007).
Realización de antibiogramas: Los antibiogramas se llevaron a cabo por el método de Kirby-Bauer [15]. Los antibióticos utilizados fueron: oxacilina (1 µg) y cefoxitina (30 µg), colocados según las normas establecidas por el Manual M2-A9 del Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI por sus siglas en inglés) [14]. La cepa control utilizada fue S. aureus ATCC 25923.
]]> Extracción de ADN: El ADN patrón se obtuvo extrayendo el ADN total de las cepas utilizando el Kit Wizard Genomic DNA Purification (Madison, WI, USA) Promega®.Identificación molecular del SCCmec en cepas SMR: Los oligonucleótidos utilizados y las condiciones de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) para la amplificación del gen mecA, así como los diferentes loci fueron establecidas según metodología conocida [8]. Se utilizaron tres cepas controles meticilino resistentes: S. aureus 77906 (SAMR-heterorresistente), 77907 (SAMR-hospitalaria) y 77908 (SAMR-comunitaria), y un control negativo, S. aureus ATCC 25923. Las cepas 77906, 77907, 77908 fueron suministradas por el Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”como cepas multirresistentes. Las PCR se realizaron por triplicado.
Determinación de las concentraciones mínimas inhibitorias (CMI): Las CMI para oxacilina se determinaron de acuerdo a lo recomendado por el Manual del CLSI y la lectura fue interpretada bajo los criterios del M7-A7 del mismo manual [16], utilizando como cepas controles S. aureus 77906 (positivo) y S. aureus ATCC 29213 (negativo).
Resultados y discusión
En el Laboratorio de Bacteriología del HUAPA se aislaron 50 cepas de Staphylococcus presuntivamente meticilino resistentes durante un período de siete meses (enero a julio 2007): 21 S. aureus (21,8%) y 29 SCN (11,3%), de los cuales 19 cepas de S. aureus y 22 cepas de SCN resultaron meticilino resistentes. En las tablas 1 y 2 se detallan tanto los servicios como la procedencia de las cepas. Hubo predominio en muestras provenientes de Emergencia de Adultos, Ambulatorios y Medicina A. Con respecto al tipo de muestra de donde se aislaron las cepas de S. aureus, se observó correlación con otro estudio realizado en el país, donde la mayoría de estas muestras fueron obtenidas de secreciones, catéteres, exudados y esputo [17].
En el caso de los SCN, la mayoría de las cepas provenían de la de la Unidad Neonatal (UN), con escasos aislados en los demás servicios aunque con predominio de pediatría, coincidiendo con lo reportado tanto a nivel nacional como internacional, como los servicios donde es mas suceptible que ocurran infecciones por SCN, seguidos de las unidades de cuidados intensivos (UCI), y pacientes en diálisis o inmunocomprometidos [18]. La mayoría de las cepas de SCN provenían de hemocultivos.
Este trabajo fue realizado en el año 2007 siguiendo las normas establecidas por el Manual M2-A9 del CLSI [15], es por ello que se colocaron tanto el disco de oxacilina como el de cefoxitina; actualmente el manual M100-S23 del CLSI [19], establece que el disco de oxacilina no es confiable; sólo se debe utilizar el disco de cefoxitina e informarlo como oxacilina resistente o sensible. Se observó concordancia entre el fenotipo y el genotipo en la mayoría de las cepas de S. aureus, salvo en la cepa 1I6, que era meticilino resistente en el antibiograma y no amplificó el gen mecA (Tabla 1 y figura 1);a esta cepa se le realizó una comprobación fenotípica de producción de betalactamasa resultando positiva. Las cepas con falso positivo para la meticilino resistencia, pueden ser el resultado de una sobreproducción de penicilinasa, sobreexpresión o alteraciones de PBP constitutivas, ya que está demostrado que las penicilinas estables a penicilinasas se pueden ver alteradas cuando estas enzimas están presentes [20]. Las CMI para oxacilina en cepas S. aureus y SCN se muestran en las tablas 1 y 2, respectivamente.
En los SCN hubo 10 casos de discordancia en la detección de la meticilino resistencia; siete SCN resultaron negativos para el gen mecA y fenotípicamente fueron resistentes a oxacilina y cefoxitina en el antibiograma. La cepa 1E4 tuvo disociación entre los discos de oxacilina y cefoxitina resultando sensible a cefoxitina, distinto a lo que indica Dourado et al. [20], quienes reportaron la importancia del disco de cefoxitina para inducir la expresión del gen mecA en SCN. La mayoría de las cepas de S. aureus presentaron resistencia homogénea, excepto la cepa 1H1 que fue heterorresistente, mientras que en SCN hubo mayor número de cepas heterorresistentes, clasificadas de acuerdo a los resultados obtenidos en la CMI para oxacilina, según Tomasz et al. [21]. Las cepas 1E1, 1I7, 1J2 y 1G4, a pesar de poseer el gen mecA, mostraron CMI susceptibles, y fueron consideradas premeticilino resistentes; este fenómeno ha sido descrito sólo en cepas de S. aureus con transcripción fuertemente reprimida por los genes reguladores [22].
Los loci amplificados en las cepas de S. aureus aisladas fueron A y D, ubicándolas como SCCmec tipo I y tipo IV (Tabla 1 y figura 1).
En la caracterización molecular de cepas de S. aureus, las cepas 1D1, 1D2, 1D3, 1D6, 1D7, 1D8, 1G3, 1G6, 1G10, 1H1, 1H5 y 1H9 fueron SCCmec tipo I. La metodología utilizada no permite discriminar algunos subtipos; las cepas 1D5 y 1I5, presentaron loci A y D además del gen mecA, específicas de SCCmec tipo I, pero presentaron una banda extra, la cual corresponde al tamaño amplificado para el locus C, el gen regulador mecI. Estas cepas pudieran ser tipo I con una inserción del locus C y estar en presencia de un rearreglo del complejo mec clase A y B en estas cepas [23]. Estos casos fueron verificados por triplicado.
Las cepas 1D4 de S. aureus y 1I9, 1J1, 1H6, 1H7 y 1H8 de SCN presentaron locus A y gen mecA, pudiera tratarse de SCCmec tipo I con una deleción del locus D [8], siendo el locus A específico sólo de SCCmec tipo I. Estos casos igualmente fueron verificados por triplicado y repitiéndose los resultados por lo que se recomienda probar cada oligonucleótido por separado para así descartar que sea un problema de la PCR multiplex que no es reproducible en estas cepas.
Las cepas 1E4 y 1E5 de SCN no pudieron ser identrificadas con la PCR utilizada. La cepa 1E4 amplificó los loci A, F y G; el locus G se utiliza para distinguir la estructura variante IA. La deleción o incorporación de pUB110 ha sido reportado anteriormente [24]; el SCCmec tipo IA pudo haber evolucionado del tipo I o viceversa, lo que podría interpretarse como un SCCmec tipo IA con una delección del locus D y una inserción del locus F , respectivamente, infiriendo que se trata de una reorganización genética [23].
Las cepas 1G7, 1G9 y 1H2 de S. aureus amplificaron el locus D y el gen mecA, identificándose como SCCmec tipo IV, el cual es responsable de infecciones adquiridas en la comunidad; es un elemento pequeño que no lleva genes de resistencia asociadas al gen mecA [8].
Las cepas de S. aureus 1D9 y las de SCN 1E8 y 1E9 sólo poseen gen mecA; es necesario realizar PCR con otros oligonucleótidos distintos a los usados para verificar si amplifica para los nuevos tipos descritos de SCCmec, o si se trata de un tipo nuevo. Esto ha sido reportado previamente por Zhang [25], quien obtuvo 8 aislamientos que no amplificaron para ningún elemento SCCmec, pero si para el gen mecA. Tanto la cepa 1E10 como la 1I6 de S. aureus no amplificaron para el gen mecA, pero si amplificaron para el locus A. La cepa 1I6 amplificó el locus C, indicando que tiene parte del SCC, por lo tanto, no es resistente a los betalactámicos [6].
En el caso de los SCN amplificaron la mayoría de los loci excepto C y E, observándose predominio de A y D; una sola cepa (1E3) amplificó para el locus B. Se logró determinar el tipo de SCCmec sólo en 6 cepas de las 24 de SCN, con muchas inserciones y bandas desconocidas que se repitieron, como la banda de 220 pb que aparece en dos cepas (1D10, 1E4) y la banda de 260 pb en dos cepas (1E8, 1H10), mostrado en la tabla 2.
Existe una extensa diversidad en la organización genética de los SCCmec. El IWG-SCC recomienda que debe determinarse toda la secuencia de nucleótidos antes de la designación del tipo de SCCmec [13]; sería recomendable secuenciar las bandas desconocidas para saber a qué parte del elemento SCCmec corresponden. Igualmente, debería realizarse una PCR simple para probar cada oligonucleótido y así descartar que estas bandas desconocidas no amplificaron por una falla en la técnica de la PCR múltiple.
En los SCN se encontraron once aislamientos no tipificables: uno para el gen mecA y el locus A, cuatro tenían múltiples bandas, y dos solamente amplificaron para el gen mecA por el método empleado, como en el caso de las cepas de SCN 1E8 y 1E9. Dichos aislamientos no fueron clasificados por la PCR múltiple de Oliveira, por lo tanto se deben utilizar otras técnicas para identificar qué tipo de SCCmec existe en las cepas no identificadas en este trabajo [8].
]]> Adicionalmente, en los SCN hubo 16 cepas que amplificaron el locus A (Tabla 2) y sólo 5 pudieron ser clasificadas como SCCmec tipo I; las otras 11 cepas no pudieron serlo ya que las bandas amplificadas no correspondieron a tipos conocidos. La cepa 1E7 de SCN no presentó el gen mecA pero si amplificó para el locus A. Esto también ha sido reportado en S. hominis, en una cepa de Tokyo, en la cual se encontraron elementos SCC en su genoma, pero era una cepa meticilino sensible [6].No obstante, la presencia del locus A permite sugerir que son S. sciuri. El locus A corresponde a la región río abajo del gen pls. Este gen codifica a una gran proteína de superficie que media la agregación bacteriana y actúa como un factor de virulencia [26]. En la mayoría de los casos se reportan cepas SCCmec tipo I y tipo IV, quedando muchos SCN sin la determinación del tipo de SCCmec, por lo que se recomienda realizar una PCR que incluya otros oligonucleótidos.
El elemento SCCmec es un marcador epidemiológico crítico para SARM y esto ha contribuido a la elucidación del origen y la historia evolutiva a nivel mundial de los clones de SMR; sin embargo, no todas las cepas meticilino resistentes pueden ser tipificadas con los métodos disponibles por PCR, ya que existen todavía elementos SCCmec no identificados.
Conclusiones
Los discos de oxacilina y de cefoxitina fueron igualmente efectivos en la detección de resistencia a meticilina, al compararlo con la presencia del gen mecA en S. aureus pero no en los SCN.
En el HUAPA hay un predominio de cepas SARM SCCmec tipo I y IV.
Mediante la caracterización de SCCmec se logró conocer el tipo de Staphylococcus circulante en el Hospital.
Agradecimientos
A la Sociedad Venezolana de Infectología y al Vicerrectorado Administrativo de la Universidad de Oriente por la ayuda económica como parte de financiamiento para el proyecto realizado.
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