Centro de Biotecnología Aplicada, Departamento de Biología, Facultad Experimental de Ciencias y Tecnología,Universidad de Carabobo. Valencia, Venezuela.
Palabras clave: fermentación líquida, fermentación sólida, lodo papelero, Trichoderma reesei.
Production of cellulase enzymes and biomass of the fungus Trichoderma reesei using paper sludge as carbon source
Abstract: Paper production in Venezuela generates large amounts of cellulose fibers (paper sludge), producing environmental and storage problems. Finding uses for this papermaking sludge would decrease the problems caused. In this work the fungus Trichoderma reesei was used on submerged fermentation to study the effect of mineral salts, particle size and acid-alkali pretreatment of sludge on production of reducing sugars (RS) and cellulase activity. Solid fermentations were also conducted to obtain biomass (spores) of the fungus. The results indicated that the use of sanitized sludge, mineral salts and smaller particles, increased the production of reducing sugars (RS). The maximum cellulase activity, measured with carboxymethylcellulose, was RS 2.6 mg/L/h. Acid pretreatment was the best in rendering RS (17 mg/L) in comparison with alkali treatment (7.4 mg/L). It was also demonstrated that T. reesei can grow on paper sludge producing biomass (spores) with a yield of 1,24x108 spores/g of dry sludge. It is necessary to standardize and scale range these procedures in order to be able to use paper sludge to industrialize these processes.
Keywords: submerged fermentation, solid state fermentation, paper sludge, Trichoderma reesei.
El proceso de producción de papel genera una gran cantidad de residuos, siendo algunos de éstos los lodos papeleros, los cuales se componen básicamente de fibras de celulosa defectuosas, inservibles en el proceso de fabricación del papel, rellenos inorgánicos y metales pesados [1,2]. Las características físicoquímicas y mecánicas del lodo pueden generar riesgos de inestabilidad cuando se le dispone sobre zonas de ladera o en rellenos. Diariamente se producen alrededor de 200 toneladas de lodos por empresa papelera, siendo utilizados en compostaje, mezclas con arcillas para elaboración de ladrillos, bloques de concreto, absorbentes de aceites, base para alimento de animales, producción de etanol, entre otros [3,4]. Sin embargo, todos estos procesos no logran utilizar la cantidad total de lodo producido, por lo que se hace necesaria la implementación de otras alternativas para aprovechar este subproducto.
En la naturaleza existen microorganismos capaces de crecer a expensas de este tipo de sustratos, entre los cuales se encuentran bacterias y algunos hongos principalmente de los géneros Aspergillus, Penicillium y Trichoderma, todos con capacidad de producir enzimas celulolíticas [5,6]. El hongo Trichoderma reesei (teleomorfo Hypocrea jecorina, Ascomycetes), es un conocido productor de enzimas celulasas muy utilizado a escala industrial [7], por lo que pudiera tener un gran potencial para degradar el lodo papelero. Así, en esta investigación se buscó una aplicación biotecnológica para la utilización del lodo papelero tanto higiénico como no higiénico, usando el hongo T. reesei.
Materiales y métodos
Material biológico: Se utilizó la cepa TV219 de T. reesei, perteneciente al Centro de Biotecnología Aplicada, Departamento de Biología, Facultad Experimental de Ciencias y Tecnología, Universidad de Carabobo. La cepa fue aislada de muestras de suelo de plantaciones de maíz del estado Portuguesa, Venezuela, e identificada por metodologías moleculares [8]. El mantenimiento de la misma fue realizado por subcultivos en medio agar papa dextrosa (PDA, HiMedia).
Lodo papelero: Las muestras provenientes de una planta procesadora de papel del estado Carabobo, Venezuela, se utilizaron como sustrato para la fermentación del lodo papelero higiénico y no higiénico, bajo dos condiciones de cultivo distintas: sumergidos y sólidos.
Cultivos sumergidos: En cultivos sumergidos se estudió la producción de azúcares reductores (AR) al evaluar dos variables: efecto de sales minerales y disgregación de las partículas. Los lodos papeleros a una concentración final de 2% p/v se adicionaron individualmente a un medio salino propuesto por Okon et al [9] y constituido por: Mg2SO4 (7H2O) 0,2 g/L; K2HPO4 0,6 g/L; KCl 0,15 g/L; NH4NO3 1 g/L; FeSO4 (7H2O) 0,005 g/L; MnSO4 (7H2O) 0,006 g/L; ZnSO4 (7H2O) 0,004 g/L; CoCl2, 0,002 g/L. Se realizó un control utilizando agua destilada y lodo papelero. Para estudiar el efecto del tamaño de partícula del lodo, el mismo fue disgregado en la solución de sales minerales con una licuadora. Se evaluaron dos tratamientos: lodo intacto y disgregado. Los medios de cultivo (100 mL) fueron procesados en un esterilizador Yamato SM 300 a 121 ºC por 15 minutos y se inocularon con T. reseei a razón de 106 esporas/mL. Los tratamientos (1: sin sales, sin disgregar; 2: sin sales, disgregado; 3: con sales, sin disgregar; 4: con sales, disgregado) se incubaron a temperatura ambiente bajo agitación rotatoria constante a 90 rpm en un agitador orbital modelo Rotabit Marca PSelecta. Los AR fueron estimados por triplicado en el sobrenadante libre de células.
Pretratamientos del lodo papelero: Una vez evaluado el efecto de las sales minerales, tamaño de fibra y agitación sobre la producción de azúcares reductores, se procedió a realizar pretratamientos ácidos y alcalinos a los lodos papeleros para ser utilizados en cultivos sumergidos. El primer tratamiento consistió en adicionar a los lodos ácido sulfúrico (H2SO4) al 4% (1 g de lodo en 100 mL de ácido) por 1 hora a 105 ºC, mientras que en el segundo se trataron los lodos con el ácido a 60 ºC por 24 horas. El tratamiento alcalino se realizó incubando el lodo en NaOH 2M (1 g de lodo en 100 mL de álcali) a 105 ºC por una hora y a 60 ºC por 24 horas. Como grupos controles se usaron los lodos sin pretratamiento. Luego del tratamiento químico (ácido o alcalino) se ajustó el pH a 5,2 con NaOH 2M o ácido sulfúrico al 4%, según el caso. Finalmente, los lodos pretratados se incorporaron a la solución de sales minerales (1%), se esterilizaron e inocularon con esporas de T. reesei (106 esporas/mL).
Determinación de la actividad enzimática: En cada tratamiento se tomaron alícuotas de 400 µL del sobrenadante de las fermentaciones líquidas libre de células y de lodo (centrifugadas a 11.000 rpm por 10 minutos) y se mezclaron con 400 µL de carboximetilcelulosa al 4% y 100 µL de sales minerales, obteniendo un volumen de reacción de 900 µL. Se tomaron 450 µL para determinar inmediatamente los AR iniciales y el resto fue incubado por 24 horas a temperatura ambiente para determinar los AR finales. Se incluyó un tratamiento incubando el extracto enzimático en baño de agua hirviendo por diez minutos. La actividad enzimática fue reportada como la diferencia entre los AR finales e iníciales, en términos de mg de AR producidos/mL.h.
Determinación de azúcares reductores: Para la determinación de azúcares reductores se usó el método del ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNSA) [10]. Se tomaron 1,5 mL del sobrenadante de las distintas fermentaciones y se centrifugó por 10 minutos a 11.000 rpm en una centrifuga (marca PSelecta, modelo CENTROLIT II-BL). El sobrenadante libre de células fue dividido en tres fracciones de 400 µL a cada uno de los cuales se le agregó 100 µL de solución DNS (DNSA 1 g, tartrato de sodio 30 g, NaOH 2N 30 mL, en 100 mL de agua destilada). Las muestras fueron calentadas en baño de agua hirviendo durante 5 minutos y luego se dejaron reposar hasta alcanzar temperatura ambiente. Finalmente, se determinó la densidad óptica (DO) a 540 nm en un espectrofotómetro Spectronic™ GENESYS™ 2.0. Se realizó una curva de calibración a partir de una solución patrón de glucosa 0,5 g/L. Todas las determinaciones fueron hechas por triplicado.
Análisis estadístico: Los resultados obtenidos fueron procesados a través de un análisis de varianza (ANOVA) y comparación de medias (Tukey), para determinar diferencias significativas entre los tratamientos aplicados. Para aquellos datos que no cumplieran con los supuestos del análisis de varianza se utilizó una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis (K-W) para verificar diferencias significativas y la comparación de medias con la prueba de U – Mann-Whitney. Para esto se utilizó el programa Statistica v 6.0.
Resultados y discusión
Efecto de la presencia de sales minerales y tamaño de partícula sobre el crecimiento de T. reesei: Uno de los primeros pasos para la utilización del lodo papelero en procesos biotecnológicos usando a T. reesei es corroborar la factibilidad de producir AR por parte del microorganismo a expensas del lodo como única fuente de carbono y comparar si se puede utilizar tanto al lodo higiénico como no higiénico indistintamente para fines industriales. Esto permitiría manejar ambos materiales sin discriminación, lo cual disminuiría los costos de manejo y producción de derivados.
En la figura 1 puede apreciarse el estudio de algunas variables de la fermentación como el tamaño de partícula del lodo y presencia de sales minerales en el día cuatro del proceso. La mayor producción de AR se observó en el proceso con sales minerales y lodo higiénico disgregado con 3 ± 0,28 mg/L, encontrándose diferencias significativas en relación al resto de los tratamientos. De forma similar, los resultados con el lodo no higiénico bajo iguales tratamientos (Figura 1), indicaron que los mayores valores de AR se obtuvieron en el tratamiento con sales pero con lodo no disgregado (2,10 ± 0,28 mg/L), sin diferencias significativas con el tratamiento con sales disgregado (1,79 ± 0,28 mg/L). Así, los resultados sugieren que el lodo higiénico es la mejor fuente de carbono para obtener AR en comparación con el no higiénico, además de requerir del agregado de sales minerales para la fermentación.
Figura 1. Producción de AR en medio líquido con lodo higiénico o no higiénico como sustrato. Tratamientos: 1: sin sales, sin disgregar. 2: sin sales, disgregado. 3: con sales, sin disgregar. 4: con sales, disgregado.
Los lodos utilizados en el presente estudio se diferencian en su origen y en la composición de algunas sustancias. Las empresas productoras de papel han realizado estudios de la composición de los diferentes lodos, señalándose mayor presencia de metales pesados en el lodo no higiénico que en el higiénico. Este hecho podría explicar la menor actividad biológica en el lodo no higiénico, ya que los metales pesados se han reportado como compuestos capaces de afectar negativamente el crecimiento del género Trichoderma [11,12]. Por otro lado, en el caso del lodo no higiénico, se pudo apreciar a lo largo de este estudio la presencia de un olor característico, evidencia del crecimiento de microorganismos propios de aguas residuales. La presencia, crecimiento y productos del metabolismo de estos organismos, podría generar condiciones que no son óptimas para el desarrollo de T. reesei. Ésta es un área de estudio que queda por ser desarrollada.
El tamaño de partícula resulta fundamental para el desarrollo de la fermentación ya que está estrechamente relacionado con la accesibilidad del hongo al sustrato. Esta accesibilidad resulta crucial para la adherencia y posterior utilización del mismo. Así, mientras más accesible esté el sustrato, más fácil será para el hongo degradarlo. Al realizar las comparaciones entre cada uno de los tratamientos aplicados a los lodos, se puede observar que para el lodo higiénico mejora el rendimiento en AR al disgregar el material, mientras que para el no higiénico, no hubo diferencias cuando éste fue disgregado, en comparación con el sustrato original.
En algunas fermentaciones donde el sustrato principal es de forma particulada, como es el caso de este estudio, se pueden identificar dos grupos de factores que afectan el desarrollo de hongos filamentosos: (1) la macromorfología de las partículas (tamaño, forma, relación superficie-masa, porosidad, propiedades de adsorción, entre otros) y (2) la actividad de las enzimas involucradas en la hidrólisis de la macromolécula (pH, temperatura, humedad, entre otros). Todos estos factores afectan la velocidad a la cual los distintos compuestos asimilables se hacen disponibles. Si el sustrato debe estar disuelto para poder ser utilizado por el microorganismo, en la medida en que su solubilización se haga más rápida que su consumo su concentración en la fase acuosa del medio será saturante [13]; en cuyo caso la velocidad de consumo no dependerá de la macromorfología de las partículas o de la actividad enzimática, sino de la concentración celular [14,15]. Lo contrario sucede si la velocidad de solubilización del sustrato es menor que la velocidad de consumo del microorganismo; y la velocidad específica de crecimiento del microorganismo va a depender de los factores que afectan la accesibilidad y/o disponibilidad de nutrientes [16]. La mayor producción de azúcares reductores en los tratamientos disgregados en comparación con los no disgregados, está relacionada con los factores que afectan la accesibilidad del sustrato al hongo, evidenciado al disminuir el tamaño de partícula del lodo y aumentos en el rendimiento de AR.
Pretratamiento del lodo papelero: Con la finalidad de mejorar el rendimiento en AR se realizaron cuatro pretratamientos, para modificar ciertas características en el lodo que le permitieran al hongo aprovecharlo mejor. Los resultados obtenidos se describen en la figura 2. Durante los cuatro primeros días de medición los AR obtenidos no superaron los 2 mg/L (datos no mostrados), mientras que al sexto día de crecimiento se observaron los mayores rendimientos (17 mg/L). Los pretratamientos ácidos presentaron valores de AR entre 10 y 17 mg/L, mientras que los básicos nunca excedieron los 4 mg/L. Los análisis estadísticos arrojaron un valor de p < 0,05 lo que indica diferencias significativas entre los tratamientos. El aumento en AR del mejor pretratamiento (ácido, 60 ºC, 24 horas) fue de 8,7 veces, en comparación con el control sin pretratamiento.
Figura 2. Producción de AR, en medios con lodo higiénico pretratado. Tratamientos: 1: sin pretratamiento. 2: ácido a 105 ºC por 1 hora. 3: NaOH a 105 ºC por 1 hora. 4: ácido a 60 ºC por 24 horas. 5: NaOH a 60 ºC por 24 horas. Las letras distintas indican diferencias significativas.
Al lodo no higiénico se le aplicaron los mismos pretratamientos que fueron aplicados al lodo higiénico (datos no mostrados) siendo el mayor rendimiento de 7,49 mg/L de AR y un incremento en el rendimiento de 4,8 veces en comparación con el control, cuando se aplicó el tratamiento ácido a 60 ºC por 24 horas.
Al realizar un pretratamiento al material celulósico se busca, mediante la acción química de ácidos o bases, romper la estructura cristalina de la celulosa que puede dificultar la accesibilidad del microorganismo a esta última, permitiendo que el hongo la utilice [17]. En el caso de la madera, el pretratamiento ácido actúa principalmente hidrolizando a la hemicelulosa, dejando una estructura porosa formada principalmente por celulosa y lignina por separado [18], removiendo así la hemicelulosa de manera casi completa e incrementando el rendimiento de AR provenientes de la hidrólisis enzimática de la celulosa [19]. Por su parte, el tratamiento con sustancias alcalinas abre la estructura del material, incrementa el área interfacial y reduce el grado de polimerización y cristalinidad de la celulosa, favoreciendo su sacarificación enzimática [20]. En el caso de los pretratamientos ácidos usados, en ambos tipos de lodos, el tratamiento a 60 ºC por 24 horas mostró ser el más efectivo. Con respecto al lodo higiénico los resultados obtenidos son 60% superiores a los reportados en otro trabajo, que usaron desperdicios de papel hidrolizándolo con H2SO4 al 1,1% a una temperatura de 160 ºC por 10 minutos, además se usó Tween 80 como surfactante y T. reesei como microorganismo degradador. Estos investigadores obtuvieron rendimientos de 10 mg/L de AR;. sin embargo, los encontrados en el lodo no higiénico de este trabajo fueron 30% menores [21].
Los resultados obtenidos con los pretatamientos básicos fueron similares entre sí y a su vez al control, lo que indica que este pretratamiento no fue efectivo en la mejora de la accesibilidad del hongo al sustrato. En contraste con estos resultados, se ha usado aserrín pretratado con H2SO4 al 5% y NaOH al 3% como sustrato de la celulasa comercial Celluclast, reportando que el pretratamiento básico fue 3,5 veces superior al ácido en cuanto a AR obtenidos [18]. Los autores indicaron que la eficacia del pretratamiento depende del material a hidrolizar, así como de las condiciones del pretratamiento.
Otros autores han encontrado que la eliminación de las cenizas del lodo papelero y el fraccionamiento del mismo, pueden aumentar significativamente los rendimientos en AR [22,23]. Estos procedimientos serán evaluados próximamente en nuestro laboratorio.
Actividad celulasa: La actividad enzimática es otra de las variables a estudiar para verificar el posible aprovechamiento del lodo papelero, en este caso como inductor de enzimas celulasas en T. reesei. Si se logra inducir esta actividad en una cantidad suficiente, estaríamos frente a un sustrato muy económico que permitiría producir estas enzimas industrialmente a bajo costo. La figura 3 muestra las actividades enzimáticas producidas por T. reesei en medio con lodo higiénico disgregado o no y sales minerales. Las mayores actividades enzimáticas se obtuvieron con el lodo disgregado (2,64±0,04 mg de AR/L.h) en comparación con el tratamiento no disgregado (2,29±0,27 mg de AR/L/h). Los análisis estadísticos muestran que no existen diferencias significativas entre los tratamientos (p<0,05), determinándose que la condición para obtener la mayor actividad celulasa, es indistintamente la fermentación con lodo disgregado o sin disgregar. Estos resultados sugieren que las enzimas celulasas son inducidas de igual forma por el lodo disgregado o no. Las diferencias en la accesibilidad de cada tratamiento son las que determinarán el rendimiento final en AR. En la figura 3 también se muestran la actividad celulasa de muestras desnaturalizadas (tratamientos 2 y 4), las cuales siempre fueron menores a los tratamientos sin calentar.
Figura 3. Actividad celulasa producida por T. reesei en medios con lodo papelero como única fuente de carbono en el día 3 de la fermentación. Tratamientos, 1: disgregado. 2: disgregado enzimas desnaturalizadadas. 3: no disgregado. 4: no disgregado enzimas desnaturalizadas. Las letras distintas indican diferencias significativas.
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Varios autores han reportado actividades enzimáticas de Trichoderma spp., sobre diversos sustratos como arroz y trigo, de 9 mg de AR/L.h y de hasta 0,57 UI/Ml y sobre lodo papelero usando cultivos mixtos con Aspergillus niger y T. reesei, en el cual se obtuvo un rendimiento de 8 mg de AR/L.h [24-26]. Con estos resultados se verifica el potencial uso del pool enzimático de T. reesei para obtener AR a partir del lodo papelero.
En el presente trabajo no se caracterizó la microflora presente naturalmente en ambos lodos, por lo que para corroborar la hipótesis de presencia de sustancias u organismos inhibidores del crecimiento y actividad enzimática de T. reesei, es necesario determinar la cantidad y tipo de microorganismos presentes en el lodo, lo cual será tema de estudios posteriores en Centro de Biotecnología Aplicada de la Universidad de Carabobo.
Fermentación en estado sólido: Otra posible aplicación del lodo papelero, es la obtención de biomasa fúngica de T. reesei, específicamente esporas. Este tipo de biomasa (esporas) es la principal forma de aplicación de otras especies de Trichoderma en programas de manejo integrado de enfermedades en cultivos agrícolas. Para ello es necesaria la aplicación de fermentaciones en sustrato sólido, ya que en las líquidas, no existe producción de este tipo de estructuras reproductivas. La tabla 1, muestra los rendimientos obtenidos para cada tratamiento, donde se evaluó el contenido de agua en el medio de fermentación. Los mayores valores se obtuvieron en el tratamiento con 175 mL de sales minerales (1,24 x 108 esporas /g de lodo seco).
Tabla 1. Biomasa (esporas) de T. reesei producida en fermentaciones en estado sólido en medios con lodo higiénico como única fuente de carbono y diferentes contenidos de humedad.
En una fermentación en estado sólido, el sustrato debe tener la humedad suficiente como para permitir el crecimiento del microorganismo y que éste pueda llevar a cabo todos los procesos metabólicos, además debe servir como soporte para el crecimiento del microorganismo [27,28]. En este tipo de fermentaciones, el contenido de agua es fundamental, debido a que está íntimamente relacionada con la actividad acuosa en un sustrato determinado [29]. Los resultados demostraron que los mejores rendimientos se obtuvieron en el tratamiento con 175 mL de sales.
En otros trabajos, se ha reportado un rendimiento 8,44x109 esporas /g de sustrato usando T. koningii como organismo y cáscaras de arroz con salvado de trigo como sustrato [23]. Adicionalmente, en fermentaciones de T. harzarium sobre arroz como sustrato, se han obtenido rendimientos de 1,80x109 esporas/g [30]. Obviamente que los sustratos de estos trabajos no son comparables con el usado en nuestro estudio, en cuanto a la accesibilidad y disponibilidad de nutrientes, y en la composición de los polisacáridos que generalmente es almidón. La ventaja que posee el lodo papelero, es su bajo costo y alta disponibilidad. En todo caso, se deben estudiar las variables de producción para determinar la factibilidad económica de usar el lodo papelero, a pesar de los bajos rendimientos obtenidos. Probablemente, el bajo costo compense la menor producción en términos de rentabilidad. Adicionalmente se pueden estudiar otros factores, como pretratamientos, adición de otros subproductos, entre otros. Finalmente, la mezcla de lodo papelero fermentado con esporas de Trichoderma spp., pudiera utilizarse en la enmienda y control fitosanitario de suelos agrícolas.
Conclusiones y recomendaciones
T. reesei es un microorganismo capaz de degradar la celulosa que forma parte del lodo papelero tanto higiénico como no higiénico, dando como resultado azúcares reductores en fermentaciones sumergidas, aunque los rendimientos obtenidos bajo las condiciones de estudio, no son suficientes para utilizarlos a escala industrial en procesos como producción de bioetanol. Las condiciones para obtener los mayores rendimientos de AR son medios con sales minerales y lodo higiénico disgregado. Los pretratamientos ácidos ayudaron a incrementar el rendimiento en AR en fermentaciones sumergidas; estos podrían ser la clave para obtener los rendimientos necesarios para su uso a escala industrial. La actividad enzimática celulasa obtenida podría ser utilizada en la generación de productos comerciales, para lo cual es necesario estandarizar los parámetros de producción. Es posible obtener biomasa de T. reesei en fermentaciones sólidas a partir del lodo papelero higiénico, pudiéndose utilizar este sustrato a escala industrial.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer al Dr. Oscar Valbuena y al Prof. Carlos Moreno, por la revisión crítica de este trabajo; así como a la Lic. Esther Torquati por todo el apoyo logístico y técnico.
Referencias