Jane Torres-Chatia, Jorge León-Quispea,*, Gloria Tomas-Chotab
a Laboratorio de Ecología Microbiana, Facultad de Ciencias Biológicas. b Laboratorio de Productos Naturales, Facultad de Química e Ingeniería Química. Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú.
* Correspondencia: E-mail: jorgeleonq@yahoo.com
Resumen: En el presente trabajo se evaluó la actividad antimicrobiana de Luma chequen “arrayán” frente a cepas de referencia y patógenos bacterianos y levaduras aislados de hemocultivos de un centro hospitalario. Hojas de Luma chequen “arrayán”, fueron recolectadas, maceradas y obtenido extractos etanólico y acuoso para ser evaluados por su actividad antimicrobiana frente a cepas de referencia de laboratorio y patógenos bacterianos y levaduras aisladas de hemocultivos de un centro hospitalario. La actividad de los extractos se valoró mediante el método modificado de difusión en pocillos y la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) por microdilución. Se determinó que el extracto etanólico de la planta presentó mayor actividad inhibitoria frente a los patógenos, siendo los más sensibles Staphylococcus aureus, S. epidermidis y Klebsiella pneumoniae a una CMI de 3,125 mg/mL y Candida tropicalis y C. parapsilosis a una CMI de 1,56 mg/mL. Se concluyó que Luma chequen, una planta etnomedicinal nativa del sur del Perú, posee componentes bioactivos que inhiben a patógenos humanos causantes de bacteremias y fungemias.
Palabras clave: medicina tradicional, fitoterapia, extractos vegetales, Luma chequen, actividad antimicrobiana, arrayán.
Antibacterial and antifungal activity from leaf extracts of Luma chequen (Molina) A. Gray “myrtle” against pathogens of clinical origin
Abstract: In the present work we evaluated the antimicrobial activity of Luma chequen “myrtle” against reference strains, bacterial pathogens and yeasts isolated from blood cultures of a hospital facility. Luma leaves were harvested, macerated and obtained ethanol and aqueous extracts to be evaluated for their antimicrobial activity against laboratory of reference strains, bacterial pathogens and yeasts isolated from blood cultures of a hospital laboratory. The activity of the extracts was assessed by the modified method of diffusion in wells and determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) by microdilution. It was determined that the ethanol extract of the plant presented greater inhibitory activity against the pathogens, being the most sensitive Staphylococcus aureus, S. epidermidis and Klebsiella pneumoniae at the MIC of 3.125 mg / mL and for Candida tropicalis and C. parapsilosis with a MIC of 1.56 mg / mL. It was concluded that Luma chequen, an ethnomedicinal plant native from Southern Peru, has bioactive components that inhibit human pathogens causing bacteremias and fungemias.
Keywords: traditional medicine, phytotherapy, plant extracts, Luma chequen, antimicrobial activity, myrtle.
Recibido 1 de noviembre de 2016; aceptado 23 de marzo de 2017
]]> IntroducciónA lo largo de la historia, los metabolitos de las plantas han sido utilizados por la humanidad, convirtiéndose en una fuente inagotable de compuestos químicos y complejas sustancias activas, que desde hace muchos años han sido explotadas por el hombre [1]. En los últimos años el uso de productos naturales con fines terapéuticos ha sido cada vez más frecuente, llegando a alcanzar hasta aproximadamente el 80% de la población en los países en vías de desarrollo [2]. Hoy en día los organismos mundiales, encargados de velar por la salud humana, recomiendan y promueven el uso de productos naturales con fines medicinales, en el marco de terapias tradicionales y alternativas cuando éstas han demostrado su utilidad y representan un riesgo mínimo [3].
En Perú, como en otros países, las plantas medicinales representan la principal herramienta terapéutica de uso tradicional [4]. Desde la antigüedad la medicina tradicional ha desempeñado un rol importante aliviando las enfermedades y el dolor. Actualmente existe un gran interés por el mejor conocimiento y uso de medicinas alternativas, entre las que destaca la medicina natural [5]. El uso de plantas medicinales muchas veces se realiza en forma empírica y basada solo en la tradición; sin embargo, a la fecha los estudios de fitoterapia son cada vez mayores, permitiendo tener una base científica sólida, por lo que va tomando mayor importancia la búsqueda de nuevas fuentes vegetales de metabolitos con actividad citotóxica, anti-inflamatoria, antitumoral, analgésica, antimalárica, antibacteriana y antifúngica entre otras [6-8]. En la medicina tradicional peruana se dispone de variados agentes antimicrobianos obtenidos de plantas que se han probado tanto in vitro como in vivo con buenos resultados [7].
Según el informe de la Organización Mundial de la Salud (OMS) en el tema de la salud pública hay una preocupación global por la aparición de nuevos mecanismos de resistencia de los patógenos a los antimicrobianos convencionales; muchos medicamentos disponibles actualmente se vuelven ineficaces en la prevención y tratamiento de las infecciones, debido principalmente a la aparición cada vez mayor de patógenos oportunistas multirresistentes [9]. Por otra parte, las posibilidades terapéuticas se ven notablemente menguadas por falta de nuevos medicamentos que actúen frente a diversos patógenos, y a pesar de la disponibilidad de fármacos para el tratamiento de estas infecciones, se presentan otros problemas como la restricción en el espectro de acción, costo y efectos adversos en el paciente (hepatotoxicidad, nefrotoxicidad, fototoxicidad) [10,11]. Debido a estas razones los esfuerzos se orientan a la búsqueda de nuevos agentes antimicrobianos que superen dichas limitaciones.
Luma chequen (Molina) A. Gray “arrayán” es una planta arborescente de 5 a 6 m de altura y aproximadamente 5 m de cobertura, que crece desde los 2.500 a los 4.000 m de altitud en los Andes de Sudamérica central entre Perú, Bolivia y Chile. Su población se ve favorecida en lugares de alta humedad a orillas de los ríos y de los suelos profundos y arenosos. La información etnofarmacológica de esta planta refiere múltiples usos en la medicina popular, resaltando su acción antidiarreica, antiinflamatoria, antiséptica, antimicótica, astringente, expectorante, entre otras [12,13]. Asimismo, se reporta el uso de su follaje como aromatizante y saborizante en la cocina [14].
En el presente trabajo se evaluó la actividad antimicrobiana de Luma chequen “arrayán” frente a patógenos aislados de hemocultivos de un Hospital de Nivel IV, Essalud, Lima, Perú.
Materiales y métodos
Material vegetal: Hojas de “arrayán” fueron recolectadas en febrero del 2014 de plantaciones del distrito de Huaccana, Andahuaylas, Apurímac, ubicada a 3.078 m de altitud. Se identificaron en el Departamento Académico de Botánica, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Las hojas seleccionadas, limpiadas y pesadas fueron desecadas bajo sombra por 3 días y luego en una estufa a 40 °C por 48 h. El material fue molido hasta obtener la muestra en polvo y luego guardado en frasco oscuro en un lugar fresco y seco hasta su uso posterior.
Microorganismos: Se utilizaron como testigos de actividad antimicrobiana patógenos aislados de hemocultivos del Servicio de Microbiología de un hospital de Nivel IV, Essalud, Lima, Perú, identificados por técnicas convencionales: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus epidermidis, S. aureus, Candida albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis. La utilización de estas cepas contó con la autorización del jefe del Servicio de Microbiología del Hospital Nacional Guillermo Almenara Irigoyen, y se siguieron las normas expuestas en la Declaración de Helsinki, respetado la confidencialidad del paciente. Otros testigos fueron E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 25923, C. albicans ATCC 90028 y C. tropicalis ATCC 750 de la colección del Laboratorio de Ecología Microbiana, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos.
Obtención del extracto etanólico: Se realizó siguiendo las recomendaciones de León y col. [15]. El material pulverizado (200 g) se colocó en un frasco oscuro con 500 mL de etanol (Merck) y luego fue sellado herméticamente. Se dejó reposar durante 7 días, con agitación de tres veces por día. Luego de transcurrido el tiempo, la muestra se filtró mediante papel Whatman N° 1 (Whatman International LTD, England), obteniéndose el extracto crudo. El filtrado fue secado en un rotavapor a 40 ºC y 110 milibares de presión y conservado a 4 °C hasta su uso.
]]> Obtención del extracto acuoso: El material pulverizado (20 g) fue tratado con 100 mL de agua destilada a 75 ºC durante 5 min. Se dejó reposar por 7 días y luego se filtró con papel Whatman N° 1 (Whatman International LTD, England), obteniéndose de esta manera el filtrado libre de residuos; fue secado a 40 ºC y conservado en frasco oscuro a 4 °C hasta su uso.Ensayos de actividad antibacteriana y antifúngica: Las pruebas de actividad antimicrobiana se realizaron según la metodología de León et al. y Huamani y Ruíz [15,16]. Se evaluó la capacidad de los extractos para inhibir el crecimiento de microorganismos a través de pruebas de sensibilidad antimicrobiana. El extracto seco se diluyó en dimetilsulfóxido (DMSO) al 5% (p/v) obteniendo una concentración de 100 mg/mL; luego fue filtrado a través de membranas (Millipore 0,22 μm). Para evaluar la actividad antimicrobiana se utilizó el método modificado de difusión en pocillos en agar Müeller Hinton para bacterias y agar Müeller Hinton con 2% de glucosa para las levaduras. Cada testigo fue adicionado al medio a escala 0,5 de MacFarland. Los pocillos (6 mm de diámetro) se prepararon con ayuda de un sacabocado estéril, donde se depositó el extracto con carga final de 5 mg/pocillo. Luego de una incubación a 37 ºC por 24 h se realizó la lectura de los halos de inhibición. Las pruebas se realizaron por triplicado. Se utilizó como control positivo gentamicina (80 mg/mL) para bacterias y fluconazol (0,2 mg/mL) para levaduras, siendo DMSO al 5% el control negativo. Para la medida de los halos de inhibición (mm) se empleó un vernier.
Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI): Se realizó siguiendo la metodología según León y col. mediante diluciones en microplacas de 96 pocillos [15]. Se utilizó solo el extracto etanólico resuspendido en DMSO al 5% para obtener una solución stock (50 mg/mL). A partir de esta solución se realizaron 8 diluciones 1:2 hasta 0,39 mg/mL. En cada pocillo se colocaron caldo tripticasa soya (80 μL), extracto etanólico (10 μL) en concentraciones decrecientes e inóculo de los patógenos (10 μL). Las microplacas se incubaron a 37 °C por 18-24 h. Para la lectura se adicionó 40 μL de cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC; 5 mg/mL) en cada pocillo y se incubó a 37 °C por 20 min. En todos los ensayos se contaron con los controles correspondientes. Las lecturas se realizaron por el viraje del medio a rojo intenso (crecimiento microbiano). Las pruebas se hicieron por triplicado.
Análisis estadístico: Para evaluar el efecto de los factores (variables independientes) que presentó el estudio sobre la variable dependiente cuantitativa (diámetro del halo de inhibición en mm) se utilizó el modelo factorial de Análisis de Varianza (ANOVA) y la prueba de Tukey, considerándose diferencias estadísticas significativas cuando p fue menor que 0,05. Para el análisis se utilizó el programa estadístico Windows SPSS versión 20.0 (2012).
Resultados
La actividad antimicrobiana de los extractos frente a los patógenos probados se observa en la tabla 1. En general, el extracto etanólico tuvo mayor rendimiento en comparación al extracto acuoso, tanto frente a bacterias como levaduras. S. aureus ATCC 25923 (cepa estándar) (Figura 1A) y E. coli (de origen hospitalario) resultaron ser los más sensibles (29 y 26 mm de diámetro de halo de inhibición respectivamente). Asimismo, la actividad frente a C. albicans fue muy notable (Figura 1B); en tanto, frente a S. aureus, S. epidermidis y K. pneumoniae, la actividad fue moderada. El extracto acuoso, bajo las mismas condiciones logró generar halos de inhibición de menor tamaño frente a S. aureus ATCC 25923 (Figura 1C) y K. pnemoniae (Figura 1D).
La media del diámetro del halo de inhibición indicó que el halo del extracto etanólico se encontró inclusive por encima del control gentamicina (Figura 2A) y muy cerca al de fluconazol (Figura 2B), no así el halo del extracto acuoso. La figura 3 muestra los valores medios de la actividad del extracto etanólico frente a los patógenos, donde se nota mayor actividad inhibitoria tanto de bacterias como de levaduras. La media del halo de inhibición según el tipo de extracto señaló que el etanólico generó 19 mm de halo de inhibición, mientras el acuoso tan solo 7 mm (Figura 2). C. albicans ATCC 90028 presentó mayor sensibilidad frente a ambos extractos, con una media de 20 mm de diámetro de halo de inhibición (Figura 3).
Los resultados del ensayo de la CMI del extracto etanólico de Luma chequen pueden observarse en la tabla 2, donde se indican los valores cuantitativos de su actividad antibacteriana y su actividad antifúngica. En general, los valores obtenidos fueron homogéneos frente a los microorganismos en prueba, con relativa mayor actividad frente a las cepas de origen hospitalario, en especial C. tropicalis y C. parapsilosis.
Discusión
Existen varias especies de la familia Myrtaceae que reciben el nombre de “arrayán” (Ecuador, Chile, Colombia, Bolivia y Venezuela); sin embargo, se trata de especies diferentes a Luma chequen “arrayán” de origen peruano. Los casos descritos fuera de Perú señalan que todas presentan actividad antimicrobiana [17-22], sin embargo, respecto al “arrayán” peruano hay escasas referencias de estudios de este tipo. Se describe la actividad antibacteriana del aceite esencial de Luma chequen frente a Streptococcus mutans, un patógeno de importancia odontológica, señalando que con concentraciones de 10, 50 y 100% de este aceite se generaron halos de inhibición promedio de 6,28; 7,88 y 8,66 mm respectivamente [23]. En el presente trabajo se evaluó la actividad de extractos acuoso y etanólico frente a patógenos causantes de bacteriemias, resultando ambos activos contra el género Staphylococcus, pero la mayor actividad se obtuvo con el etanólico.
Esta actividad estaría vinculada a la polaridad del solvente en la captación de los metabolitos activos con acción directa sobre la pared celular de los patógenos. El etanol tiende a arrastrar mayor cantidad de compuestos polares como fenoles, taninos, flavonoides y otros metabolitos [24]. Se ha reportado que estos compuestos poseen actividad antimicrobiana, debido a que inhiben la formación de la pared celular y la síntesis de ADN o ARN [25]. En el caso del género Candida probablemente inhiban la biosíntesis de ergosterol o de otros esteroles presentes en la pared celular de estas levaduras [26].
Goncalves et al. [22] reportaron la actividad antimicrobiana de extractos etanólicos del aceite esencial de L. chequen frente a E. coli ATCC 25922, S. aureus 25923 y C. albicans, cuyos resultados fueron similares a los del presente estudio; sin embargo la procedencia de los vegetales fue distinta al caso peruano. La familia Myrtaceae, a la cual pertenece L. chequen, es conocida por su amplia actividad antimicrobiana. Autores como Maldonado [17], Lizcano y Vergara [18] señalaron la actividad inhibitoria del aceite esencial de otras especies de esta familia como Myrcianthes rhopaloides “arrayán” frente a E. coli, S. aureus y C. albicans, con resultados concordantes con este trabajo. Gómez reportó que el extracto etanólico de Myrcianthes hallii “arrayán” posee actividad inhibitoria frente a K. pneumoniae y C. albicans [19]. Bodero concluyó que los extractos fluidos contienen principios activos implicados en la actividad frente a S. aureus y E. coli [27]. En el presente estudio se ratifica que los extractos etanólicos de L. chequen presentan mayor actividad frente a estos patógenos tanto grampositivos como gramnegativos, indicando que contienen compuestos de amplio espectro de acción.
Con respecto a la CMI de los extractos de L. chequen, el presente estudio es el primer reporte en nuestro medio. La CMI frente a Staphylococcus se encontró entre 6,25 y 3,125 mg/mL y frente a Candida fue de 1,56 mg/ mL. De otros géneros de “arrayán” existen varios reportes, como el caso del género Psidium frente a Staphylococcus, con resultados similares al presente estudio [21,28]. Otros autores han reportado la CMI entre 16 y 512 μg/mL frente a Candida [20], así como de 100 μg/mL para Psidium guajava frente a C. albicans [28]. Carhuapoma [13], señala que L. chequen es una planta rica en compuestos como flavonoides (quercetina, rutina y quercetin-3-metil éter), taninos, triterpenos y esteroides, leucoantocianidinas, catequinas, fenoles libres y aceites esenciales (1,8-cineol, mirtol). El mismo autor señala que el flavonoide quercetina sería el responsable de la acción antimicrobiana [29].
Conclusiones
Luma chequen “arrayán” posee componentes activos con amplio espectro de acción antimicrobiana, lo cual contribuye al fortalecimiento y credibilidad de los conocimientos ancestrales que se tienen sobre esta planta medicinal; sin embargo, para validar estos hallazgos se deben realizar estudios referidos a la identificación y elucidación de sus compuestos bioactivos.
]]> AgradecimientosLos autores agradecen al Vicerrectorado de Investigación - UNMSM por el apoyo parcial en el desarrollo del presente estudio (Proyecto CON 2014, código: 141001291). Asimismo, agradecen el apoyo del Laboratorio de Ecología Microbiana, Facultad de Ciencias Biológicas, UNMSM – Lima – Perú.
Conflictos de Interés
Los autores declaran no tener conflictos de interés en la publicación del presente artículo.
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