Iris Pérez-Almeida¹, Luis Angulo Graterol¹, Gustavo Osorio¹, Catalina Ramis², Ángela María Bedoya², Rosana Figueroa-Ruiz³, Sandy Molina⁴ y Diógenes Infante⁴ 

¹ Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas, CENIAP. Apdo. 4653. Maracay. Venezuela. email: iperez@inia.gob.ve

² Centro Investigaciones Biotecnología Agrícola, Facultad de Agronomía, Universidad Central de Venezuela. Apdo.  4579. Maracay. Venezuela.

³ Facultad de Agronomía, Universidad Central de Venezuela. Maracay. Venezuela.

⁴ Centro Nacional de Biotecnología Agrícola, Fundación Instituto de Estudios Avanzados (IDEA). Caracas. Venezuela.

RESUMEN

Dado que la eficacia de los distintos protocolos existentes para aislar ADN en cantidad y calidad suficiente puede diferir según el cultivo, es necesario estandarizar los métodos de extracción para garantizar su sencillez y efectividad. En este trabajo se propone una modificación al método de Risterucci et al. (2000) el cual fue comparado con otros protocolos para la extracción de ADN de hojas de Cattleya spp. con el fin de seleccionar el método más apropiado a usar en el análisis del potencial genético de estas especies a través de marcadores moleculares como RAPD e ISTR. Con el método propuesto se obtuvo ADN similar al obtenido utilizando un kit comercial, ya que ambas metodologías produjeron ADN en apropiada cantidad y calidad. El método ofrece ventajas sobre otros protocolos, principalmente debido al reducido número de pasos para la obtención del ADN, facilidad de ejecución y, en especial, su alta estabilidad, lo cual le favorece en aquellos casos en que se requiera procesar muchas muestras simultáneamente, minimizando las posibilidades de contaminación accidental.

Palabras clave adicionales: Diversidad genética, ISTR, RAPD

Modified method to obtain genomic DNA from orchids (Cattleya spp.) for amplification with molecular markers

Since the effectiveness of the different protocols for isolating DNA in sufficient quantity and quality may vary depending on the crop, it is necessary to standardize the extraction methods to ensure its simplicity and effectiveness. In this paper we propose a modification to the method of Risterucci et al. (2000), which was compared with other protocols to extract DNA from leaves of Cattleya spp. to select the most appropriate method to use for analyzing the genetic potential of the species through molecular markers such as RAPD and ISTR. With the proposed method the obtained DNA was similar to that extracted using a commercial kit, since both methods produced DNA in appropriate quantity and quality. The method offers advantages over other protocols, mainly because the low number of steps for obtaining DNA, ease of implementation and especially, high stability, which is favorable in cases where it is required to process many samples, reducing the possibility of accidental contamination.

Additional key words: Genetic diversity, ISTR, RAPD

Recibido: Mayo 17, 2010 Aceptado: Diciembre 17, 2010

INTRODUCCIÓN 

El género Cattleya tiene una distribución neotropical que abarca desde México, América Central, Brasil, Venezuela, hasta Perú (Foldats, 1970). Venezuela, Colombia y Brasil se han caracterizado por poseer el mayor número de orquídeas silvestres (Yanes, 1959). Existe una gran diversidad dentro de las orquídeas a nivel tanto reproductivo como vegetativo, además de su variación en tamaño y color. Tal situación dificulta el trabajo de identificación y descripción de las mismas, para lo cual es importante contar con herramientas más precisas que permitan establecer con certeza una jerarquía de categorías donde pueda registrarse fácilmente la información de las especies, considerando a la especie como la única unidad tangible en la naturaleza que tiene la capacidad para mutar y por ende a evolucionar (Dunsterville y Garay, 1966).

El uso de marcadores moleculares permite estudiar y analizar el potencial genético de una población, con mayor precisión. De este modo se puede determinar la diversidad genética, necesaria

para estudiar prácticas de manejo y conservación, incluso de las especies en riesgo de extinción. Sin embargo, la viabilidad de estos estudios es limitada por la dificultad de aislar ADN, en cantidad calidad suficiente, desde pequeñas muestras de tejido (Aranishi, 2006). Es necesario estandarizar los métodos de extracción de ADN utilizados en Cattleya spp. y garantizar su sencillez y eficacia. Además se deben establecer los métodos apropiados de muestreo, tipo de tejido a utilizar y protocolos viables de extracción del ADN (Lopera-Barrero et al., 2008).

Uno de los principales inconvenientes técnicos en el aislamiento y purificación del ADN vegetal es la obtención simultánea de fenoles, polisacáridos, otros productos secundarios, así como la poca cantidad y calidad del ADN obtenido (Molinari y Crochemore, 2001). Entre los protocolos de extracción del ADN más utilizados en diferentes especies se destaca el descrito por Dellaporta et al. (1983). Generalmente se realizan algunas modificaciones en la composición del tampón de extracción, integrando un agente para estabilizar el pH  a 8; una sal para disociar las proteínas; un detergente para solubilizar las membranas e inactivar la acción de algunas enzimas, y un inhibidor de la ADNasa para proteger el ADN (Bered, 1998). Los componentes más frecuentes para la degradación y rompimiento de las membranas celulares son dodecil sulfato de sodio (SDS) (Dellaporta et al., 1983); bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) (Doyle y Doyle, 1991); o sacarosa (Cheung et al., 1993).  Sin embargo, variaciones en la eficiencia de lisis, el rendimiento y la pureza del ADN pueden afectar los resultados de técnicas moleculares, como la PCR (Fraga et al., 2004). En orquídeas se encuentran reportados algunos métodos de extracción, como el de Benner et al. (1995), el cual utiliza fenol.

Otro método que se emplea en la extracción de ADN es el desarrollado por Risterucci et al. (2000), el cual es un procedimiento robusto utilizado en especies arbóreas, y ha sido probado con éxito en plantas con tejido foliar coriáceo y suculento, como el de las orquídeas (Pardo et al., 2008). Por su parte, Zambrano et al. (2002) obtuvieron ADN de Saccharum spp, Musa sp y Manihot esculenta mediante un protocolo económico y rápido que fue validado a través de su amplificación mediante RAPD.

El empleo de técnicas moleculares precisa de un método de extracción de ADN genómico lo más estandarizado posible, con el cual se obtenga un ADN puro, no degradado, libre de ARN y de inhibidores de la PCR (Fraga et al., 2004).

El presente estudio fue planteado con el objetivo de encontrar un método simple, reproducible, rápido y económico para la obtención de ADN en orquídeas (Cattleya spp.) destinado a estudios con marcadores moleculares, tales como RAPD e ISTR. Para ello se compararon cuatro protocolos de extracción en muestras de hojas de esta planta.

MATERIALES Y MÉTODOS

El material vegetal consistió en tejido foliar joven sin daños mecánicos y libre de enfermedades de dos especies de orquídeas: Cattleya violacea y Cattleya mossiae. Las muestras fueron colectadas en vivero en San Cristóbal, estado Táchira y El Hatillo, estado Miranda, y transportadas a bajas temperaturas hasta el Laboratorio de Genética Molecular del Centro de Investigaciones de Biotecnología Agrícola (CIBA), Facultad de Agronomía, Universidad Central de Venezuela. En todos los casos, el tejido foliar (0,2-0,5 g) fue pulverizado con nitrógeno líquido.

Para comparar la efectividad de obtención de ADN genómico se utilizaron cuatro (4) protocolos reportados en la literatura: Dellaporta et al. (1983) modificado en el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT, 1995), el Kit Wizard Genomic DNA de la casa comercial Promega (1998), Risterucci et al. (2000) modificado en este trabajo, y Zambrano et al. (2002). No se consideró utilizar el protocolo propuesto por Benner et al. (1995), el cual utiliza fenol, debido a las características nocivas de este reactivo.

A continuación se  describen  los pasos seguidos en cada protocolo.

I. Dellaporta et al. (1983) modificado en el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT, 1995)

El tejido macerado se colocó en tubos de microcentrífuga (1,5 mL), agregando 1 mL de tampón. Se incubaron los tubos a 65 ºC por 45 minutos con agitación. Se agregó 0,4 mL de acetato de potasio incubando en hielo por 30 min. Se centrifugó a 8.000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se transfirió el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo. Se  agregó  un  volumen  igual  de  isopropanol frío (-20 ºC) y 1/10 del volumen de acetato de sodio (3M, pH 5,2). Los tubos fueron incubados a  -20 ºC por 1 h. Se centrifugó y se descartó el sobrenadante. Se lavó el precipitado con 400 μL de etanol al 70 % frío y se dejó secar bien. Fue resuspendido en 75 μL de tampón TE. Se le agregó 1 μL de ARNasa incubando por 30 minutos a 37 ºC.

II. Kit Wizard Genomic DNA de la casa comercial Promega (1998)

El tejido vegetal macerado fue colocado en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Se agregó a cada tubo la solución de lisis nuclear (NLS) y se aplicó vortex 1-3 s. Se incubaron a 65 ºC durante 15 min. Se agregó la  solución de ARNasa. Los tubos fueron incubados a 37 ºC por 15 min. Luego fueron colocados sobre hielo durante 5 min. Se agregó la solución de precipitación de proteínas (PPS). Se centrifugaron los tubos  a 14.000 rpm por 3 minutos. Se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL con isopropanol. Los tubos se centrifugaron a 14.000 rpm por 1 minutos. El sobrenadante  fue  descartado  y  se  agregó  etanol 70 %. Se centrifugó durante 1 minuto a 14.000 rpm. El precipitado  se dejó secar unos 30 min. Se agregaron 100 μL de solución de rehidratación del ADN (RS) y los tubos se colocaron una hora a 65 ºC, mezclando y agitando con frecuencia, para su almacenaje final a -20 ºC.

III. Risterucci et al. (2000) modificado en este trabajo

1. En tubos de 30 mL se colocaron 0,5 g del tejido macerado y se agregó 5 mL del tampón de extracción (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1,4M NaCl, 20 mM EDTA, 2 % CTAB, 1 % polietileno-glicol y 0,5 % de sulfito de sodio), precalentado a 74 ºC. Se aplicó vortex por 3 s (en el protocolo original se utilizan 75 ºC para el precalentamiento e incubación).

2. Los tubos fueron incubados a 74 ºC durante 20 min, se les aplicó vortex por 10 s y se dejaron enfriar a temperatura ambiente.

3. Se agregaron 5 mL de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) a cada tubo y se agitaron por inversión unas 50 veces, para ser centrifugados a 10.000 rpm durante 15 min.

4. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo con 5mL de isopropanol frío, agitando suavemente hasta observar la formación del pelet de ADN.

5. Los tubos fueron colocados un mínimo de 2 h a -20 ºC. Con la ayuda de una pipeta Pasteur moldeada se transfirió el pelet a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y se resuspendió entre 500 a 1.000 μL de TE (50 mM Tris-HCl, 0,7 M NaCl 10 mM EDTA).

A continuación se mencionan los siguientes pasos, los cuales constituyen modificaciones al protocolo de Risterucci et al. (2000) realizadas en este trabajo:

1. Al pelet resuspendido se le agregaron 500 μL de TE 1X y 50 μL de acetato de sodio 3M pH 5,2, para mezclar por inversión de los tubos.

3. El etanol fue descartado y se dejó secar el tubo a temperatura ambiente.

4. Se agregaron 100-500μL TE 1X para resuspender el ADN.

IV. Zambrano et al. (2002)

Se colocó el material vegetal pulverizado en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Luego se adicionó  el tampón de extracción  2X CTAB incubando a 65 ºC durante 30 minutos Se agregaron 300 μL de acetato de potasio (3M, pH 4,8), incubando sobre hielo por 15 min. Se centrifugaron 10 min a 14.000 rpm y se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo. Se adicionaron 500 μL de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1), centrifugando nuevamente. La fase superior se transfirió a otro tubo agregando igual volumen de isopropanol frío y se incubó en hielo por 60 minutos. El pelet de ADN fue lavado dos veces con etanol frío al 70 %, y se dejó secar a temperatura ambiente por  30  min.  Finalmente  se  resuspendió  el ADN en 75 μL de tampón TE para ser almacenado a -20 ºC.

Cuantificación del ADN obtenido

Se determinó la cantidad y calidad del ADN obtenido a partir de cada método de extracción, utilizando ADN del fago lambda no digerido como marcador estándar. Se corrieron las muestras en geles de agarosa al 1 %, por electroforesis horizontal a 70 V por 45 min,  en tampón TBE 0,5X (250 mM de Tris-HCl, 30 mM de ácido bórico y 42 mM de EDTA). Los geles se tiñeron con bromuro de etidio (0,5 μg·mL^-1), se visualizaron bajo luz UV en un transiluminador y se capturaron sus imágenes en un analizador de imágenes BIO-RAD Gel Doc XR. 

Adicionalmente la cantidad y calidad del ADN fue determinada midiendo la absorbancia en un espectrofotómetro Nano Drop ND-1000. Se verificó la estabilidad de la concentración de los ADN obtenidos y la relación A₂₆₀/A₂₈₀ nm, como índice de pureza, transcurrida una semana de la extracción, almacenados a -20 ºC. Además, se determinó el porcentaje de estabilidad de la concentración de las muestras, relacionando la concentración final de cada muestra entre la inicial. En cada uno de los métodos se utilizaron dos especies de Cattleya y dos repeticiones, para un total de 16 observaciones.

El ADN genómico obtenido con los cuatro métodos fue amplificado vía PCR utilizando los marcadores moleculares RAPD e ISTR. Las muestras del ADN se diluyeron a 20 ng·μL^-1 en tampón TE (10 mM de Tris-HCl a pH 8,0 y 1mM de EDTA). Luego se procedió a su validación a través de la amplificación con iniciadores aleatorios RAPD de la Unidad de Biotecnología Agrícola del Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias (CENIAP), Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA), y marcadores ISTR proporcionados por el Laboratorio de Biología Molecular del Centro Nacional de Biotecnología Agrícola de la Fundación Instituto de Estudios Avanzados (IDEA).

- RAPD. La mezcla de 15 μL de reacción PCR consistió en Tampón 1X, 2,5 mM MgCl₂, 0,17  mM  de  cada  uno  de  los  dNTP´s, 0,67 mg·mL^-1 BSA, 1,33 μM del cebador Operón (OPC-02  y  OPC-05),  0,16 U·μL^-1  Taq  y 20 ng·μL^-1 de ADN. La amplificación se realizó en un termociclador PTC 200 DNA Engine Cycler BIO-RAD, en las siguientes condiciones: desnaturalización inicial 94 ºC por 5 minutos, seguida por 45 ciclos de amplificación  a  94 ºC  por  1 minuto,  hibridación  a 36 ºC por 30 s y extensión 72 ºC por 2 minutos. Se realizó un ciclo final de extensión a 72 ºC por 7 minutos. La separación de los productos de RAPD-PCR se realizó en geles de agarosa 3 %, corridos durante 2,5 horas a 80 V y teñidos con bromuro de etidio. Los geles fueron visualizados bajo luz UV y fotografiados como ya se indicó.

Los resultados del ADN amplificado se presentan como imágenes de las corridas electroforéticas. Las concentraciones de ADN y pruebas de estabilidad se presentan en función de los promedios y su dispersión. Asimismo, los valores se analizaron estadísticamente, de acuerdo con un diseño completamente al azar empleando el programa estadístico SAS (Cary, NC); cuando el análisis de la varianza detectó diferencias significativas se efectuó la prueba de comparación de medias de Duncan.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La integridad del ADN extraído mediante los cuatro métodos fue corroborada mediante la electroforesis en geles de agarosa. Se obtuvo ADN genómico de una forma sencilla y de calidad (Figura 1).

El promedio de las concentraciones obtenidas de  las  dos  especies  de  orquídeas  fue  mayor por  el  método  de  Zambrano  et  al.  (2002) (Cuadro 1). Sin embargo, la mayor estabilidad y menor degradación en el tiempo correspondió a los ADN obtenidos por los protocolos de Risterucci et al. (2000) modificado y Promega (1998), mientras que hubo poca estabilidad de los ADN extraídos según Zambrano et al. (2002)  y  Dellaporta  et  al.  (1983)  modificado, en  los  que  se  observó  una  importante degradación (Figura 2). Los métodos de extracción de Risterucci et al. (2000) modificado y Promega (1998) produjeron los valores más estables en cantidad y calidad del ADN, indicativos de baja contaminación de ARN, proteínas u otras sustancias (estabilidad promedio de 87,3 y 90,3 %, para cada método, respectivamente), así como un buen índice de pureza dado que la mayoría de los valores de la relación A₂₆₀/A₂₈₀nm estuvo en el rango 1,8-2,0. Los métodos de Zambrano et al. (2002) y Dellaporta (1983) modificado mostraron baja estabilidad (promedios de 41,1 y 56,5 %, respectivamente) y valores de A₂₆₀/A₂₈₀nm menores a 1,8 (Cuadros 1 y 2).

Cuadro 1. Cuantificación, calidad y estabilidad del ADN de las dos especies de Cattleya (± SD); n=2

Cuadro 2.  Estabilidad y absorbancia de la concentración del ADN luego de una semana de obtención mediante cuatro métodos de extracción en orquídeas (Cattleya spp.)

Medias seguidas de letras distintas son estadísticamente  diferentes según la prueba de Duncan  (P≤0,05)

El método de Dellaporta et al. (1983) fue el procedimiento de extracción que requirió mayor cantidad de muestra y mayor tiempo para su ejecución (más de un día). Las otras metodologías necesitaron sólo 3-4 h para obtener los resultados (Cuadro 3).

Cuadro 3. Cantidad de muestra utilizada y tiempo de duración de los cuatro métodos de extracción

Al  utilizar  el  ADN  genómico  obtenido,  para su amplificación en la prueba de validación vía  PCR-RAPD,  sólo  se  observó  amplificación de ambos cebadores con ADN extraído por Risterucci et al. (2000) modificado y Promega (1998)  (Figura  3).  Usando  el ADN  extraído  por el método de Zambrano et al. (2002), sólo se logró la amplificación para el ADN de Cattleya violacea.

El ADN de Cattleya mossiae obtenido por el método Dellaporta et al. (1983) modificado no se amplificó con el cebador OPC-05, posiblemente debido a baja estabilidad y degradación a través del tiempo.

Por  su  parte,  en  la  prueba  de  validación  vía PCR-ISTR, se observó la amplificación en  todas las  combinaciones  de  marcadores (Figura 4). El protocolo de Risterucci et al. (2000) modificado presentó mejor definición en las bandas  obtenidas  si  se  compara  con  las  otras tres metodologías   propuestas,   posiblemente  por su  alta  estabilidad  (87,3 %)  y  calidad  (A₂₆₀/A₂₈₀ =1,835).

La metodología y las modificaciones al protocolo de Risterucci et al. (2000) propuestas en este estudio, confirman la obtención de un ADN de calidad a partir de hojas de Cattleya spp., libre de contaminantes, estable en el tiempo y sin sobreestimación en su cuantificación, a través de un procedimiento sencillo.

CONCLUSIONES

Se logró adaptar un protocolo simple, reproducible, rápido y económico a partir del método básico propuesto por Risterucci et al. (2000) con las modificaciones aquí señaladas, con el cual se aisla ADN de calidad y estable a partir de hojas de Cattleya spp. a utilizar con marcadores moleculares como RAPD e ISTR.

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