Luis Angulo-Graterol¹, Iris Pérez-Almeida², Gustavo Osorio², Catalina Ramis¹, Ángela Bedoya¹, Sandy Molina³ y Diógenes Infante³

¹ Centro de Investigaciones de Biotecnología Agrícola (CIBA), Facultad de Agronomía, Universidad Central de Venezuela. Maracay. Venezuela.

² Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA)-CENIAP. Apdo. 4653. Maracay. Venezuela

³ Centro Nacional de Biotecnología Agrícola, Fundación Instituto de Estudios Avanzados. Caracas. Venezuela. e-mail: iperez@inia.gob.ve; ibperez1@gmail.com

RESUMEN

Se estudió la diversidad genética mediante el uso de marcadores RAPD e ISTR en nueve especies de Cattleya spp. colectadas en Venezuela. De los 49 iniciadores RAPD probados inicialmente, sólo 19 mostraron mayor resolución y número de fragmentos polimórficos discriminativos en geles de agarosa. Se generaron 255 fragmentos, de los cuales 158 fueron polimórficos. Para los ISTR utilizados, se logró información para cuatro de las cinco combinaciones empleadas en este estudio y se generaron 101 fragmentos, de los cuales 42 fueron polimórficos. Mediante el análisis de agrupamiento UPGMA distancia Jaccard de los RAPD se formaron cuatro grupos discriminantes, el primero constituido por C. lueddemanniana y C. lawrenceana; el segundo por C. percivaliana, el tercero por C. mendelii, C. violacea, C. trianae y C. mossiae; y el último por C. jenmanii y C. gaskelliana. Para los ISTR se formaron tres grupos, el primero constituido por C. mendelii, C. trianae y C. lawrenceana; el segundo por C. lueddemanniana, C. jenmanii y C. percivaliana y el último por C. mossiae, C. gaskelliana y  C. violacea. El análisis molecular de las nueve especies de Cattleya reflejó una alta diversidad interespecífica basada en la presencia de patrones de fragmentos de ADN discriminativos obtenidos mediante ambos tipos de marcadores y produjo agrupamientos basados en la coloración de las flores y el hábitat de las plantas. Los patrones electroforéticos RAPD fueron más informativos al generar mayor número de bandas polimórficas que los basados en las combinaciones de ISTR.

Palabras clave adicionales: Orquídeas, marcadores moleculares, UPGMA

Evaluation of genetic diversity in nine species of Cattleya using RAPD and ISTR molecular markers

ABSTRACT

Additional key words: Orchids, molecular markers, UPGMA

Recibido: Julio 19, 2012  Aceptado: Febrero 11, 2013

Introducción

Las orquídeas han alcanzado una diversidad que supera las 29.000 especies (Chase et al., 2003), por lo que han sido catalogadas como la familia de Magnoliophyta más diversa y una de las más cosmopolitas en el mundo. En Venezuela, la familia está representada por unas 1.612 especies, la mayoría de ellas ubicadas en la Cordillera Andina y Guayana (Leopardi y Cumana, 2009).

Del género Cattleya han sido colectadas en el país siete especies en forma silvestre: C. gaskelliana, C jenmanii, C. lawrenceana, C. lueddemanniana, C. mossiae, C. percivaliana y C. violacea, entre las cuales el color más común es el morado (Aulissi y Foldast, 1989).

El alto nivel de especiación que presentan las orquídeas debido a su alta hibridización, trae como consecuencia una gran variabilidad genética en esta familia, por lo que es necesario el estudio genético de las poblaciones con la finalidad de conocer las relaciones y evolución entre especies para poder establecer futuros programas de conservación. Generalmente se han empleado descriptores morfológicos para la identificación y clasificación de las especies de Cattleya (Leopardi et al., 2009).

Existen varias técnicas que permiten realizar  estudios evolutivos y de genética poblacional, identificación, mapeo y selección asistida por marcadores moleculares. Entre ellos se encuentran polimorfismos de ADN amplificados al azar o RAPD, los cuales amplifican aleatoriamente segmentos de ADN en una gran variedad de especies (Williams et al., 1990; Welsh y McClelland, 1990). Los RAPD son útiles en la elaboración de mapas genéticos, en el estudio de parentesco y en el análisis de la estructura poblacional, por lo que han sido utilizados en diversos estudios genéticos.

Otra técnica muy útil es la de los marcadores moleculares tipo repeticiones de secuencias etiquetadas inversas o ISTR (Rohde, 1996), las cuales son empleadas en estudios y detección de variabilidad genética entre individuos y las relaciones existentes entre ellos (Osorio et al., 2006).

El objetivo de este trabajo fue caracterizar molecularmente las siete especies silvestres de Cattleya ya mencionadas, así como dos especies de origen colombiano (C. mendelii y C. trianae),  utilizando marcadores moleculares RAPD e ISTR.

Las nueve especies de Cattleya fueron colectadas en un vivero semicomercial de San Cristóbal, estado Táchira, y transportadas a bajas temperaturas hasta el laboratorio. Las características de cada especie se presentan en el Cuadro 1.

Cuadro 1. Algunas características de las especies de orquídeas utilizadas en el ensayo

El aislamiento del ADN se realizó a partir de 0,5 g de los tejidos foliares colectados en plantas individuales representando cada genotipo, el cual fue macerado con nitrógeno líquido, siguiendo el método de extracción de Pérez-Almeida et al. (2011).

Técnica RAPD. La mezcla de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) consistió en tampón 1X, 2,5 mM MgCl₂, 0,17 mM por dNTP, 0,67 mg·mL^-1 BSA (suero de albúmina bovina), 1,33 uM del iniciador, 0,16 U·μL^-1 Taq polimerasa y  20 ng·μL^-1  de  ADN,  en  un  volumen  final  de 15 μL. La amplificación se realizó en un termociclador PTC 200 (Bio-Rad), en las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94 ºC por 5 min, seguida por 45 ciclos de amplificación  a  94 ºC por  1 min,  hibridación  a 36 ºC por 30 s y extensión 72 ºC por 2 min, seguida por un ciclo final de extensión a 72 ºC por 7 min. La separación de los productos de RAPD-PCR se realizó en geles de agarosa 2 %, corridos durante 2 h y media a 80 V y teñidos con bromuro de etidio 0,00002 %. Los geles fueron visualizados en el transiluminador UV y fotografiados con un analizador de imágenes Gel Doc (Bio-Rad).

Se utilizaron 49 iniciadores RAPD correspondientes a las series decaméricas OPA, OPC, OPB, OPF y OPM de OPERON Technologies, así como la serie UBC.

Técnica ISTR. Las amplificaciones con ISTR estuvieron constituidas por tampón 1X, 3 mM MgCl₂, 0,17 mM de cada dNTP, 0,33 uM iniciador ISTRF y 0,33 uM iniciador ISTRB, 1 U·μL^-1 Taq polimerasa y 20 ng·μL^-1 del ADN en un volumen final de 15 μL de reacción PCR. Se utilizaron cinco combinaciones de los iniciadores (F1-B8, F1-B10, F4-B6, F4-B10 y F9-B10) en un termociclador 2700 (Applied Biosystems). Las condiciones existentes para la amplificación fueron de desnaturalización inicial a 95 ºC por 3 min, seguida de 40 ciclos de amplificación a 95 ºC por 30 s, 45 ºC por 1 min y 72 ºC durante 2 min; ciclo final de extensión a 72 ºC por 10 min. La separación de los productos amplificados ISTR-PCR se realizó en un gel de poliacrilamida al 6 % y se visualizó en un analizador de imágenes Typhoon 9410.

Análisis de resultados. Para la evaluación de las amplificaciones de ADN de cada uno de los materiales obtenidos en los geles de agarosa y el gel de poliacrilamida se generó una matriz de presencia y ausencia por cada banda detectada en los genotipos estudiados, para cada marcador RAPD e ISTR utilizado. La matriz obtenida con los marcadores polimórficos fue analizada con el programa estadístico InfoStat versión 1.1. Se realizó un análisis multivariado de conglomerados jerárquicos con la matriz y se generó un árbol de clasificación jerárquica ascendente, utilizando el análisis de agrupamiento UPGMA y la distancia de Jaccard. La matriz fue utilizada para el cálculo del índice de similaridad de Jaccard, determinar el porcentaje de polimorfismo y realizar el análisis de agrupamiento (dendrograma), a través del análisis multivariado y del método de agrupamiento jerárquico usando el método de la distancia promedio no ponderada UPGMA.

Resultados y Discusión

El  análisis  de  los  datos  permitió  encontrar que de los 49 iniciadores RAPD, sólo 19 presentaron polimorfismo (Cuadro 2). Con la información  obtenida  de  los  patrones  de  bandas en los geles se determinó el porcentaje de polimorfismo  para  cada  marcador  molecular.  Se generó un total de 255 bandas, de las cuales 158  resultaron  polimórficas,  con  un  promedio de 13,42 bandas por iniciador. Benner et al. (1995) obtuvieron 135 bandas en total y el 35 % de los productos RAPD fueron polimórficos para ocho especies de Cattleya de Centro y Sur América utilizando diez cebadores RAPD. En el presente estudio el 61,96 % de las bandas fueron polimórficas  para  las  9  especies  estudiadas. Estas diferencias  pueden  atribuirse  al  distinto  número de cebadores empleados en ambas investigaciones.

Cuadro 2.  Cebadores utilizados en este estudio con sus respectivas secuencias y el número de bandas polimórficas generadas

Es importante destacar que varios de los cebadores que presentaron polimorfismo fueron muy informativos, principalmente OPA 09, OPA 18, OPC 12, OPF 04, OPF 13 y UBC 155, dada su capacidad de diferenciar entre las nueve especies de Cattleya ya que generaron 6, 8, 9, 15, 12 y 11 bandas polimórficas, respectivamente, y entre ellos se destacó el cebador OPA 09 con 100 % de Es importante destacar que varios de los cebadores que presentaron polimorfismo fueron muy informativos, principalmente OPA 09, OPA 18, OPC 12, OPF 04, OPF 13 y UBC 155, dada su capacidad de diferenciar entre las nueve especies de Cattleya ya que generaron 6, 8, 9, 15, 12 y 11 bandas polimórficas, respectivamente, y entre ellos se destacó el cebador OPA 09 con 100 % de bandas polimórficas. El UBC 155 también fue reportado como un cebador polimórfico por De Campos (2004), quien señaló que de las 12 bandas observadas en el gel de agarosa, nueve mostraron diferencias entre las 11 variedades de orquídeas analizadas.

En el análisis UPGMA con distancia de Jaccard se encontró la formación de cuatro grupos discriminantes (Figura 1) y una correlación cofenética de 0,913 para este estudio interespecífico. El primer grupo estuvo constituido por C. lueddemanniana y C. lawrenceana, grupo de Cattleya que presenta flores de color rosa o violeta uniformes y desde blancas hasta lila muy oscuro; el segundo por C. percivaliana, una orquídea venezolana de flores de color único característico en el género, cuyo hábitat comprende alturas entre 1200 y 2000 msnm; el tercero por C. mendelii, C. violacea, C. trianae y C. mossiae, con flores tamaños medianos a grandes y cuyos hábitats comprenden de 700 a 1500 msnm; dos de las especies de este grupo son de origen colombiano. El último grupo está constituido por C. jenmanii, y C. gaskelliana, cuyas zonas geográficas son limítrofes con Brasil y Guyana. Los coeficientes de similitud de los grupos fueron 0,89; 0,98; 0,86 y 0,89, respectivamente, para cada una de las cuatro agrupaciones.

En este estudio de variabilidad interespecífica las especies fueron agrupadas por el espectro de los colores producidos por sus flores y hojas, y en otros  casos  por  su  distribución  y  variaciones entre los distintos hábitats naturales de crecimiento. En el caso particular C. percivaliana, planta de origen venezolano, de flores de color característico y hábitat de bosques húmedos premontano y montano, se ubicó sola en el segundo grupo en el análisis de agrupamiento. Así mismo, las dos especies colombianas (C. mendelii y C. trianae) se concentraron en el tercer grupo, posiblemente por presentar sépalos y pétalos blancos con labios de lila a púrpura, y por su ubicación geográfica.

Estos resultados comprueban la efectividad y utilidad de los marcadores RAPD en estudios de diversidad genética para evaluar la variabilidad interespecífica del género Cattleya, considerando un ejemplar para cada una de las especies utilizadas. Al emplear dos o más ejemplares por especie y realizar un estudio intraespecífico es posible que las relaciones genéticas detectadas no sean muy diferentes, de acuerdo con los resultados de Do Rego et al. (2009), quienes estudiaron la variabilidad intraespecífica de Cattleya violacea en regiones de la Amazonia y detectaron diez grupos diferentes, cada grupo conformado por variedades relacionadas también con los sitios de colecta y colores producidos por sus flores.

Lim et al. (1999), utilizando marcadores moleculares RAPD, demostraron la baja similitud genética entre algunas especies del género Vanda (Orchidaceae) y lograron separar en géneros diferentes a las plantas con hojas planas u hojas cilíndricas. En función de sus resultados los autores recomendaron la utilización del RAPD como una herramienta para clasificar especies de la familia Orchidaceae.

La metodología de los marcadores ISTR permitió observar diferencias entre las nueve especies evaluadas en este estudio por los patrones de bandas generados. Cuatro de las cinco combinaciones de los iniciadores ISTR fueron polimórficas (Cuadro 3). La combinación F9-B10, no mostró mayor información polimórfica ni diferencias entre las especies. Las combinaciones de iniciadores generaron 101 bandas en total, 42 de éstas fueron polimórficas, para un promedio de 25,25 bandas por combinación ISTR y 41,58 % de productos polimórficos. La mejor combinación fue F4-B10 que presentó 47,37 % de información polimórfica.

Cuadro 3. Secuencia de las combinaciones de los iniciadores ISTR, número y porcentaje de bandas polimórficas generadas

Los resultados sugieren la existencia de variabilidad genética entre las especies de Cattleya dados los patrones generados para las combinaciones de los ISTR, lo cual resalta su utilidad para este estudio. Estas evidencias comprueban su efectividad en estudios de diversidad, como ha sido reportado en clones de Agave cocui y A. tequilana (Osorio et al., 2006; Torres-Morán et al., 2005).

Al emplear un mayor número de cebadores RAPD que de combinaciones ISTR se logró obtener un número superior de patrones electroforéticos de información polimórfica para RAPD, al compararse con las combinaciones ISTR (61,96 y 41,58 %, respectivamente). Las combinaciones ISTR detectaron diversidad genética en las nueve especies de Cattleya, pero los cebadores RAPD presentaron mayor información discriminativa entre las especies y lograron separar a la especie C. percivaliana de las otras, posiblemente por poseer un hábitat con altitud superior a 1200 msnm en los estados andinos, principalmente en el estado Trujillo.

El dendrograma obtenido para los RAPD indicó la presencia de cuatro grupos genéticos, mientras que el de ISTR sólo tres grupos; la coincidencia entre ambos análisis de agrupamiento se observó para las especies según su zona geográfica de origen y coloración de las flores desde blanco al lila pálido; por ejemplo, en ambos dendrogramas las especies C. mendelii y C. trianae, de origen colombiano se ubicaron en un mismo grupo. También hubo coincidencia entre los dendrogramas en la agrupación de las especies por el hábitat entre C. mossiae y C. violacea, posiblemente por ser especies principalmente de Venezuela, ubicadas en zonas geográficas superiores a 800 msnm y de clima húmedo; mientras que para las otras cinco especies, no hubo coincidencia entre los grupos generados para las dos técnicas moleculares.

CONCLUSIONes 

La aplicabilidad de marcadores moleculares del tipo RAPD e ISTR representa una herramienta confiable en la determinación de la diversidad genética para el género Cattleya y el estudio de las  relaciones existentes entre sus especies para la coloración de los sépalos y pétalos, así como a su ubicación geográfica y hábitat de crecimiento. Los patrones RAPD fueron más informativos para la caracterización  molecular de  especies  dentro  del  género  al  producir  mayor número de bandas polimórficas que los basados en las combinaciones de ISTR. En la agrupación de las especies de origen colombiano ambos marcadores moleculares permitieron diferenciarlas con respecto a las de origen venezolano.

Estos estudios pueden servir de base para el futuro establecimiento de estrategias eficientes para la caracterización de las especies del género Cattleya y el desarrollo de un sistema de marcadores para analizar su estructura y diversidad genética.

LITERATURA CITADA

1. Aulissi, C. y E. Foldast. 1989.  Monografía de las Cattleyas de Venezuela y sus variedades. Ed. Torino. Caracas. 330 p.        [ Links ]

2. Benner, M., M. Braunstein y M. Weisberg. 1995. Detection of DNA polymorphism within the genus Cattleya (Orchidaceae). Plant Molecular Biology Rep. 13: 147-155.         [ Links ]

3. Chase, M., J. Freudenstein, K. Cameron y R. Barrett. 2003. DNA data and Orchidaceae systematics: a new phylogenetic classification. In: K. Dixon, S. Kell, R. Barrett y P. Cribb (eds.). Orchid Conservation. Natural History Publications. Kota Kinabalu, Malasia. pp. 69-89.         [ Links ]

4. De Campos, B. 2004. Estudo da variabilidade genética em Cattleya violacea (H.B.K.) Rolfe (Orchidaceae) por meio de marcadores moleculares RAPD no estado de Roraima, Brasil. Monografía Universidad Federal de Roraima (UFRR). 41 p.        [ Links ]

5. Do Rego, E., M. Do Rego y B. De Campos. 2009. Genetic variability in Cattleya violacea (Orchidaceae) in the Amazonian region. Acta Horticulturae 813: 413-420.        [ Links ]

6. Leopardi, C. y L. Cumana. 2009. Nuevos reportes de la familia Orchidaceae para la región nororiental de Venezuela, con énfasis en el estado Sucre. Ernstia 19: 81-95.         [ Links ]

7. Leopardi, C., J. Véliz y L. Cumana. 2009. Orquideoflórula preliminar de la Península de Araya y áreas adyacentes, Estado Sucre, Venezuela. Acta Bot. Venez. 32: 159-177.          [ Links ]

8. Lim, S., P. Peng, L. Hwa y C. Jin. 1999.  RAPD analysis of some species in the genus Vanda (Orchidaceae). Annals of Botany. 83: 193-196.        [ Links ]

9. Osorio, M., D. Infante y S. Molina. 2006. Estudio de la variabilidad genética asexual en Agave cocui Trelease mediante el uso de marcadores moleculares. Bol. Nakari. 17: 1-7.        [ Links ]

10. Pérez-Almeida, I., L. Angulo-Graterol, G. Osorio, C. Ramis, A. Bedoya, R. Figueroa-Ruiz, S. Molina y D. Infante. 2011. Método modificado de obtención de ADN genómico en orquídeas (Cattleya spp.) para amplificación con marcadores moleculares. Bioagro 23: 27-34.        [ Links ]

11. Rohde, W. 1996. Inverse sequence-tagged repeat (ISTR) analysis, a novel and universal PCR-based technique for genome analysis in the plant and animal kingdom. J. Genet. Breed. 50: 249-261.        [ Links ]

12. Torres-Morán, M., D. Infante, J. Sánchez-González, A. Morales-Rivera y A. Santerre. 2005. Diversidad genética en Agave tequilana Weber variedad Azul, proveniente de micropropagación.  Bol. Nakari 16: 3- 7.        [ Links ]

13. Welsh, J. y M. McClelland. 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Research 18: 7213-7218.        [ Links ]

14. Williams, J., A. Kubelik, K. Livak, J. Rafalski y S. Tingey. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research 18: 6531-6535.        [ Links ] ]]> 1 1989 330 2 1995 13 147-155 3 2003 69-89 4 2004 41 5 2009 813 413-420 6 2009 19 81-95 7 2009 32 159-177 8 1999 83 193-196 9 2006 17 1-7 10 2011 23 27-34 11 1996 50 249-261 12 2005 16 3- 7 13 1990 18 7213-7218 14 1990 18 6531-6535