Los hongos fitopatógenos ocasionan relevantes pérdidas de los cultivos agrícolas, tanto en fase de campo como en poscosecha. Se evaluó el uso de aceites esenciales extraídos de plantas amazónicas, en diferentes concentraciones, para el control in vitro de estos hongos. Los aceites esenciales se obtuvieron por destilación en arrastre de vapor a partir de dos especies vegetales (Ocotea quixos y Piper aduncum) colectadas en la provincia amazónica de Pastaza, Ecuador. La actividad antifúngica se evaluó mediante el método de la difusión en agar sobre los hongos fitopatógenos Aspergillus oryzae, Cladosporium cladosporioides, Fusarium solani, Rhyzopus stolonifer, Moniliophthora roreri y Phytophthora sp. El aceite esencial de O. quixos usado en su máxima concentración (500 µL·mL-1) inhibió el crecimiento de todas las cepas alcanzando 94 % de inhibición promedio y registrando un comportamiento similar al aceite esencial de tomillo(Thymus vulgaris), el cual fue utilizado como patrón de comparación. El aceite esencial de P. aduncum, también en su máxima concentración mostró los mayores porcentajes de inhibición frente a F. solani (94 %) y Phytophthora sp. (91 %). Los resultados sugieren el empleo de estos aceites esenciales como agentes de control biológico de hongos fitopatógenos.
The phytopathogenic fungi cause relevant crop losses, both under field and post-harvest conditions. The use of essential oils extracted from Amazonian plants, at different concentrations, was investigated, in order to evaluate in vitro properties against those fungi. Essential oils were obtained by steam distillation, from two plant species (Ocotea quixos and Piper aduncum) collected in the Amazonian province of Pastaza, Ecuador. The antifungal activity was evaluated through the agar diffusion method against the Aspergillus oryzae, Cladosporium cladosporioides, Fusarium solani, Rhyzopus stolonifer, Moniliophthora roreri and Phytophthora sp. The O. quixos essential oil, in its maximum concentration (500 µL·mL-1), inhibited the growth of all strains, reaching an average of 94 % inhibition rate, similar to the essential oil of thyme (Thymus vulgaris), which was used as standard. The P. aduncum essential oil, also in the maximum concentration, showed the best inhibition percentage against F. solani (94 %) and Phytophthora sp. (91 %). These results suggest the use of both essential oils as agents of biological control of phytopathogenic fungi.
La producción agrícola mundial se ve afectada por la proliferación de diferentes fitopatógenos, entre los cuales los hongos representan una extensa parte. El control de los agentes patógenos se hace cada vez más difícil debido especialmente al desarrollo de resistencia hacia los principios activos utilizados (Lucas et al., 2015). Frente a dicha situación, la investigación científica está orientada a la búsqueda de compuestos activos más efectivos contra los patógenos y a la vez más amigables con el medio ambiente, el ser humano y la entomofauna útil. Los aceites esenciales son considerados una alternativa prometedora para controlar el efecto de los agentes patógenos, incluyendo a los hongos (Başer y Buchbauer, 2010a; Sánchez, 2015). Dichas sustancias son compuestos volátiles de origen vegetal y la mayoría de ellos tienen propiedades antimicrobianas (Başer y Buchbauer, 2010b). Por esta razón son utilizados en el ámbito agrícola como materia prima para la fabricación de agroquímicos (Başer y Buchbauer, 2010a), con la ventaja de tener una mayor biodegradabilidad comparado con los productos de síntesis (Cheng et al., 2009).
Dentro de los aceites esenciales existe una amplia diversidad de rendimiento y composición química. Los factores que mayormente influyen en la composición y concentración de los constituyentes son (i) las condiciones climáticas como la duración del día, la irradiación solar, la temperatura y el abastecimiento de agua, (ii) el lugar de crecimiento de la planta y la época de cosecha, así como (iii) los factores intrínsecos a la planta como la edad y el estado de desarrollo. La composición del aceite esencial también varía de acuerdo al órgano o parte de la planta del cual se extraiga (Başer y Buchbauer, 2010c).
La presente investigación se ha centrado en el estudio de derivados de plantas amazónicas. La cuenca del Amazonas se caracteriza por una elevada diversidad dentro y entre especies, las cuales han co-evolucionado con los factores bióticos y abióticos del entorno, diversificando sus perfiles metabólicos y por ende los metabolitos secundarios. Dicha condición amplía las posibilidades de estudios fitoquímicos (Wang y Qin, 2007). Ocotea quixos (Lam.) Kosterm. y Piper aduncum L. son especies amazónicas cuyos aceites esenciales han mostrado interesantes actividades antifúngicas (Bruni et al., 2004; Guerrini et al., 2009).
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O. quixos (Lauraceae) es un árbol nativo de la Amazonía Ecuatoriana, denominado vulgarmente canela y/o ishpingo, y es conocido por sus propiedades aromáticas desde la época de los Incas (Kricher, 1997). La especia obtenida de los cálices es ampliamente utilizadas por los nativos como saborizante de alimentos y, recientemente, su empleo se ha extendido gracias a su aroma similar al de la canela (Bruni et al., 2004). P. aduncum (Piperaceae) es un árbol que alcanza los 5 m de alto, nativo del Caribe, ampliamente empleado como antimicrobiano, insecticida y molusquicida (Guerrini et al., 2009).
El objetivo de la presente investigación fue estudiar la composición química y la propiedad antifúngica in vitro de los aceites esenciales de O. quixos y P. aduncum. El ensayo de bioactividad fue realizado frente a seis hongos fitopatógenos, agentes causales de enfermedades muy difundidas en los cultivos agrícolas.
Materiales y métodos
Especies vegetales. Plantas de O. quixos y P. aduncum fueron recolectadas en los predios de la Universidad Estatal Amazónica (UEA) en Puyo, provincia de Pastaza, Ecuador. Los especímenes fueron identificados por el Dr. David Neill y depositados en el Herbario ECUAMZ de la UEA en Ecuador.
Hongos fitopatógenos. Las cepas de hongos utilizadas para evaluar la actividad biológica fueron Aspergillus oryzae (ATCC 10124), Cladosporium cladosporioides (ATCC 16022), Fusarium solani (ATCC 36031), Rhyzopus stolonifer (ATCC 6227), Moniliophthora roreri y Phytophthora sp. Las dos últimas fueron aisladas en los laboratorios de la UEA a partir de mazorcas de cacao enfermas, procedentes de cultivos de la provincia de Pastaza, de acuerdo al protocolo de Ochoa et al. (2007). La identificación se realizó mediante la observación al microscopio de las estructuras morfológicas de los hongos y con la ayuda de la clave dicotómica de APS Press (Barnett y Hunter, 1998).
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Extracción de aceites esenciales. Los aceites esenciales se obtuvieron, a partir de hojas frescas, mediante destilación por arrastre de vapor, durante dos horas, utilizando un aparato Clevenger. El rendimiento en aceite esencial se calculó en base fresca y se obtuvo promediando los valores de tres diferentes destilaciones. El aceite esencial obtenido fue deshidratado con sulfato de sodio anhidro y conservado a 4 °C en contenedores oscuros sellados.
Análisis GC y GC/MS. Los aceites esenciales fueron caracterizados químicamente por cromatografía de gases acoplada a la masa (GC-MS). Para el análisis se utilizó un gascromatógrafo ThermoQuest equipado con detector FID y columna Varian FactorFour VF-5ms poli-5 % fenil-95 % dimetilsiloxano (diámetro interno 0,25 mm; largo 30 m y espesor 0,15 μm). El análisis GC/MS se realizó a las siguientes condiciones de operación: temperatura inyector 300 °C, temperatura FID 300 °C, velocidad de flujo del carrier (helio) 1 mL por minuto y la proporción de 1:50. Después de haber introducido 1 µL de una solución previamente preparada disolviendo 1 µL de aceite en 1 mL de cloruro de metileno en el inyector del gascromatógrafo, el análisis fue realizado llevando la temperatura desde los 55°C iniciales a los 100 °C a una velocidad de 1 °C por minuto, y de 100 °C a 250 °C a una velocidad de 5 °C por minuto, manteniendo luego dicha temperatura durante 15 minutos. La duración total del análisis fue de 90 minutos.
La composición de los aceites esenciales en porcentaje se elaboró a través del método de la normalización de las áreas de los picos GC, sin utilizar factores de corrección. La caracterización química de los compuestos de los aceites fue realizada por comparación computarizada de los espectros de masa de cada compuesto con la base de datos del National Institute of Standards and Technology (NIST).
Actividad antifúngica. Las cepas puras del American Type Culture Collection (ATCC) (A. oryzae, C. cladosporioides, F. solani y R. stolonifer) fueron activadas de acuerdo al protocolo establecido por la misma ATCC. Posteriormente, a la fase de activación, se procedió a la conservación de los hongos, en 1 mL de solución de glicerol al 50 %, en ultracongelador a -86 °C. La actividad antifúngica in vitro se realizó por el método de la difusión en agar. Se evaluaron cinco diferentes concentraciones de cada aceite esencial, previamente solubilizado en DMSO (dimetil-sulfóxido): 10, 50, 100, 200 y 500 µL·mL-1 (Sacchetti et al., 2005). El inóculo, constituido por una porción cilíndrica de medio papa-dextrosa-agar (PDA) con micelio, después de solidificado, fue colocado en el centro del agar. Como control positivo se utilizó el aceite esencial de Thymus vulgaris, seleccionado por su comprobada efectividad antifúngica (de Lira et al., 2012), y como control negativo el medio de cultivo PDA. Los hongos se incubaron a 27 °C por diez días. La actividad antifúngica se midió en términos de inhibición del crecimiento de las colonias, de acuerdo a la fórmula:
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Análisis estadístico. Cada tratamiento fue realizado por triplicado. El efecto de las diferentes concentraciones de cada extracto sobre el diámetro de la colonia y la inhibición del crecimiento de cada cepa de hongo fueron estudiados mediante análisis de la varianza y prueba de medias de Tukey utilizando el programa Statistix 8.0.
Resultados y discusión
Composición química de los aceites esenciales. La composición química de los aceites esenciales está detallada en la Cuadro 1. La extracción del aceite esencial de O. quixos produjo un rendimiento de 0,16 %, lo cual coincidió con el obtenido por Sacchetti et al. (2006), aunque resultó inferior al valor registrado (0,3 %) por Noriega y Dacarro (2008); ambas investigaciones se realizaron con hojas procedentes de Macas, provincia amazónica ecuatoriana con similares características edafoclimáticas a las de Puyo, Ecuador. El aceite esencial fue caracterizado en un 97,38 % y se determinaron 50 diferentes compuestos químicos. Entre los componentes más abundantes se registraron el trans-cinamaldehido (16,62 %), el trans-metilisoeugenol (11,94 %), el β-cariofileno (10,59 %) y el α-pineno (9,39 %).
La predominancia de trans-cinamaldehido confirió al aceite esencial el típico aroma a canela, a diferencia del de Sacchetti et al. (2006), en el cual la abundancia de β-cariofileno (15,1 %) y sabineno (7,6 %) dieron un aroma acre a madera. Los estudios de Sacchetti et al. (2006) y de Noriega y Dacarro (2008) mostraron que el β-cariofileno fue uno de los componentes comunes a los aceites destilados; las concentraciones evidenciadas fueron respectivamente de 15,1 % y 19 %. Debido a su aroma similar al de canela, el aceite esencial de hojas de O. quixos tiene propiedades promisorias para la industria alimenticia de las esencias.
El aceite esencial de P. aduncum alcanzó un rendimiento del 0,12 %, lo cual resultó inferior al valor de 0,8 % obtenido por Guerrini et al. (2009) con muestras recolectadas en la comunidad Achuar de Wasakentsa (Ecuador). Así mismo, el rendimiento se evidenció inferior al reportado por Cicció y Ballestero (1997), con material procedente de Costa Rica (0,4 %). Dicho aceite esencial se ha caracterizado en un 95,66 % y se han identificado 45 diferentes compuestos químicos. Los más abundantes fueron dilapiol (45,92 %), trans-E-ocimeno (10,39 %) y piperitone (8,47 %). La especie P. aduncum es conocida por contar con diferentes grados de polimorfismo químico, reconociéndose un perfil de Bolivia rico en 1,8-cineol (40 %), uno de Panamá con elevada concentración en sesquiterpenos como el β-cariofileno y otro perfil característico de las Américas, del Sur-Oeste de Asia y de Oceanía rico en dilapiol (30-90%) (Guerrini et al., 2009). El aceite esencial de la presente investigación es abundante en dilapiol, confirmando su correspondencia con el perfil de América.
Cuadro 1. Composición química de los aceites esenciales de Ocotea quixos y Piper aduncum
*RT = Tiempo de Retención: tiempo característico que necesita cada compuesto de la mezcla química para pasar a través del sistema, bajo las condiciones establecidas
Actividad antifúngica. El análisis estadístico del crecimiento radial de las colonias fúngicas y del porcentaje de inhibición mostró que existieron diferencias significativas entre los tratamientos (Cuadros 2 y 3). En las comparaciones realizadas se observa que los aceites esenciales de O. quixos y P. aduncum tienen un efecto inhibitorio que depende de la dosis empleada.
Cuadro 2. Diámetros de crecimiento (mm) del conjunto de las colonias fúngicas bajo diferentes concentraciones de aceites esenciales
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Tratamientos (µL·mL-1)
O. quixos
P. aduncum
T. vulgaris (patrón)
10
74,28 a
81,78 a
70,11 a
50
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73,39 a
67,06 ab
43,83 b
100
68,89 a
56,83 bc
5,61 c
200
37,22 b
41,83 c
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8,44 c
500
5,94 c
22,06 d
2,06 c
Valores medios con la misma letra son estadísticamente iguales según la prueba de Tukey (P≤0,05)
Las concentraciones de 200 y 500 µL·mL-1 representaron el grupo mayormente efectivo en el control in vitro del crecimiento fúngico para ambos aceites, y el conjunto de hongos fitopatógenos mostraron un crecimiento parecido entre sí a 10 y 50 µL·mL-1. La concentración de 100 µL·mL-1de los aceites esenciales de O. quixos y P. aduncum evidenció valores intermedios entre las demás concentraciones, pero no en el caso del patrón el cual, a esta concentración, mantuvo muy alta su efectividad.
Cuadro 3. Inhibición del crecimiento (%) del conjunto de las colonias fúngicas bajo diferentes concentraciones de aceites esenciales
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Tratamientos (µL·mL-1)
O. quixos
P. aduncum
T. vulgaris (patrón)
10
8,00 c
3,67 d
17,91 c
50
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13,50 c
21,00 cd
48,06 b
100
18,83 c
33,17 bc
94,17 a
200
56,17 b
50,67 b
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91,72 a
500
93,83 a
74,00 a
98,67 a
Valores medios con la misma letra son estadísticamente iguales según la prueba de Tukey (P≤0,05)
Como se observa en la Figura 1, el aceite esencial de O. quixos, a la concentración de 500 µL·mL-1, inhibió el crecimiento de todas las cepas fitopatógenas, alcanzando porcentajes del 89 % (C. cladosporioides), del 94 % (M. roreri) y del 95 % (A. oryzae, F. solani, Phytophthora sp., R. stolonifer).
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Figura 1. Actividad antifúngica del aceite esencial de O. quixos a concentraciones de 10, 50, 100, 200 y 500 µL·mL-1, expresada en porcentaje de inhibición del crecimiento de los hongos. Prueba de medias entre las diferentes concentraciones (P≤0,05)
Resultados relevantes también se obtuvieron a la concentración 200 µL·mL-1, frente a A. oryzae (95 %), R. stolonifer (73 %) y Phytophthora sp. (72 %); las demás concentraciones mostraron efectos inhibitorios menores. Investigaciones previas (Bruni et al., 2004) confirmaron la propiedad antifúngica de O. quixos contra hongos dermato-fitos y fitopatógenos como T. mentagrophytes y P. ultimum, respectivamente, resultados que son imputables a la especificidad del trans-cinamaldehido hacia los hongos. En la presente investigación ha sido comprobado su efecto inhibitorio frente a diferentes hongos fitopatogenos como A. oryzae, C. cladosporioides, F. solani, M. roreri, Phytophthora sp. y R. stolonifer cuando se utiliza a concentración de 500 µL·mL-1.
El aceite esencial de P. aduncum a la concentración de 500 µL·mL-1 mostró los mejores porcentajes de inhibición frente a F. solani (94 %), seguido porPhytophthora sp. (91 %), R. stolonifer (82%) y C. cladosporioides (74 %) (Figura 2). El menor efecto fue registrado por A. oryzae (39 %). Estudios realizados sobre muestras procedentes de Ecuador y Brasil han mostrado una notable actividad antifúngica, respectivamente contra Magnaporthe grisea (Guerrini et al., 2009) y C. cladosporioides (Debonsi et al., 2006) avalando dicha propiedad también contra otras especies de hongos. Se destaca que los aceites de O. quixos y P. aduncum, especialmente el primero de ellos, mostraron un comportamiento muy similar al aceite esencial del patrón (Thymus vulgaris) (Figura 3) cuando fueron usados en sus máximas concentraciones.
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Figura 2. Actividad antifúngica del aceite esencial de P. aduncum a concentraciones de 10, 50, 100, 200 y 500 µL·mL-1, expresada en porcentaje de inhibición del crecimiento de los hongos. Prueba de medias entre las diferentes concentraciones (P≤0,05)
Figura 3. Actividad antifúngica del aceite esencial de T. vulgaris (patrón) a concentraciones de 10, 50, 100, 200 y 500 µL·mL-1, expresada en porcentaje de inhibición del crecimiento de los hongos. Prueba de medias entre las diferentes concentraciones (P≤0,05)
Conclusiones
El GC-MS permitió caracterizar químicamente a los aceites esenciales de hojas de O. quixos y P. aduncum procedentes de la Amazonía ecuatoriana y evaluar su efecto antifúngico in vitro, contra hongos fitopatógenos. Los resultados evidenciaron excelente propiedad antifúngica del aceite de O. quixos frente a A. oryzae, C. cladosporioides, F. solani, M. roreri, Phytophthora sp. y R. stolonifer.
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El aceite esencial de P. aduncum mostró una interesante actividad inhibitoria especialmente frente a F. solani y Phytophthora sp. Estos resultados evidencian a las dos especies, O. quixos y P. aduncum, como plantas promisorias para el control biológico de hongos fitopatógenos. La presente investigación sienta las bases para posteriores estudios de actividad antifúngica in vivo.
Agradecimiento
A la Universidad Estatal Amazónica (Ecuador) y la Universidad de Ferrara (Italia).
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